УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

24 октября 2003 г.

Дата введения: 1 декабря 2003 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма Penicillium
canescens F- 832 ВКПМ продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Методические указания
МУК 4.2.1774-03

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens F-832 ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Характеристика штамма-продуцента ксиланазы

Микроорганизм Penicillium canescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Культура образует цепочки спор обычно прямые с гладкой оболочкой. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. На сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре 30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, диаметром 2- 3 мм. На 4-5 сутки инкубации размеры колонии достигают 5- 7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колоний оранжево-коричневая.

Штамм устойчив практически ко всем широко известным антибиотикам.

ПДК штамма в атмосферном воздухе 200 кл/м³, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3 000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результат продукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818(щелевой прибор Кротова)	ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением ×10	ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100мм
Пробирки биологические, вместимостью20 и 35 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75 ГОСТ 10515-75 ГОСТ 1770-74
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74
Секундомер	ГОСТ 9586-75
Барометр	ГОСТ 24696-79
Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая	ГОСТ 25556- 81

5.2 Реактивы, растворы

Антибиотики: группы пенициллина, тетрациклина, цефалоспорина и др. нистатин или амфотерицин.
Спирт этиловый ректификат	ГОСТ 5962-67
Среда для штамма-продуцента: агаризованное пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-продуцента (агар - 1,8 %, рН 5,9 - 6, 1 , режим стерилизации 1,1 - 1 ,2 атм в течение 30 мин)
Бенгальский розовый Диметилсульфоксид Селективная среда для штамма-продуцента, состав среды: КН₂РО₄ - 1г; MgSО₄ 7Н₂О - 0,5 г; (NH4)₂SO₄- 0,7 г; целлюлоза порошковая в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза - 0,3 дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар -18 г; вода дистиллированная- до 1 000 мл Спирт этиловый ректификат	ГОСТ 5962-67

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С), атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента ксиланазы воздух, аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5- 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3-5 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры) и нистатина (10 мкг/мл для подавления грибковой флоры), тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 30 °С. Через 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.