ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны

Методические указания

МУК 4.2.1072-01

Минздрав России
Москва 2002

1. Разработаны к. б. н. Бару Р. В., к. б. н. Лапчинской А. В. (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.

3. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный

санитарный врач Российской

Федерации - Первый заместитель

Министра здравоохранения

Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

20 сентября 2001 г.

МУК 4.2.1072-01

Дата введения: с момента

утверждения

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Характеристика штамма-продуцента Вермикулена

Микроорганизм Penicillium vermiculatum PK-1 является продуцентом Вермикулена. Биологический препарат Вермикулен представляет собой живую культуру (споры и мицелиальная масса микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-l).

Penicillium vermiculatum PK-1 - аэроб, растет на жидких и агаризованных средах, оптимальная температура роста 25-30 °С, оптимальная рН от 5 до 8. Наиболее интенсивный рост гриба отмечается на картофельно-сахарозном агаре и агаризованной среде Чапека. На среде Чапека-Докса при культивировании при температуре 25 °С на 2-3 сутки образуются небольшие (2-5 мм в диаметре) округлые бархатистые колонии желто-бежеватого цвета, с обратной стороной от светло- до темнооливкового. Репродуктивными органами микроорганизма являются споры (конидии и обрывки мицелия).

ПДК_р.з - 5000 кл/м³

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 30000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента Вермикулена на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)                                                                                                                ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический                                                                                                                ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х 10                                                                                                                ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм

Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл                                                                                                                ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                                                                                                                ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                                                                                                                ГОСТ 1770-74

Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл                                                                                                                ГОСТ 1770-74

Секундомер                                                                                                                ГОСТ 9586-75

Барометр                                                                                                    ГОСТ 24696-79

Марля медицинская                                                                                  ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая                                                     ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики группы аминогликозидов (канамицин, неомицин и др.)

Спирт этиловый ректификат                                                                                                              ГОСТ 5962-67

Селективная среда Чапека-Докса для штамма-продуцента: NaNO₃ - 3,0 г; MgSO₄ K₂HPO₄ - 1,0 г; KCL - 0,5 г; MgSO₄×7Н₂O - 0,5 г; FeSO₄×7Н₂O - 0,01 г; сахароза - 30 г; агар - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,0; стерилизация при 121 °С; 30 мин.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны соблюдают:

·       правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;

·       правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;

·       требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);

·       положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента Вермикулена воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1-10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2-3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (канамицин, неомицин) из расчета 25-50 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 25 °С. Через 48-72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

 кл/м³, где

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см² оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - в 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см².

Составляем пропорцию:

     на 100 см² за 1 мин оседает 2 л воздуха

     на 78,54 см²   -   Х л

                        Х= 1,57 л/мин.

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 м³ воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57×Т л.

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м³ воздуха содержится

Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м³ воздуха содержится

= 253 клетки

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол №

количественного микробиологического анализа штамма Penicillium vermiculatum PK-1 - продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа                                                             

Место отбора пробы                                                                     

Название лаборатории                                                                 

Юридический адрес организации                                              

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1. 005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).