Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод выявления и определения бактерий
Listeria monocytogenes в молоке и
молочных продуктах на основе
гибридизационного ДНК-РНК анализа

Дополнение 1 к МУК 4.2.1955-05
«Метод выявления и определения бактерий
рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе
гибридизационного ДНК-РНК анализа»

Методические указания
МУК 4.2.2788-10

1. Разработаны ГУ Научно-исследовательским институтом питания РАМН (С.А. Шевелева, Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Быкова, И.М. Нитяга); ГУ Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (В.Г. Нестеренко); при участии фирмы ООО «Ниармедик плюс» (Т.Б. Макарова, Д.Л. Хрульков, В.В. Милитицкий, А.Б. Швецов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 декабря 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод выявления и определения бактерий
Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах
на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа

Дополнение 1 к МУК 4.2.1955-05
«Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и
Listeria monocytogenes на основе гибридизационного
ДНК-РНК анализа»

Внести дополнения в МУК 4.2.1955-05:

1. Раздел 2. «Общие положения и область применения» дополнить пунктами 2.7 и 2.8 следующего содержания:

2.7. Настоящие методические указания устанавливают также метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах на основе твердофазного гетерогенного гибридизационного ДНК-РНК анализа с хемилюминесцентным детектированием. Метод может применяться в качестве дополнительного к классическим бактериологическим методам лабораторных исследований для целей выявления бактерий Listeria monocytogenes при контроле пищевых продуктов.

2.8. Метод ускоренного выявления бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-2001 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе.

2. Раздел 3. «Сущность метода» дополнить пунктами 3.6, 3.7 и 3.8 следующего содержания:

3.6. Метод выявления бактерий Listeria monocytogenes предусматривает высев определенных количеств исследуемых образцов молока и молочных продуктов в специальную селективную питательную среду, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, обработку культуральной жидкости лизирующим буфером, денатурацию бактериальной рибосомальной РНК, гибридизацию фрагментов денатурированной рРНК с комплементарным ей меченым зондом, входящим в набор «Люмипроб-24 Listeria monocytogenes», хемилюминесцентным детектированием продуктов реакции.

3.7. При обнаружении положительных результатов присутствие бактерий Listeria monocytogenes должно подтверждаться в соответствии с методами ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes» или МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах».

3.8. Мишенью в реакции ДНК-РНК гибридизации для Listeria monocytogenes является последовательность ДНК, кодирующая токсический белок листериолизин-О - основной фактор патогенности Listeria monocytogenes.

3. Раздел 10. «Нормативные ссылки» дополнить пунктом 10.19 следующего содержания:

10.19. МУК 4.2.1955-05 «Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа».

4. Методические указания дополнить разделом 11 с названием «Проведение анализа по обнаружению бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах» следующего содержания:

11. Проведение анализа по обнаружению бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах

11.1. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды

11.1.1. Аппаратура и инструментарий

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН ± 0,01	ГОСТ 19881-74
Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С	ТУ 64-1-28-70-76
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °С с отклонением от заданной ±1 °С	ТУ 64-1-1382-83
Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °С с отклонением от заданной ± 1 °С	ТУ 64-1-1382-83
Баня водяная с подогревом (37 ± 1) °С	ГОСТ 12026-76
Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру от 0 до 100 °С	ТУ 42-22-608-75
Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г	ГОСТ 24104-88
Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МБС	ГОСТ 8284-78
Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные	ГОСТ 19569-89Е
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72
Гомогенизатор перистальтического типа «Микс-2», «Стомайкер» или других наименований AES Lab., Cat. N AESAP 1066
Гомогенизатор типа «вортекс»
Штатив для 12 мм пробирок с держателем Europrobe, Cat. N P08363086
Микропипетки на 100 - 1000 мкл BIOHIT, Cat. N 725070 или «Ленпипет»
Мультистеппер BIOHIT, Cat. N 730101
Диспенсер BIOHIT, Cat. N 723046
Распределительная емкость - объем 1,0 - 2,5 л BIOHIT
Люминометр для пробирок «Люмлайт» или «Люмлайт мини» Europrobe, Cat. N ЕВLL01
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов	ТУ-16-535-84
Холодильник бытовой электрический	ГОСТ 16317-87
Пинцет медицинский	ГОСТ 21241-89
Ножницы медицинские	ГОСТ 21239-89
Скальпель хирургический, 15 см	ГОСТ 21240-89
Часы механические сигнальные	ГОСТ 3145-84
Электроплитка	ГОСТ 14919-83
Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания)	ТУ 64-1-2451-78
11.1.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная	ГОСТ 12026-76
Марля медицинская	9412-77
Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости	1770-74
Воронки стеклянные	25336-82
Вата медицинская гигроскопическая	5556-81
Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3	29227-91
Пробирки типов П1, П2	25336-82
Стекла предметные для микропрепаратов	6672-75
Спиртовки лабораторные стеклянные	23932-90
Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С (цена деления шкалы 1 °С)	13646-68
Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов	23932-90
Пакеты стерильные для гомогенизатора AES Lab., Cat. N AES400/50G
Отраслевой стандарт для визуальной оценки мутности № 10 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, МЗ РФ
Денситометр для бактериальных суспензий типа «Densi-La-Meter» или «Денсимат», ф. «Лахема», «BioMerieux»
Стандарт Макфарланда №№ 1, 2, 3 ф. «BioMerieux»
Петля бактериологическая, калиброванная на 1 мкл AES Lab., Cat. N AESDI100
11.1.3. Реактивы и питательные среды
Broth RM L «Europrobe», (Ref. EB 2157, EB 21502, EB 21504)
Тест-система «Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes» «Europrobe», (Ref. 11055)
Тест-штамм Listeria monocytogenes, типичный по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам, ГИСК им. Л.А. Тарасевича
11.1.4. Набор для проведения твердофазного гибридизационного ДНК-РНК анализа
Набор «Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes» на 50 тестов в составе:
• пробирки с фиксированным на них зондом	(5 пакетов × 10 пробирок)
• лизирующий буфер	(1 флакон × 5 мл)
• гибридизационный буфер	(1 флакон × 12 мл)
• 20-кратный промывочный буфер	(4 флакона × 30 мл)
• конъюгат	(1 флакон × 5 мл)
• субстрат	(1 флакон × 5 мл)
• защитная пленка	(6 шт.)

Примечание. Допускается использование других питательных сред, реактивов, диагностических препаратов, аппаратуры и инструментария с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в Российской Федерации в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

Питательные среды и биологические препараты отечественного и зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

11.2. Подготовка к анализу

11.2.1. Приготовление растворов и реактивов

1. Изотонический (0,85 %-й водный) раствор хлорида натрия (ГОСТ 26669-85).

2. Стерильный фосфатный буфер с рН 7,2 ± 0,1 КН₂РО₄ - 0,45 г, Na₂HPO₄ - 5,34 г в 1000 см³ дистиллированной Н₂О, стерилизовать при температуре 121 °С в течение 30 мин.

11.2.2. Приготовление питательных сред

Приготовление среды RM L Broth: навеску 52 г растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, осторожно перемешивают до растворения (при необходимости немного подогревают), устанавливают рН 7,2 ± 0,2 при 25 °С и автоклавируют при 115 °С в течение 15 мин. Простерилизованную горячую среду (70 - 80) °С быстро охлаждают до температуры 10 - 12 °С в холодной воде. Готовую среду хранят при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней.

11.3. Подготовка к проведению твердофазного гибридизационного ДНК-РНК анализа

11.3.1. Все реагенты наборов перед использованием необходимо прогреть при комнатной температуре в течение 30 мин, перед использованием содержимое флаконов необходимо аккуратно перемешать легким переворачиванием флакона. Пробирки с сенсибилизированными олигонуклеотидными ДНК-зондами извлекают из упаковки в количестве, соответствующем общему числу исследуемых и контрольных проб.

11.3.2. Перед началом работы необходимо проверить индикаторы уровня влажности: индикаторная полоска на пакетах с сорбентом должна иметь синий цвет, при высокой влажности она приобретает розовую окраску, что говорит о непригодности к использованию пробирок, находящихся в данном комплекте наборов.

11.3.3. Приготовление промывочного буфера: 1 флакон, содержащий 30 мл концентрированного (×20) промывочного буфера, вносят в 570 см³ свежеприготовленной стерильной дистиллированной воды (или 1 объем концентрированного буфера на 19 объемов стерильной дистиллированной воды). Приготовление буфера рекомендуется проводить в мерном цилиндре: сначала количественно переносят содержимое флакона с концентрированным буфером, после чего постепенно по стенке цилиндра вливают дистиллированную воду, доводя общий объем до 600 см³, и тщательно перемешивают, избегая образования пены на поверхности смеси. Хранение готового буфера: 1 месяц при комнатной температуре.

Примечания

• Содержимое гибридизационного буфера является едким веществом, и не должно попадать в глаза и на кожу. В случае контакта немедленно обильно промыть и обратиться к врачу.

• При проведении анализа необходимо надеть защитную одежду и перчатки.

• Большинство реагентов содержат азид натрия в качестве консерванта.

11.4. Отбор и подготовка проб к анализу

11.4.1. Общие положения по отбору и подготовке проб

Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes», МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию» и ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа».

11.4.2. Кисло-молочные продукты и сыры тщательно измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации до рН 7,2 ± 0,2 1N раствором NaOH. Топленое масло или молочный жир расплавляют при температуре 40 - 45 °С и перемешивают до получения однородной эмульсии, масло сливочное и мороженое расплавляют до сметанообразной консистенции.

11.5. Проведение анализа по обнаружению бактерий Listeria monocytogenes в молоке и молочных продуктах

11.5.1. Подготовленную в соответствии с разделом 5 пробу исследуемого продукта (гомогената) вносят в среду накопления - обогатительный бульон RM L по п. 4.2, предварительно прогретом в течение 15 мин при температуре 45 °С, для первичного обогащения в соотношении 1:3 (25 г продукта в 75 см³ среды). При необходимости анализа других масс продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:3 по объему. Пробы гомогенизируют с использованием гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых.

11.5.2. Гомогенизированную пробу в RM L бульоне термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 6 ч.

11.5.3. Переносят 10 см³ инкубированной в RM L бульоне пробы в 90 мл обогатительного бульона RM L, предварительно нагретого до температуры 41 °С. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 16 ч.

11.5.4. Маркируют пробирки, входящие в набор «Lumiprobe 24 Listeria monocytogenes» в соответствии с номерами исследуемых проб и помещают в штатив для 12 мм пробирок с держателем. Не рекомендуется одновременно анализировать более 20 проб.

11.5.5. Внесение проб (после инкубации в течение 16 ч) и всех реагентов (лизирующего и гибридизационного буферов, конъюгата, субстрата) необходимо производить быстро и не касаясь наконечником краев пробирки. Не допускается использование одного наконечника для внесения разных проб или растворов буферов.

11.5.6. Проведение лизиса бактериальных клеток: в каждую промаркированную пробирку добавляют, строго соблюдая очередность, как изложено ниже, следующие компоненты набора:

11.5.6.1. Лизирующий буфер в количестве 100 мкл.

11.5.6.2. Исследуемую пробу в обогатительном бульоне RM L в количестве 100 мкл.

В качестве отрицательного контроля (ОК) используют стерильный бульон RM L - 100 мкл. Пробу стерильного бульона RM L, используемого в качестве отрицательного контроля, термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 16 ч.

В качестве положительного контроля (ПК) используют тест-культуру Listeria monocytogenes, выращенную на бульоне RM L при 37 °С также в количестве 100 мкл.

11.5.6.3. Пробирки закрывают адгезивной уплотнительной защитной пленкой (из набора), быстро перемешивают и помещают для инкубирования в водяную баню при температуре (37 ± 1) °С на 15 мин.

11.5.7. Проведение гибридизации: вынимают штатив из водяной бани, удаляют защитную пленку и добавляют в каждую пробирку гибридизационный буфер по 250 мкл, закрывают пробирки новой защитной пленкой и интенсивно встряхивают. Пробирки с внесенным гибридизационным буфером инкубируют в водяной бане при температуре (50 ± 1) °С в течение 60 мин.

11.5.8. Выявление гибридов:

11.5.8.1. Удаляют защитную пленку и быстро выливают содержимое всех пробирок одновременно, не вынимая их из штатива.

11.5.8.2. Не вынимая пробирки из штатива, быстро заполняют каждую пробирку промывочным буфером по п. 4.3.3 в количестве 5 см³, используя диспенсер, после чего быстро опустошают пробирки. Процедуру промывки проводят еще три раза. При проведении второй промывки также быстро полностью опустошают пробирки сразу после заполнения их промывочным буфером. Третий и четвертый раз промывают пробирки следующим образом: после заполнения пробирок промывочным буфером ждут 30 с перед тем, как полностью их опустошить.

Порядок заполнения пробирок промывочным буфером:

Первую и третью промывки начинают с первой пробирки, вторую и четвертую промывки - с последней пробирки.

После четвертой промывки содержимое пробирок энергично сливают в раковину, переворачивают штатив с пробирками и помещают на фильтровальную бумагу, слегка встряхивая до тех пор, пока пробирки не осушатся (4 - 5 раз), и оставляют их в перевернутом состоянии на несколько секунд.

11.5.8.3. Во все пробирки вносят раствор конъюгата по 100 мкл. Покрывают пробирки новой уплотняющей защитной пленкой и сильно встряхивают штатив. Инкубируют в водяной бане при (37 ± 1) °С в течение 15 мин. Штатив вынимают из водяной бани, удаляют защитную пленку и быстро выливают содержимое всех пробирок одновременно, не вынимая их из штатива.

11.5.8.4. Пробирки промывают 4 раза, выдерживая каждый раз не менее 30 с (для этого быстро опустошают пробирки и затем полностью заполняют их промывочным буфером). Следует обратить внимание на то, что, промывая пробирки в четвертый раз, буфер необходимо вносить медленно, не допуская образования пены, а после его удаления на стенках пробирок не должно оставаться пены от промывочного буфера (пробирки должны быть абсолютно прозрачными).

По окончании промывки пробирки помещают на фильтровальную бумагу и оставляют в перевернутом состоянии несколько секунд, пока они полностью не осушатся.

11.5.8.5. Во все пробирки вносят раствор субстрата по 100 мкл, и осторожно встряхивают. Инкубируют в темноте при температуре не выше 20 °С в течение 15 мин. Для внесения раствора субстрата следует пользоваться отдельной пипеткой для предотвращения его контаминации.

11.5.9. Измеряют уровень хемилюминесценции в каждой пробирке на люминометре «Люмлайт» или «Люмлайт мини» с интеграционным временем 5 с в соответствии с инструкцией к прибору.

Перед измерением каждую пробирку осторожно протирают для удаления капель жидкости. Следует обратить внимание, что во время измерения хемилюминесценции в пробирочном люминометре прибор не должен находиться под прямым источником света.

Примечания

• Стадия гибридизации должна начинаться не позднее 45 мин после стадии лизиса.

• Качество гибридизации и фиксации конъюгата зависят от времени и температуры инкубации, которые необходимо строго соблюдать.

• Низкий уровень рН (<5) в обогатительном бульоне после внесения высококислотных продуктов (фруктовые соки, кисло-молочные продукты и др.) может приводить к ложноотрицательным результатам; необходимо нейтрализовать пробы (раздел 5).

11.5.10. Учет результатов.

Результат прямого измерения хемилюминесценции в пробах выражают в относительных люминесцирующих единицах в секунду (ОЛЕ/с).

Определение пороговой величины измерения:

пороговая величина (отсекающее значение) определяется как уровень хемилюминесценции пробы с отрицательным контролем (ОК), умноженный на коэффициент 3 («Cut-off» фактор).

11.5.10.1. Интерпретация полученных результатов: результат измерения считается положительным, если уровень хемилюминесценции в исследуемой пробе превышает уровень пороговой величины измерения (отсекающего значения).

Результат измерения считается отрицательным, если уровень хемилюминесценции в исследуемой пробе ниже или равен уровню пороговой величины измерения (отсекающего значения).

11.5.11. Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной навеске продукта записывают: «бактерии Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г (см³) (в 50 - 100 г (см³) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта» или «бактерии Listeria monocytogenes не обнаружены в 25 г (см³) (в 50 - 100 г (см³) для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта».

11.5.12. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.