4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы

Методические указания
МУК 4.2.2879-11

"Методы определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых
продуктах. Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2429-08"

(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом
РФ 26 июня 2011 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Введены впервые

Внести дополнения и изменения в МУК 4.2.2429-08:

1. Раздел 1 "Область применения" дополнить пунктом 1.5 следующего содержания:

"1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, C1, С2, С3, D, Е (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг".

2. В разделе 3 "Сущность метода" пункт 3.1 изложить в следующей редакции:

"3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов А (СЭА) или В (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235 и 42-236, ВС 89), а также энтеротоксины типов А, В, С, D и Е при совместном дифференцированном и недифференцированном определении".

3. Раздел 3 "Сущность метода" дополнить пунктами 3.5, 3.6 и 3.7 следующего содержания:

"3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза - флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой.

3.6. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферола при 450 нм и тест-наборы, в состав которых входят наконечники, сенсибилизированные антителами к СЭТ типов А, В, С, D, Е, используемые в качестве пипетирующего устройства; и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа.

3.7. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы и тест-наборы, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке".

4. Раздел 4 "Требования к выполнению анализов" изложить в новой редакции:

"4. Требования к выполнению анализов

4.1. Условия безопасного проведения работ

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на приборы.

Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:

- не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;

- не использовать поврежденные стрипы;

- не использовать набор по истечении срока годности;

- не смешивать реактивы из различных партий;

- положительный контроль и стандарт содержат очищенный стафилококковый энтеротоксин. При работе соблюдать осторожность. Работать в защитной одежде, перчатках, очках. При попадании внутрь следует немедленно обратиться к врачу;

- реактивы содержат натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления;

- пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель;

- анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

4.2. Требования к квалификации специалистов

Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.

4.3. Условия выполнения измерений

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях:

- температура окружающего воздуха (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление (97 ± 10) кПа;

- относительная влажность (65 ± 15)%".

5. Раздел 5 "Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы":

Пункт 5.1 "Средства измерений и вспомогательное оборудование" дополнить следующей позицией:

"Автоматический иммуноферментный анализатор типа VIDAS BioMerieux^® или mini VIDAS BioMerieux^®, Франция или аналогичного типа".

Пункт 5.2 "Лабораторная посуда и инструменты" дополнить следующими позициями:

"Шприцы на 20 мл

Пипетка одноразовая на 500 мкл

Пакет для гомогенизации с фильтром

Центрифужные пробирки на 50 мл".

Раздел 5.3 "Реактивы и материалы" дополнить следующими позициями:

"Набор реагентов типа "VIDAS^®Staph enterotoxin II (SET2), BioMerieux^®, Франция или с аналогичными характеристиками

Набор реагентов типа RIDASCREEN^® SET Total (R-Biopharm AG, Германия) или с аналогичными характеристиками

Индикатор рН (бумажный)

Трихлоруксусная кислота 90 % (5,5 N)

Буфер ТРИС 0,3 М, рН 8,0

Раствор NaOH 1 N и 4 N

Соляная кислота 5 N".

6. В разделе 5 пункт 5.5 "Состав набора реагентов для иммуноферментного определения стафилококковых энтеротоксинов А, В, С, D, Е" изложить в новой редакции:

"В состав набора для дифференцированного определения СЭТ типов А, В, С, D, E входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 12 проб с идентификацией энтеротоксинов (включая положительный контроль).

Набор для твердофазного иммуноферментного анализа СЭТ А, В, С, D, Е содержит:

В состав набора типа RIDASCREEN^® SET Total для недифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 96 проб (включая положительные и отрицательные контроли) без идентификации типов энтеротоксинов.

Тест-набор для недифференцированного определения SET содержит:

7. Раздел 5 дополнить пунктом 5.7. в следующей редакции:

"5.7. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа

В состав набора должны входить материалы и реагенты в количествах, достаточных для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов.

Набор содержит следующие компоненты, готовые к использованию (табл. 1).

Таблица 1

Состав стрипа (табл. 2). Каждый стрип в тест-наборе для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа.

Таблица 2

8. Название раздела 6 изложить в следующей редакции:

"6. Проведение испытаний методом твердофазного иммуноферментного анализа".

9. В разделе 6 пункт 6.7. изложить в следующей редакции:

"6.7. Проведение анализа

6.7.1. Проведение анализа для совместного дифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, С, D, Е методом твердофазного иммуноферментного анализа

6.7.1.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа.

6.7.1.2. Добавить по 100 мм³ исследуемого раствора в лунки А - G соответствующего стрипа, в лунку Н добавить 100 мм³ положительного контроля, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре.

6.7.1.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 250 мм³ готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще три раза.

6.7.1.4. Добавить в каждую лунку по 100 мм³ коньюгата, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 1 ч при комнатной температуре.

6.7.1.5. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.1.3.

6.7.1.6. Добавить по 50 мм³ субстрата и 50 мм³ хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.

6.7.1.7. Добавить в каждую лунку по 100 мм³ стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. В течение 30 мин после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм ("бланк" или нулевое считывание по воздуху).

6.7.2. Проведение анализа для совместного недифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов методом твердофазного иммуноферментного анализа.

6.7.2.1. Вставить в рамку планшета стрипы в количестве, соответствующем количеству проб, подготовленных для анализа.

6.7.2.2. Добавить по 100 мм³ исследуемых проб и контролей в соответствующие лунки стрипа, используя новый наконечник для каждой пробы. Закрыть лунки пленкой и инкубировать в течение 30 мин при температуре (36 ± 1) °С.

6.7.2.3. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку и тщательно выбить капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью 8-канальной пипетки заполнить лунки по 300 мм³ готового моющего буфера и снова вылить жидкость. Выбить лунки, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок моющим буфером еще 4 раза.

6.7.2.4. Добавить в каждую лунку по 100 мм³ коньюгата 1, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин при температуре  (36 ± 1) °С.

6.7.2.5. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.2.3.

6.7.2.6. Добавить в каждую лунку по 100 мм³ коньюгата 2, осторожно перемешать вручную и оставить на инкубацию в течение 30 мин при температуре (36 ± 1) °С.

6.7.2.7. Провести процедуру, описанную в п. 6.7.2.3.

6.7.2.8. Добавить по 100 мм³ субстрата / хромогена в каждую лунку. Осторожно перемешать вручную и инкубировать при температуре (36 ± 1) °С в течение 15 мин в темноте. Немедленно просмотреть результаты.

6.7.2.9. Изменение цвета в лунках планшета из красного в голубой указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Осторожно перемешать пробы вручную круговыми движениями микропланшета по поверхности стола для равномерного распределения окраски раствора в лунках.

6.7.2.10. Добавить в каждую лунку по 100 мм³ стоп-реагента и осторожно перемешать вручную. Изменение цвета из голубого в желтый указывает на присутствие стафилококковых энтеротоксинов в пробах. Измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм".

10. В разделе 6, пункте 6.8, подпункт 6.8.1 дополнить абзацем следующего содержания:

"При совместном недифференцированном определении СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа пороговую величину оптической плотности также устанавливают путем прибавления 0,15 к среднему значению оптической плотности, измеренной в лунках с отрицательным контролем".

11. Раздел 6 дополнить пунктом 6.10 в следующей редакции:

"6.10. Идентификация стафилококковых энтеротоксинов

При получении положительных результатов анализа с применением недифференцированного определения СЭТ методом твердофазного иммуноферментного анализа тип присутствующего в исследуемой пробе энетротоксина может быть установлен путем повторного дифференцированного определения стафилококковых энтеротоксинов типов А, B, C, D, E (п. 6.7.1)".

12. Текст методических указаний дополнить разделом 7 в следующей редакции:

"7. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа для качественного недифференцированного определения СЭТ типов А, В, C1, C2, С3, D и Е

7.1. Подготовка к анализу

7.1.1. Приготовление буфера для экстракции

Содержимое флакона R1 (концентрат буфера для эктракции) растворить в стерильной деминерализованной воде до конечного объема 1000 см³, тщательно перемешать. Буфер может храниться в течение 3 месяцев при температуре 2 - 8 °С. Концентрат буфера можно разделить на аликвоты и разводить по частям в зависимости от частоты использования и скорости потребления.

7.1.2. Приготовление 90 %-го раствора трихлоруксусной кислоты

Растворить 90 г трихлоруксусной кислоты в 40 мл деминерализованной воды. Довести конечный объем до 100 см . Хранить раствор 1 месяц при температуре 18 - 25 °С.

7.1.3 Измерение рН экстрактов

Для измерения рН использовать трехцветный бумажный индикатор рН с точностью определения не менее 0,5 единиц рН.

7.2. Проведение экстракции

7.2.1. Общий протокол экстракции СЭТ

Внести 25 г образца пищевого продукта и 25 см³ буфера для экстракции в пакет для гомогенизации типа стомайкер. Гомогенизировать в течение 3 мин на высокой скорости до получения гомогенной суспензии, оставить на 15 мин при комнатной температуре. Центрифугировать пробу в течение 15 мин при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. Пропустить супернатант через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить рН фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.

7.2.2 Молочные продукты (кисломолочные продукты, cyxоe молоко, сыры)

Внести 25 г образца в 40 см³ деминерализованной воды нагретой до температуры (38 ± 2) °С. Гомогенизировать в течение 3 мин на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин при 18 - 25 °С. Измерить рН и, при необходимости, довести его до 3,5 - 4,0, используя раствор 5 N НCl. Центрифугировать 15 мин при 3000 - 5000 об./мин и температуре 18 - 25 °С. Измерить рН надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,58,0, используя раствор 1 N NaOH. Центрифугировать повторно 15 мин при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. При необходимости профильтровать как описано в п. 7.2.1. Отобрать 500 мкл готового экстракта для проведения анализа.

7.2.3. Молоко

Отобрать 25 см³ пробы и довести рН до 3,5 - 4,0, используя 5 N НС1. Далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п. 7.2.2.

7.2.4. Сырые мясо и мясопродукты, готовые мясные изделия, морепродукты

Гомогенизировать 25 г образца в 25 см³ деминерализованной воды в течение 3 мин на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Если суспензия слишком плотная, добавить еще 25 см³ деминерализованной воды и гомогенизировать повторно. Отобрать весь экстракт. Измерить рН и, при необходимости, довести его до рН 4,0, используя раствор 5 N НCl. Оставить на 15 - 30 мин при 18 - 25 °С. Центрифугировать 15 мин при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. Пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Измерить рН фильтрата и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать повторно. Отобрать 500 мм готового экстракта для проведения анализа.

7.2.5. Экстракция СЭТ из концентрированных пищевых продуктов (концентраты готовых блюд, сублимированные пищевые продукты)

Концентрированные продукты следует развести в соответствии с рекомендациями изготовителя. Измерить рН конечного продукта и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. При наличии осадка центрифугировать 15 мин при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С, пропустить надосадочную жидкость через шприц с вложенной прослойкой из увлажненной гигроскопической ваты. Отобрать 500 мм готового экстракта для проведения анализа.

7.2.6. Экстракция СЭТ из сухих (дегидратированных) продуктов

Сухие продукты (кроме сухого молока) восстановить в дистиллированной воде до объема, указанного изготовителем. Оставить на 1 ч при температуре 18 - 25 °С, далее экстракцию СЭТ проводить как указано в п. 7.2.1.

7.2.7. Концентрирование проб трихлоруксусной кислотой

Метод используется для увеличения концентрации СЭТ при исследовании молочных продуктов, в том числе сыров.

Приготовить раствор трихлоруксусной кислоты в соответствии с п. 7.1.2.

Внести 25 г образца в 40 см деминерализованной воды нагретой до температуры (38 ± 2) °С. Гомогенизировать в течение 3 мин на высокой скорости до получения гомогенной суспензии. Оставить на 30 мин при 18 - 25 °С. Измерить рН и, при необходимости, довести его до 3,5 - 4,0, используя раствор 5 N НCl. Центрифугировать 15 мин при 3000 - 5000 об./мин и температуре 18 - 25 °С. Измерить рН надосадочной жидкости и, при необходимости, довести его до 7,5 - 8,0, используя раствор 1 N NaOH. Измерить объем надосадочной жидкости (V). Добавить к надосадочной жидкости 90 %-й водный раствор трихлоруксусной кислоты до его конечной концентрации 5 %. Гомогенизировать и оставить на 30 мин при 18 - 25 °С. Центрифугировать 30 мин при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С. Осторожно удалить надосадочную жидкость. Растворить осадок в 0,3 М буфере ТРИС, рН 8,0, в объеме, соответствующем 1/10 начального объема надосадочной жидкости V, обработанной трихлоруксусной кислотой. При необходимости довести рН до 7,5 - 8,0, используя раствор 4 N NaOH. При таком значении рН молочный раствор прозрачен. При наличии твердых частиц центрифугировать повторно 15 мин при 3000 - 5000 g и температуре 18 - 25 °С.

Отобрать 500 мм готового экстракта для проведения анализа.

7.3. Хранение экстрактов

Определение СЭТ с использованием наборов для проведения фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа следует проводить сразу после экстракции. Если нет возможности провести тест сразу, экстракты (кроме молочных продуктов) могут храниться при температуре не выше -19 °С в течение 7 суток.

7.4. Проведение анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе

Перед использованием наборов и реактивов новой партии в прибор необходимо ввести спецификации. Для этого используется калибровочная карта. Если не провести эту процедуру до проведения анализа, прибор не сможет распечатать результат. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов (лота). Данные с калибровочной карты вводят автоматически или вручную.

Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тестнабора оставить при комнатной температуре на 30 мин.

7.4.1. Стандарт перед использованием необходимо тщательно перемешать. Тестирование стандарта необходимо для подтверждения сохранности набора при транспортировании и хранении. Стандарт должен тестироваться в каждом наборе. Результаты тестирования хранятся в течение 2 недель и автоматически используются для анализа результатов теста. Рекомендуется тестирование стандарта в 2 стрипах.

7.4.2. Положительный и отрицательный контроли перед использованием тщательно перемешивают. Контроли тестируются в каждом наборе. Тестирование контролей необходимо для занесения пределов теста в компьютер.

7.4.3. В прибор вводят соответствующую информацию для создания рабочего листа.

7.4.4. Вносят 500 мм готового экстракта в лунку для внесения образца на стрипе тест-набора.

7.4.5. Вносят 500 мм стандарта и контролей в 1 лунку (отдельно для каждого) стрипа.

7.4.6. Вставляют стрипы и конусы в соответствующие отделения прибора, которые указаны в рабочем листе. Следует убедиться, что на стрипе и конусе указаны соответствующие буквы кода данного анализа.

7.4.7. Анализ проводят в соответствии с инструкцией, изложенной в руководстве пользователя.

7.4.8. Анализ полностью автоматизирован, длительность составляет 80 мин.

7.5. Интерпретация результатов

Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции - ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:

Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта.

В качестве стандарта в системе используют очищенный стафилококковый энтеротоксин типа А.

Результаты тестирования для образца и контролей сравниваются со значениями ОВФ, хранящимися в базе данных: < 0,13, ≥ 0,13. Если полученное значение меньше 0,13, то результат интерпретируется как отрицательный. Если значение теста равно или выше 0,13, то результат интерпретируется как положительный.

Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту.

На принтер выводится информация - тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация".