Приказ Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2
"Об утверждении инструкций по иммуносерологии"
В целях совершенствования системы обеспечения иммунологической безопасности переливания крови и ее компонентов, профилактики посттрансфузионных реакций и осложнений приказываю:
1. Ввести в действие с 01.02.98:
1. Инструкцию по предупреждению несовместимости при переливании крови (приложение 1).
2. Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения группы крови системы АВО (приложение 2).
3. Инструкцию по определению группы крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток (приложение 3).
4. Инструкцию по применению цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических жидких для определения группы крови системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ) (приложение 4).
5. Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус (приложение 5).
6. Инструкцию по удалению из сывороток антирезус антител другой специфичности (приложение 6).
7. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови (приложение 7).
8. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели (приложение 8).
9. Инструкцию по применению цоликлона анти-D диагностического жидкого для определения D антигена системы резус (антитела моноклональные анти-D) (приложение 9).
10. Инструкцию по применению анти-D IgМ моноклонального реагента для определения резус-принадлежности (цоликлона анти-D супер) (приложение 10).
11. Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител (приложение 11).
12. Инструкцию по изготовлению редких сывороток, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека (приложение 12).
13. Инструкцию по применению цоликлона анти-С моноклонального для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека (цоликлон анти-С супер) (приложение 13).
14. Инструкцию по применению цоликлона анти-Е оноклонального для определения антигена Е системы резус на эритроцитах человека (цоликлон анти-Е супер) (приложение 14).
15. Инструкцию по предупреждению посттрансфузионных осложнений, обусловленных факторами Кеll и с(hr') (приложение 15).
16. Инструкцию по иммунизации доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус (приложение 16).
17. Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов (приложение 17).
18. Инструкцию по определению иммунных антител групповой системы АВО (приложение 18).
19. Инструкцию по изготовлению стандартных эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях (приложение 19).
4. Считать недействующими на территории Российской Федерации:
1. Инструкцию по предупреждению несовместимости при переливании крови, утвержденную Минздравом СССР 05.12.90 № 05-14/37-14.
2. Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 № 05-14/26.
3. Инструкцию по определению группы крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток: утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 № 05-14/27.
4. Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 № 05-14/28.
5. Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус антител другой специфичности", утвержденную Минздравом СССР 27.11.90 № 10-11/136.
6. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 № 05-14/29.
7. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели, утвержденную Минздравом СССР 06.12.90 № 05-14/38-14.
8. Инструкцию по применению цоликлона анти-D диагностического жидкого для определения D антигена системы Резус (антитела моноклональные анти-D), утвержденную Минздравом СССР 21.08.90.
9. Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 № 05-14/30.
10. Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких групп, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека, утвержденную Минздравом СССР 26.03.79 № 06-14/3.
11. Методические рекомендации "Иммунизация доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденную Минздравом СССР 27.11.90 № 10-11/138.
12. Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов, утвержденную Минздравом СССР 14.10.76 № 06-14/1.
13. Методические рекомендации "Определение иммунных антител групповой системы АВО", утвержденные Минздравом СССР 27.11.90 № 10-11/135.
5. Считать утратившими силу:
1. Инструкцию по применению цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических жидких для определения групп крови человека системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ), утвержденную Минздравмедпромом России 17.03.95.
2. Инструкцию по применению анти-Rh0(D) IgМ моноклонального реагента для определения резус-принадлежности крови человека (цоликлона анти-D супер), утвержденную Минздравмедпромом России 14.07.94.
3. Инструкцию по применению цоликлона анти-rh'(С) моноклонального для определения антигена С системы Резус на эритроцитах человека (цоликлон анти-С супер), утвержденную Минздравмедпромом России 17.03.95.
4. Методические рекомендации "Способ выявления иммунных анти-А, анти-В антител в сыворотке крови человека", утвержденную Минздравом РСФСР 15.09.89.
6. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на заместителя Министра Стародубова В.И.
|
Министр |
Т.Б. Дмитриева |
Инструкция по предупреждению несовместимости при переливании крови
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Общие сведения
Основным принципом предупреждения гемотрансфузионных осложнений является обеспечение совместимости крови донора и реципиента.
Прежде чем приступить к переливанию крови, врач должен предусмотреть, чтобы кровь доноров была совместима с кровью реципиента.
Под совместимостью понимается благоприятное сочетание крови донора и реципиента. Биологически невозможное их сочетание по антигенам и антителам различных групповых систем определяет несовместимость крови донора и реципиента.
В настоящее время известно более 11 групповых систем крови человека, но значение их в переливании крови неравноценно. В первую очередь совместимость при переливании крови должна быть обеспечена правильным выбором донора по группам крови системы АВО и резус-антигену D.
2. Группы крови АВО
Наибольшее значение для обеспечения совместимости при переливании крови имеет выбор крови по системе АВО.
Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания антигенных свойств эритроцитов, называемых агглютиногенами, и антител по отношению к ним - агглютининов, находящихся в плазме крови людей.
Существуют два групповых агглютиногена - А и В и два групповых агглютинина - aльфа и бета. Различные сочетания этих свойств образуют четыре группы крови:
|
Обозначение |
Агглютиногены в эритроцитах |
Антитела в плазме |
Частота встречаемости в процентах |
|
О-альфа бета(I) |
нет |
анти-А(альфа) анти-В(бета) |
33,5 |
|
А-бета(II) |
А |
анти-В(бета) |
37,8 |
|
В-альфа(III) |
В |
анти-А(альфа) |
20,6 |
|
АВо(IV) |
А, В |
нет |
8,1 |
Агглютинин альфа (альфа) является антителом по отношению к агглютиногену А, а агллютинин бета (бета) является антителом по отношению к агглютиногену В. Ошибочное переливание иногруппной крови, содержащей агглютиногены, против которых у больного имеются антитела, т.е. крови, содержащей агглютиноген А, при наличии у реципиента агллютининов альфа (анти-А), или крови, содержащей агглютиноген В, при наличии у реципиента агглютинина бета (анти-В), приводит к явлению несовместимости.
3. Система Резус (Rh-Нr)
Кроме антигенов системы АВО, в эритроцитах людей имеется множество других антигенов, образующих различные групповые системы, независимые как от системы АВО, так и друг от друга.
Наиболее важное значение при переливании крови, после групп крови АВО, имеют антигены системы резус D, С, Е, с, е, Сw, особенно, обладающий наибольшей активностью, антиген D, называемый резус-фактором.
Эти антигены, находясь в эритроцитах людей в различных сочетаниях, образуют 28 фенотипов (см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности крови").
Так же как и антиген D, любой другой фактор этой системы может вызвать образование изоиммунных антител у лиц, его не имеющих, однако значительно реже и, большей частью, лишь как сопутствующих антителам против антигена D.
Главным отличием системы резус от системы АВО является то, что в крови людей содержатся только агглютиногены этой системы, а антител по отношению к ним, подобных антителам альфа и бета системы АВО, обычно, в норме у людей не имеется.
Однако, у резус-отрицательных лиц при некоторых условиях (при переливании или при другом способе введения резус-положительной крови, или во время беременности женщины резус-положительным плодом) может произойти сенсибилизация, т. е. могут образоваться изоиммунные антитела антирезус.
Последствием этой сенсибилизации у беременной женщины является рождение детей с гемолитической болезнью или внутриутробная смерть плода. Поэтому наличие у женщин такого анамнеза, так же как сведения о трансфузионных реакциях, как у женщин, так и у мужчин, уже указывают на возможное наличие у них резус-антител.
Если больному, в крови которого имеются резус-антитела, ошибочно перелить резус-положительную кровь, то это приведет к явлению несовместимости.
Лиц, в крови которых содержится резус-антиген D, т.е. резус-положительных (Rh+), около 85 %.
15 % людей являются резус-отрицательными (rh-). (Вычислено среди лиц русской национальности).
4. Значение других групповых систем эритроцитов при переливании крови
Антигены других групповых систем также обладают активностью, в первую очередь Келл (К), Даффи (Fу), Кидд (Jk), затем антигены системы MNSs и другие.
Однако, антигенная активность их значительно ниже и антитела по отношению к ним встречаются редко.
Антитела ко всем этим антигенам могут образоваться у человека любой группы системы АВО, а также, кроме антител анти-D, независимо от резус-принадлежности, т.е. как у резус-отрицательных, так и у резус-положительных лиц. Образуются они при тех же условиях, что и антитела анти-D, т.е. при повторном введении крови и беременностях, и могут служить причиной заболевания новорожденного или трансфузионного осложнения.
5. Причины несовместимости и меры ее предупреждения
Если реципиенту, в крови которого имеются антитела, перелить кровь донора, эритроциты которого содержат антигены, против которых направлены эти антитела, такая кровь будет разрушаться в организме реципиента, т.е. она является для него несовместимой.
Перед переливанием крови врач должен убедиться в том, что предназначенная для переливания кровь не содержит антигенов, против которых в крови больного имеются антитела, т.е. совместима с кровью реципиента.
Для того, чтобы не допустить переливания несовместимой крови и следующих за этим клинических проявлений несовместимости, врач, переливающий кровь, обязан:
- правильно выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО;
- правильно выбрать кровь в отношении резус - принадлежности;
- проверить всю относящуюся к этому документацию;
- произвести контрольные исследования, включающие пробы на совместимость.
Врач должен также учесть, что кроме нормально существующих антител системы АВО - альфа и бета и имеющих большое практическое значение изоиммунных антител антирезус-D, у реципиента, хотя и значительно реже, могут встретиться антитела к другим антигенам эритроцитов: С, Е, с, е, Сw, К, Fу, Jk, М, N, S, s и др.
Предупреждению несовместимости по отношению к этим антигенам, так же как и в отношении антигена D должно, в первую очередь, служить тщательное выявление трансфузионного и акушерского анамнеза. Кроме того, несовместимость к некоторым из них может быть установлена при проведении проб на совместимость.
6. Выбор крови, совместимой в отношении групп крови АВО (см. рис.1)
Вопросы совместимости в отношении групп системы АВО решаются различно в зависимости от того, переливается ли цельная кровь или предполагается использовать эритроциты, освобожденные от плазмы (отмытые, размороженные).
а) при переливании цельной крови она должна быть одноименной по группам АВО, т.е. реципиенту может переливаться кровь той же группы, к которой принадлежит он сам. При переливании цельной крови детям это правило является обязательным.
При переливании крови взрослым реципиентам в исключительных случаях допускается переливание крови группы О(I) реципиентам другой группы, однако количество переливаемой крови в этих случаях должно быть ограничено.
Эти ограничения связаны с тем, что групповые антитела у доноров группы O(I), особенно агглютинины альфа (анти-А), иногда носят иммунный характер, бывают очень активными и поэтому могут вызывать разрушение эритроцитов крови реципиента другой группы;
б) при использовании эритроцитов, освобожденных от плазмы (отмытых, размороженных), эритроциты группы О(I) являются как бы универсальной трансфузионной средой и могут быть перелиты реципиенту любой группы. Реципиенты группы АВ(IV), в крови которых не содержится групповых антител, являются как бы универсальными реципиентами и им могут быть перелиты эритроциты любой группы крови, освобожденные от плазмы.
|
Кровь одноименной |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Оальфа бета(I) |
Aбета(II) |
Вальфа(III) |
|
ABo(IV) |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Реципиент |
|
Оальфа бета(I) |
Aбета(II) |
Вальфа(III) |
ABo(IV) |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Кровь неодноименной |
|
Оальфа бета(I) |
|
Aбета(II) |
|
Вальфа(III) |
|
ABo(IV) |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Рисунок 1. Схема совместимости по группам системы АВО при переливании цельной крови.
7. Выбор крови, совместимой в отношении резус-антигена D
Кроме групп системы АВО, при переливании крови должна учитываться резус-принадлежность донора и реципиента. Переливаемая кровь должна быть одноименной с кровью реципиента в отношении резус-принадлежности.
Это особенно важно для резус-отрицательных реципиентов, независимо от наличия или отсутствия у них резус-антител, в последнем случае для предупреждения возможного их образования.
При переливании эритроцитов, освобожденных от плазмы, резус-положительным новорожденным с гемолитической болезнью, рекомендуется введение резус-отрицательных эритроцитов.
8. Проверка документации
Выбрав кровь для переливания больному, специалист обязан:
а) сравнить запись определения группы крови реципиента по системе АВО (в истории болезни) и донора (на контейнере с кровью, приготовленной для переливания) и убедиться, что, согласно этим записям, кровь донора совместима с кровью реципиента в отношении групп крови системы АВО;
б) проверить запись о резус-принадлежности в истории болезни реципиента и на контейнере с кровью и убедиться, что кровь донора и реципиента совпадают по резус-принадлежности.
После проверки документации необходимо сделать контрольные исследования.
9. Контрольные исследования
Независимо от проведенных исследований и имеющихся записей, непосредственно перед тем, как приступить к переливанию крови, специалист обязан:
а) определить групповую принадлежность крови больного и сверить результат с записью в истории болезни и с обозначением группы крови донора на контейнере (флаконе):
б) определить групповую принадлежность крови донора, взятой из флакона (из трубочки контейнера), и сверить результат с записью на нем;
в) произвести пробу на совместимость по группам крови АВО (см. Раздел I и III);
г) произвести пробу на совместимость по резус-антигену D (см. разделы I, IV, V, VI).
1. Порядок исследования
Пробы на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D проводятся отдельно и не могут заменить друг друга, так как антитела разного характера требуют разных методов для своего выявления.
Для проб на совместимость используется сыворотка крови реципиента и консервированная кровь или эритроцитная масса донора.
Если больному переливается кровь из нескольких флаконов (контейнеров), пробы на совместимость должны быть сделаны с кровью из каждого флакона (контейнера), даже если на них обозначено, что кровь получена от одного и того же донора.
Сыворотка больного должна быть свежей, полученной в тот же день, когда делается переливание крови, или накануне при условии сохранения ее при температуре 4 - 8 °С. Исключением являются сроки взятия сыворотки для проведения пробы на совместимость у больных с гемотрансфузионными осложнениями (см. раздел VII, п. 9).
2. Получение сыворотки больного и крови донора
Для получения сыворотки у больного берут 4 - 5 мл крови без стабилизатора в пробирку, на которой надписывают фамилию и инициалы реципиента, группу его крови и дату. При этом врач должен лично убедиться в том, что надписи на пробирке сделаны правильно и относятся к тому больному, у которого взята эта кровь.
Через 1 - 2 минуты пробирку с кровью сильно встряхивают для отделения свертка от стенок пробирки или обводят его сухой стеклянной палочкой.
После ретракции свертка от него отделяется сыворотка, которая и служит для пробы на совместимость1.
Кровь донора получают из контейнера, который подготовлен для переливания. Для этого кровь выпускают через иглу в небольшом количестве (5 - 10 капель) в пробирку или на пластинку, на которой будет производиться проба. На пробирке (пластинке) надписывают фамилию, инициалы донора, группу его крови и номер контейнера. При этом врач должен лично убедиться в том, что на пробирке (пластинке) правильно написаны все сведения о доноре, имеющиеся на контейнере, из которого получена эта кровь.
_____________
1 Примечание: если необходимо ускорить отделение сыворотки, пробирку с кровью центрифугируют около 5 мин. при 2000 - 3000 об/мин.
3. Характеристика антител системы АВО и условия проведения пробы на совместимость по группам крови АВО
Антитела системы АВО - альфа и бета - являются врожденными у человека. Они представляют собой агглютинины, вызывающие склеивание несовместимых эритроцитов в прямой реакции между сывороткой и эритроцитами. Эта реакция хорошо протекает на плоскости при температуре около 20 ° и поэтому при этих же условиях производится проба на совместимость по группам крови АВО.
4. Характеристика резус-антител
В отличие от нормальных естественных антител системы АВО антитела антирезус, так же как и другие аллоиммунные антитела, не являются врожденными, а появляются в крови у человека лишь вследствие изоиммунизации и отличаются от антител системы АВО, в частности, тем, что требуют других условий для своего выявления.
Антиэритроцитарные антитела бывают разной формы: полные и неполные. Полные антитела активны при проведении реакции в солевой среде при температуре 37 °; неполные проявляют свое действие в других условиях, которыми являются: проведение реакции в нативной сыворотке с подогревом, добавление различных коллоидов или других реактивов.
5. Способы выявления резус-антител и выбор методики для проведения пробы на совместимость по резус-антигену D
Ввиду того, что при сенсибилизации к резус-антигену D в подавляющем большинстве случаев образуются неполные антитела, а полные антитела образуются редко и почти всегда вместе с неполными, в лечебной практике обычно используются для пробы на совместимость те реакции, которые выявляют именно неполные антитела. Такими пробами являются:
а) проба с применением полиглюкина (раздел IV);
б) проба с применением желатина (раздел V);
в) непрямая проба Кумбса (раздел VI);
г) проба на плоскости при температуре 48 °С (раздел VII).
Все перечисленные пробы выявляют неполные резус-антитела и поэтому в лечебной практике для определения совместимости можно пользоваться любой из них, однако наиболее чувствительными являются непрямая проба Кумбса и проба с применением желатина.
Кроме резус-антител эти пробы выявляют и многие неполные изоиммунные антитела другой специфичности. Поэтому непрямая проба Кумбса и проба с применением желатина особенно рекомендуются как проба на совместимость при переливании крови больным, перенесшим трансфузионную реакцию, и другим сенсибилизированным лицам, чувствительным к введению чужих эритроцитов, хотя и совместимых по группе крови системы АВО и по резус-принадлежности2.
_____________
2 Примечание: при проведении проб на совместимость по резус-антигену D следует учитывать, что если резус-отрицательному больному будет ошибочно выбрана резус - положительная кровь, это может быть выявлено только в том случае, если у реципиента имеются в крови резус-антитела. Выявить различие в резус-принадлежности крови донора и реципиента, если последний не имеет антител, пробы на совместимость не могут.
Проба на совместимость по группам крови АВО производится в течение 5 минут, на плоскости, при комнатной температуре.
Техника
Для исследования следует использовать белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью. На пластинке надписать фамилию, инициалы и группу крови больного, фамилию, инициалы и группу крови донора и номер контейнера с кровью.
На пластинку накапать 2 - 3 капли сыворотки больного и туда же добавить маленькую каплю крови донора так, чтобы соотношение крови и сыворотки было приблизительно 1:10 (для удобства рекомендуется сначала спустить через иглу несколько капель крови донора на борт пластинки, а затем оттуда концом сухой стеклянной палочки перенести маленькую каплю крови для перемешивания с сывороткой больного).
Кровь размешать с сывороткой сухой стеклянной палочкой, пластинку слегка покачать, затем на 1 - 2 минуты оставить в покое и снова периодически покачивать, одновременно наблюдая за ходом реакции в течение 5 минут.
Оценка результата
Если в смеси сыворотки больного и крови донора наступила агглютинация эритроцитов - агглютинаты видны сначала в виде мелких, затем крупных комочков на фоне полностью или почти полностью обесцвеченной сыворотки - это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если смесь крови донора и сыворотки больного по истечении 5 минут остается гомогенно окрашенной, без признаков агглютинации, то это означает, что кровь донора совместима с кровью больного в отношении групп крови системы АВО.
Кровь донора с кровью реципиента несовместима.
Кровь донора с кровью реципиента совместима.
Рисунок 1. Оценка результата пробы на совместимость по группам АВО.
Следует помнить, что при несовместимости по группам крови АВО агглютинация наступает обычно в течение первой минуты, но при низком титре антител у больного, а также при слабо выраженной активности агглютиногена у донора (например, подгруппа А2), агглютинация может наступить значительно позже, иногда только к концу 5-й минуты.
При некоторых патологических состояниях, например при ожогах, циррозах печени, при септико-пиемических состояниях, сыворотка больных приобретает свойство вызывать неспецифическое склеивание эритроцитов в так называемые монетные столбики, симулирующие агглютинацию, поэтому выбор совместимой крови таким больным бывает затруднен.
В этих случаях следует вновь проверить групповую принадлежность крови донора и больного и, если в этом отношении не было ошибки и кровь выбрана правильно, проверить результат пробы на совместимость микроскопически при подогревании и добавлении изотонического раствора NаСl. Для этого снова произвести пробу и, если при микроскопии видны не агглютинаты из эритроцитов, а "монетные столбики", и при последующем добавлении 2 - 3 капель изотонического раствора NаСl и подогревании до 37 °С они расходятся и эритроциты располагаются в виде гомогенной взвеси - можно считать кровь донора совместимой в отношении групп крови системы АВО.
После того, как установлена совместимость по группам крови системы АВО, врач должен убедиться, что кровь донора совместима с кровью больного также в отношении резус-антигена D, для чего произвести еще одну из проб на совместимость: пробу с 33 %-ным раствором полиглюкина (раздел IV), пробу с применением желатина (раздел V) или непрямую пробу Кумбса (раздел VI), пробу на плоскости при температуре +48 °С (раздел VII).
Проба проводится в пробирке без подогрева в течение 5 минут. Для пробы применяется 33 %-ный раствор полиглюкина, приготовленный специально для лабораторных целей.
Техника
Для исследования использовать центрифужную или любую другую пробирку емкостью не менее 10 мл.
На пробирке надписать фамилию, инициалы, группу крови больного и донора, номер контейнера с кровью.
На дно пробирки пастеровской пипеткой внести 2 капли сыворотки больного, одну каплю донорской крови, одну каплю 33 % раствора полиглюкина и перемешать содержимое путем встряхивания.
Пробирку наклонить почти до горизонтального положения, затем медленно поворачивать таким образом, чтобы содержимое ее растекалось по стенкам. Такое растекание содержимого пробирки по стенкам делает реакцию более выраженной.
Контакт эритроцитов с сывороткой больного при поворачивании пробирки следует продолжать не менее 3 минут. Через 3 - 5 мин. в пробирку долить 2 - 3 мл изотонического раствора NaCl и перемешать содержимое путем 2 - 3-х-кратного перевертывания пробирки. (Не взбалтывать!)
Оценка результата
Если в пробирке наблюдается агглютинация эритроцитов в виде взвеси мелких или крупных комочков иногда хлопьевидной формы на фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости, это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в нем не наблюдается признаков агглютинации эритроцитов, это значит, что кровь донора совместима с кровью больного в отношении резус-антигена D.
Кровь донора несовместима с кровью реципиента.
Кровь донора совместима с кровью реципиента.
Рисунок 2. Оценка результата пробы на совместимость с применением 33 % раствора полиглюкина.
Проба производится в пробирке при температуре 46 - 48 °С в течение 10 - 15 минут.
Техника
Для исследования использовать центрифужную или любую другую пробирку емкостью не менее 10 мл.
На пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови больного и донора, и номер контейнера с кровью.3
На дно пробирки при помощи пипетки поместить одну маленькую каплю эритроцитов донора, затем туда накапать две капли подогретого до разжижения 10 % раствора желатина и 1 - 2 капли сыворотки больного. Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед употреблением. При помутнении или появлении хлопьев желатин непригоден.
Содержимое пробирки перемешать путем встряхивания и поместить ее в водяную баню или в горизонтальном положении в термостат при 46 - 48 °С на 15 мин.
После инкубации долить в нее 5 - 8 мл изотонического раствора NаСl, содержимое пробирки перемешать 1 - 2-кратным перевертыванием ее и просмотреть на свет невооруженным глазом и затем путем микроскопирования.
_____________
3 Примечание: для удобства рекомендуется сначала выпустить из флакона через иглу несколько капель крови донора в другую пробирку, а затем оттуда пастеровской пипеткой перенести маленькую каплю в пробирку.
Оценка результата
Если в пробирке наблюдается агглютинация эритроцитов - эритроциты видны в виде взвеси мелких, реже крупных комочков на фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости - это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в нем не наблюдается каких-либо признаков агглютинации, это значит, что кровь донора совместима с кровью реципиента (см. рис.3).
Кровь донора и реципиента несовместима.
Кровь донора и реципиента совместима.
Рисунок 3. Оценка результата пробы на совместимость по резус - фактору с применением 10 % раствора желатина.
Непрямая проба Кумбса, как проба на совместимость переливаемой крови, производится путем инкубации сыворотки больного с эритроцитами донора в течение 45 минут при 37 °С с последующим отмыванием их, добавлением специального реактива (сыворотки для пробы Кумбса) и наблюдением в течение 20 мин4.
_____________
4 Примечание: в этой пробе агглютинация сенсибилизированных эритроцитов происходит за счет иммунных антител против белка крови человека, находящихся в сыворотке для пробы Кумбса. Последняя приготавливается из крови животных, предварительно иммунизированных сывороткой крови человека.
Техника
Пробирку с кровью донора долить до верха изотоническим раствором NаСl и перемешать содержимое путем перевертывания пробирки. Пробирку центрифугировать около 5 мин. до оседания эритроцитов, после чего отсосать надстой жидкости и снова повторить процедуру отмывания эритроцитов.
На другой центрифужной или любой небольшой пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови больного и донора и номер флакона с кровью. На дно этой пробирки при помощи пастеровской пипетки перенести из первой пробирки одну маленькую каплю (0,05 мл) отмытых эритроцитов донора и добавить к ним 3 капли сыворотки больного.
Сыворотку перемешать с эритроцитами встряхиванием пробирки, после чего поставить ее в термостат при 37 °С на 45 минут.
Через 45 минут пробирку вынуть из термостата, долить в нее до верха изотонический раствор NаСl, перемешать содержимое и центрифугировать до осаждения эритроцитов. Такое отмывание произвести 2 раза, а если используется видалевская или еще меньшая пробирка - 3 - 4 раза, каждый раз тщательно отсасывая отмывную жидкость.
К отмытым, плотно осевшим эритроцитам добавить 4 - 6 капель изотонического раствора NаСl для получения приблизительно 5 % взвеси эритроцитов.
Одну каплю 5 % взвеси эритроцитов перенести на белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью, добавить туда 1 - 2 капли сыворотки для пробы Кумбса и перемешать капли стеклянной палочкой.
Пластинку слегка покачать, затем на 1 - 2 минуты оставить в покое и снова периодически покачивать, одновременно наблюдая за ходом реакции в течение 20 минут.5
_____________
5 Примечание: при несовместимости в непрямой пробе Кумбса агглютинация обычно наступает в течение первой минуты. Однако следует помнить, что при низком титре резус-антител (или других антител) агглютинация может наступить значительно позже, иногда к концу 20-й минуты.
Оценка результата
Если добавление сыворотки для пробы Кумбса вызовет агглютинацию эритроцитов - агглютинаты видны в виде комочков на просветленном или полностью обесцвеченном фоне - это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если взвесь эритроцитов осталась гомогенно окрашенной, без признаков агглютинации, это значит, что кровь донора совместима с кровью больного в отношении резус-антигена D, а также в отношении других изоантигенов, к которым могли образоваться изоиммунные антитела неполной формы.
В районах, где до настоящего времени использовалась только проба на совместимость на чашке Петри, временно допускается сохранение этой пробы в период перехода на пробы с применением 10 % раствора желатина или 33 % раствора полиглюкина или использования непрямой пробы Кумбса.
1. Общие сведения
Выше было сказано, что, кроме антигенов системы АВО и резус-антигена D, причиной несовместимости при переливании крови могут быть другие антигены системы резус или антигены других систем. Это может произойти в тех случаях, когда кровь переливается сенсибилизированному больному, имеющему в крови антитела против этих антигенов.
Для решения вопроса о возможной сенсибилизации больного к различным антигенам первостепенное значение имеет трансфузионный и акушерский анамнез. Наличие в анамнезе указаний на возможную сенсибилизацию (см. п. 4) требует дальнейшего исследования крови реципиента (см. п. 5) и, если будут найдены антитела, специального выбора или индивидуального подбора крови (см. п. 6, 7). Следует отметить, что многие изоиммунные антитела выявляются теми же методами, что и антитела анти-D, некоторые - так же как антитела системы АВО. Поэтому несовместимость крови донора в отношении этих антител может быть выявлена уже при выполнении проб на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D.
2. Значение пробы на совместимость по группам крови АВО для выявления других антител
В некоторых случаях в крови у людей образуются изоиммунные антитела анти-М и анти-N. Эти антитела в большинстве случаев активны в тех же условиях, что и антитела системы АВО, т.е. вызывают агглютинацию эритроцитов на плоскости при комнатной температуре. Поэтому, если у больного имеются антитела анти-М или анти-N, а эритроциты донора содержат эти факторы, то несовместимость по отношению к ним выявится при пробе на совместимость по группам крови АВО. Кровь такого донора не должна быть перелита этому реципиенту.
В таких случаях кровь реципиента необходимо исследовать в лаборатории на изоиммунные антитела. Предварительно следует проверить правильность определения группы крови и резус-принадлежности. Если состояние больного не позволяет отложить трансфузию до получения результатов исследования специфичности антител, следует попытаться найти совместимую кровь путем проведения проб на совместимость с несколькими образцами крови донора.
3. Значение проб на совместимость по резус-антигену для выявления других антител
При проведении проб на совместимость по резус-антигену D можно выявить также неполные изоиммунные антитела к другим антигенам системы резус: С, Е, с, е, а иногда и к антигенам других систем эритроцитов. С этой точки зрения наиболее чувствительными являются непрямая проба Кумбса и проба с желатином, при помощи которых выявляются неполные антитела ко всем антигенам системы Резус, системам Келл-Челлано, Даффи, Кидд и некоторым другим. Следовательно, если в крови реципиента имеются такие антитела, то проба Кумбса и проба с желатином выявит несовместимость крови донора, в которой содержатся эти антигены. Кровь такого донора де должна быть перелита этому реципиенту.
Для уточнения специфичности антител и выбора совместимого донора кровь реципиента необходимо исследовать в специализированных лабораториях. Предварительно следует проверить правильность определения группы крови и резус-принадлежности. Если состояние больного не позволяет отложить трансфузию до получения результатов исследования специфичности антител, следует попытаться найти совместимую кровь путем проведения проб на совместимость с несколькими образцами крови доноров.
4. Учет трансфузионного и акушерского анамнеза
Если больной получал трансфузии крови, одноименной или совместимой по группам крови системы АВО и резус-принадлежности D, но несмотря на это, трансфузии сопровождались реакциями или осложнениями, это указывает на возможную сенсибилизацию больного к другим антигенам системы резус или к антигенам других систем и на несовместимость для него крови, содержащей эти антигены.
Если женщина имела беременности, закончившиеся рождением детей с гемолитической болезнью или рождением мертвых плодов, и кровь этой женщины резус-положительная или резус-отрицательная, но не содержит антител анти-D, то это также указывает на возможную сенcибилизацию женщины к какому-либо другому антигену системы резус или других систем и на несовместимость для нее крови, содержащей эти антигены.
В таких случаях кровь реципиента должна быть заблаговременно исследована на наличие изоиммунных антител.
5. Исследование крови на наличие изоиммунных антител
Определение изоиммунных антител производится специалистами - серологами в учреждениях службы крови (отделениях, станциях переливания крови), располагающих стандартными эритроцитами различной фенотипической структуры. Для этой цели удобно пользоваться эритроцитами группы О(I). Среди них должны быть образцы эритроцитов резус-отрицательные и резус-положительные различного фенотипа: СсDЕе, СсDее, ССDее, ссDЕе, ссDЕЕ, ссDее, Ссddее, ссddЕе.
Среди резус-положительных эритроцитов целесообразно иметь образцы гомозиготные и гетерозиготные по антигенам С и Е, т.е. содержащие и не содержащие антигены с и е.
Среди резус-отрицательных эритроцитов следует иметь образцы различные по антигенам системы Даффи, Келл-Челлано, Кидд. Кроме того, все стандарты должны быть типированы по системе MNSs, Рр, Левис и др.
Ввиду того, что изоиммунные антитела могут быть как полной, так и неполной формы, их следует выявлять, используя разные методы при различных температурных режимах. Для выявления неполных антител необходимо проводить непрямую пробу Кумбса или реакции с использованием коллоидов (желатин, полиглюкин). Для выявления полных антител проводят реакцию солевой агглютинации при разных температурах: 37 °, 20 °, 4 °С.
Заключение о наличии, а также о форме и специфичности антител делают по результатам реакции во всех методах.
Форма антител. Если положительная реакция выявилась с различными образцами эритроцитов только при проведении непрямой пробы Кумбса (или реакции с применением желатина или полиглюкина), это значит, что в исследованной сыворотке содержатся только неполные антитела.
Если положительная реакция выявилась при непрямой пробе Кумбса (или в реакции с применением желатина или полиглюкина) и одновременно в реакции солевой агглютинации, это значит, что в сыворотке содержатся как неполные, так и полные антитела. Полные антитела могут быть тепловыми, тогда положительный результат выявится при температуре 37 °С или холодовыми, давшими положительный результат при 20 °С или 4 °С.
Если сыворотка дала положительный результат только в реакции солевой агглютинации в пробирках, это значит, что она содержит только полные антитела - тепловые или холодовые (в зависимости от того, при какой температуре выявилась агглютинация).
Если агглютинация эритроцитов не наблюдается ни в одной из этих проб, это говорит об отсутствии как полных, так и неполных изоиммунных антител к антигенам, содержащимся в стандартных эритроцитах, которые были использованы при этом исследовании.
Специфичность антител устанавливается в зависимости от результатов реакции со стандартными эритроцитами, содержащими разные антигены. Это заключение необходимо сделать для полных и неполных антител в отдельности.
Большую роль при определении специфичности антител может сыграть определение антигенной структуры эритроцитов самого больного. Если такое исследование было возможным, то это очень облегчит решение вопроса о специфичности антител, так как у больного могут быть антитела только к тем антигенам, которые не содержатся в его собственной крови.
Неполные антитела в одной и той же сыворотке могут иметь как одну, так и различную специфичность.
При одновременном присутствии в сыворотке неполных и полных антител они также могут быть одной или различной специфичности.
Полные антитела большей частью бывают моноспецифичными.
Таким образом, исследование сыворотки больного с применением разных методов при наличии стандартных эритроцитов, типированных по различным изоантигенам, позволяет решить вопрос о характере иммунизации.
Если у больного выявлены изоиммунные антитела, то, зная их специфичность, можно обеспечить совместимость при переливании крови специальным выбором донора (см. п. 6).
Если у больного выявлены антитела, но определить их специфичность невозможно, например, из-за недостаточного набора стандартных эритроцитов, совместимость переливаемой крови можно обеспечить индивидуальным подбором донора (см. п. 7).
6. Специальный выбор донора
Специальный выбор донора (донорской крови) производится на СПК или ОПК в тех случаях, когда установлена форма и специфичность имеющихся у больного антител, а на СПК или ОПК имеются доноры, типированные по этим антигенам. Выбор производится из числа лиц одногруппных по системе АВО и резус-принадлежности.
Если предполагается переливать эритроциты, освобожденные от плазмы, можно использовать также и разногруппную кровь, но совместимую в отношении эритроцитов донора.
В этих случаях эритроциты группы О(I) можно переливать реципиентам любой группы, а реципиентам группы АВ(IV) - эритроциты любой группы крови, но в обоих случаях одноименные по резус-принадлежности.
Далее выбираются доноры, не содержащие в крови антигенов, против которых у больного обнаружены антитела. После такого специального выбора донора, эритроциты которого не содержат антигенов, против которых у больного выявлены изоиммунные антитела, кровь этого донора следует проверить в пробах на совместимость с сывороткой больного с обязательным включением того метода, в котором оказались активными антитела больного. Затем, при благоприятном результате этих исследований, от донора заготавливается кровь (или берется кровь, заготовленная от него ранее) и передается в лечебное учреждение специально для этого больного.
Несмотря на специальный выбор крови, врач должен перед трансфузией провести все контрольные исследования, предусмотренные в разделе I, IX и только после этого он может приступить к переливанию крови, начав его с биологической пробы.
В тех случаях, когда СПК или ОПК не располагают кровью доноров, типированных как необходимо для конкретного больного, подбор крови такому сенсибилизированному больному следует проводить индивидуально.
7. Индивидуальный подбор донора
Индивидуальный подбор донора (донорской крови) производится по следующим показаниям:
а) в тех случаях, когда трансфузиолог обнаружил несовместимость в пробах по группам крови АВО или резус-антигену и контрольная проверка исключает ошибки в отношении этих антнгенов и если при этом состояние больного позволяет отложить трансфузию, чтобы дополнительно исследовать кровь на изоиммунные антитела.
Подбор осуществляют, используя ту же реакцию, с помощью которой обнаружены антитела. Если агглютинация наблюдалась при проведении пробы на совместимость по группам крови АВО, то подбор крови следует вести на плоскости при комнатной температуре. Если агглютинация наблюдалась при проведении пробы на совместимость по резус-антигену D, то подбор следует проводить, используя непрямую пробу Кумбса или реакции с использованием коллоидов (раздел IV, V).
Когда будет подобрана кровь, не дающая агглютинации с сывороткой больного, следует провести с ней все другие реакции, предусмотренные при переливании. В тех случаях, когда для переливания подбиралась кровь из флакончиков-спутников, врач должен повторить все исследования, взяв кровь непосредственно из контейнера, подготовленного для трансфузии. При отсутствии признаков несовместимости врач может приступить к переливанию крови, начав его с биологической пробы.
Следует учесть, что если несовместимость выявлена только по группам крови АВО, а контрольные пробы исключают ошибку по этим антигенам, то это чаще всего бывает за счет антител анти-М или анти-N и подобрать совместимую кровь в этих случаях удастся обычно уже среди 5 - 6 образцов. Если несовместимость выявилась из-за наличия неполных антител, подбор может оказаться более трудным, но все же, если трансфузия срочная, можно попытаться найти совместимую кровь.
б) индивидуальный подбор проводится также в тех случаях, когда определены наличие и специфичность изоиммунных антител в крови больного, но СПК и ОПК не имеет возможности специально выбрать кровь из-за отсутствия типированного донора с подходящей для данного больного антигенной структурой. Подбор в этих случаях проводится с кровью, взятой из флакончиков-спутников, или с кровью, полученной непосредственно у доноров из пальца. Начинать подбор следует, используя ту реакцию, в которой оказались активными изоиммунные антитела. Если выявлены полные антитела, то следует учитывать и температуру, при которой они оказались активными.
Вероятность нахождения совместимой крови в таких случаях зависит от специфичности антител. При антителах с или е подбор следует вести из числа резус-положительных доноров. При этом обычно удается довольно быстро найти с-отрицательную кровь (16 %), но значительно труднее е-отрицательную ввиду редкой встречаемости лиц, не содержащих этого фактора (2,5 %).
Большая или меньшая трудность подбора крови при антителах другой специфичности будет зависеть также от частоты факторов, к которым направлены антитела. Особенно затруднен подбор бывает при наличии антител к фактору Челлано, выявленному у 99,85 % лиц, а также в случае сочетания антител разной специфичности.
После такого индивидуального подбора кровь, заготовленная от доноров, передается в лечебное учреждение для переливания данному больному.
в) индивидуальный подбор крови донора следуют проводить также в тех случаях, когда у больного выявлены изоиммунные антитела, но не установлена их специфичность. Это может быть связано с ограниченностью на СПК (ОПК) образцов стандартных эритроцитов, типированных по изосеропогическим системам, а также, возможно, с наличием в крови больного антител к неизвестному до этого времени антигену. Подбор в таких случаях следует проводить, используя кровь из флакончиков-спутников или кровь, полученную непосредственно у донора из пальца, начиная его той же реакцией, с помощью которой оказались активными антитела больного. В таких случаях решить заранее вопрос, среди каких доноров легче подобрать кровь, бывает трудно. После такого индивидуального подбора кровь передается в лечебное учреждение для переливания данному больному.
8. Использование подобранной крови
Как специальный, так и индивидуальный подбор крови, производимой на СПК (ОПК), является предварительной процедурой. Врач-трансфузиолог, получив флакон с кровью, должен во избежание ошибки сверить паспортные данные на флаконе с данными о крови больного в истории болезни, произвести контрольные реакции - определение группы крови больного и донора и пробы на совместимость. При совпадении группы крови и резус-принадлежности больного и донора и отсутствии агглютинации в пробах на совместимость, врач может приступить к переливанию крови, начав его с биологической пробы.
9. Особенности пробы на совместимость у больных с гемотрансфузионными осложнениями.
У больных, перенесших гемотрансфузионное осложнение, происходят характерные серологические сдвиги, заключающиеся в том, что в период до 10 - 20-го дня идет нарастание сенсибилизации, выражающееся в повышении титра антител, послуживших причиной осложнения, и в появлении антител другой специфичности. После 20-го дня начинается постепенное снижение титра антител и исчезновение их в порядке, обратном появлению. Поэтому таким больным в период нарастания сенсибилизации пробу на совместимость следует проводить с сывороткой, полученной от них непосредственно в день проведения трансфузии крови или не далее чем накануне. При переливании крови после 20-го дня, кроме этой пробы, желательно дополнительно проводить пробу на совместимость с порцией сыворотки, заготовленной на высоте сенсибилизации (10 - 20-й день). Это дает возможность предупредить переливание больному крови, содержащей антиген, против которого у него совсем недавно имелись антитела.
Врач, переливающий кровь, обязан записать в историю болезни:
1) паспортные данные с каждого контейнера с кровью - фамилию и инициалы донора, группу крови, резус-принадлежность, номер контейнера и дату заготовки крови;
2) результат контрольной проверки групповой принадлежности крови больного;
3) результат контрольной проверки групповой принадлежности крови донора, взятой из контейнера;
4) результат пробы на совместимость по группам крови АВО;
5) метод и результат пробы на совместимость по резус-антигену D.
Записи скрепляются подписью врача.
Самыми важными показателями, позволяющими судить о совместимости переливаемой крови (эритроцитов) являются совместимость по группе крови системы АВО и совместимость по резус-антигену D.
Для обеспечения совместимости переливаемой крови необходимо на основании определения группы крови реципиента и записи в истории болезни, а также документации на контейнере с кровью, правильно выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО и резус-принадлежности (см. раздел I. п. 6, 7).
Непосредственно перед переливанием крови, независимо от проведенных ранее исследований и имеющихся записей, врач обязан снова проверить групповую принадлежность реципиента и крови донора (раздел 1.9), сделать пробу на совместимость по группам крови АВО (раздел III) и одну из проб на совместимость по резус-антигену D (разделы IV, V, VI, VII).
Врач должен предусмотреть возможную несовместимость по отношению к другим антигенам и принять меры для ее предупреждения.
Если кровь (эритроциты) донора оказалась несовместимой с кровью реципиента в пробе на совместимость по группам АВО или в пробе на совместимость по резус-антигену D, она не должна быть ему перелита!
Если кровь (эритроциты) донора оказалась совместимой с кровью реципиента в пробах на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D и нет указаний на несовместимость по отношению к другим антигенам - кровь (эритроциты) может быть перелита.
Переливание начинается с биологической пробы.
Ответственным за выполнение перечисленных требований и обеспечение совместимости при переливании крови является врач специалист переливающий кровь.
"Инструкцию по предупреждению несовместимости при переливании крови", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 5 декабря 1990 года № 05-14/37-14, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
Стандартными изогемагглютинирующими сыворотками являются сыворотки, приготовленные из крови людей и некоторых других жидкостей, содержащие групповые антитела (агглютинины). Сыворотки предназначаются для определения групповой принадлежности крови людей по системе АВО.
Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки представляют собой прозрачную жидкость, окрашенную в соответствии с групповой принадлежностью, и расфасованную в ампулы или флаконы. На этикетке указывают названия учреждения, изготовившего сыворотку, специфичность, титр агглютининов и срок годности.
Источниками для получения стандартных сывороток служат:
а) Кровь, заготовленная без консерванта от донора, предварительно обследованного и содержащего в крови групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток;
б) плазма, полученная при проведении плазмафереза или отделенная из донорской крови, по каким-либо причинам не использованная для лечебных целей и содержащая групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток;
в) дополнительный источник - плевральный транссудат, асцитическая жидкость, если в них содержатся групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток.
К стандартной изогемагглютинирующей сыворотке предъявляются следующие требования:
а) сыворотка должна быть специфичной, то есть содержать определенные групповые антитела - альфа (анти-А), бета (анти-В) или оба антитела вместе, и не вызывать неспецифической агглютинации эритроцитов одноименной группы и группы О(I). Сыворотка группы АВ(IV), не содержащая групповых агглютининов, не должна вызывать агглютинации;
б) должна быть активной, что выражается в наступлении первых признаков агглютинации со стандартными эритроцитами групп А1 и В в течение первых 30 секунд и со стандартными эритроцитами группы А2 в течение первой минуты и титром агглютининов по отношению к эритроцитам групп А1 и В не ниже, чем 1:32 и группы А2 - не ниже, чем 1:16.
в) не должна оказывать на эритроциты гемолизирующего действия;
г) должна быть прозрачной. Допускается небольшая опалесценция, что не влияет на качество сыворотки;
д) должна быть окрашена: группа А(II) - в светлосиний цвет, группа В (III) - в красный цвет, группа АВ(IV) - в желтый цвет;
е) должна быть предохранена от инфицирования прибавлением консервирующих средств;
ж) должна иметь точную паспортизацию, т.е, обозначение групповой принадлежности, титра, срока годности, номера серии и наименования учреждения, ее изготовившего. Все эти сведения должны быть обозначены на этикетке, наклеиваемой на флакон (ампулу) со стандартной сывороткой, а также внесены в "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки", в который записывают также сведения о дате изготовления сыворотки и результатах контрольных проверок ее качества.
1. Предварительное определение пригодности крови донора для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки путем взятия от него крови и отделения от нее сыворотки или путем получения плазмы с помощью проведения плазмафереза. Исследования производятся заранее в пробной порции крови, полученной непосредственно от донора в небольшом количестве.
2. Взятие крови от донора, отделение от нее сыворотки или получение плазмы от донора при помощи плазмафереза.
3. Предварительное определение пригодности плазмы, предполагаемой для передачи в сывороточное отделение для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
4. Обработка плазмы для получения из нее сыворотки.
5. Сбор остатков крови из флакончиков (пробирок) - спутников в общую емкость, отделение от нее сыворотки (плазмы) и предварительное определение пригодности для изготовления стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
6. Получение в лечебных учреждениях асцитической жидкости, плеврального транссудата, освобождение их от сгустков фибрина и предварительное определение пригодности этого материала для изготовления из него стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
7. Определение пригодности сыворотки, плазмы для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки, включающее:
а) определение групповой принадлежности сыворотки (групповых агглютининов);
б) определение способности сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию;
в) определение гемолизирующих свойств сыворотки;
г) определение активности сыворотки;
д) скорость наступления агглютинации;
е) титр агглютининов.
8. Предварительное заключение о пригодности сыворотки.
9. Консервирование сыворотки.
10. Первый контроль сыворотки до розлива.
11. Второй контроль сыворотки до розлива.
12. Фильтрование сыворотки.
13. Окрашивание сыворотки.
14. Окончательное заключение о пригодности сыворотки.
15. Розлив сыворотки.
16. Паспортизация разлитой сыворотки.
17. Контроль разлитой сыворотки.
1. Определение групповой принадлежности сыворотки при помощи стандартных эритроцитов.
Определение производится на белой фарфоровой или любой другой белой пластинке со смачиваемой поверхностью, на которой надписывают обозначения: слева "О", в середине "А" и справа "В". Соответственно каждому обозначению на пластинку наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп O(I), А(II) и В(III). На каждую каплю эритроцитов капают одну большую каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки с тем, чтобы соотношение количества эритроцитов и сыворотки было приблизительно 1:10. Эритроциты перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, пластинку слегка покачивают, затем на 1 - 2 минуты оставляют в покое, потом снова покачивают и одновременно наблюдают результат. Наблюдение проводят в течение 5 минут. Через 3 - 5 минут в каждую каплю, в которой наступила агглютинация, добавляют 1 каплю (0,1 мл) изотонического раствора NаСl и снова покачивают пластинку.
Результат учитывают по наличию или отсутствию агглютинации в каждой капле. При этом возможны четыре варианта:
- агглютинация наступила с эритроцитами групп А(II) и В(III), но отсутствует с эритроцитами группы О(I). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке двух агглютининов альфа (анти-А) и бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Оальфа бета(I);
- агглютинация наступила с эритроцитами группы В(III) и отсутствует с эритроцитами групп О(I) и А(II). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Абета(II);
- агглютинация наступила с эритроцитами группы А(II) и отсутствует с эритроцитами групп О(I) и В(III). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина альфа (анти-А), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Вaльфа(III);
- агглютинация отсутствует с эритроцитами всех трех групп. Это указывает на отсутствие групповых агглютининов, т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе АВ(IV).
2. Определение способности сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию.
Эти исследования можно проводить одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов.
Дополнительно в исследование включают 6 - 8 образцов эритроцитов группы О(I) и одногруппных с исследуемой сывороткой.
Наблюдение результатов с эритроцитами одноименной группы и группы О(I) проводят до 20 минут.
Если испытуемая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов одноименной группы и группы О(I), это значит, что она обладает свойством вызывать неспецифическую агглютинацию. В этих случаях учитывают скорость ее наступления и интенсивность.
3. Определение гемолизирующих свойств сыворотки.
Гемолизирующие свойства сыворотки выявляются одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов. Если при смешивании с эритроцитами сыворотка вызывает их гемолиз, значит, сыворотка обладает гемолизирующими свойствами.
4. Определение скорости наступления агглютинации.
Скорость наступления агглютинации определяют так же, как групповую принадлежность - при помощи стандартных эритроцитов, но с дополнительным включением в реакцию стандартных эритроцитов группы А2. Скорость наступления агглютинации учитывают с помощью секундомера от момента перемешивания сыворотки с эритроцитами до момента наступления первых признаков агглютинации отдельно по отношению к эритроцитам групп А1, А2 и В.
5. Определение титра агглютининов.
Для определения титра агглютининов в исследуемой сыворотке приготавливают разведения ее в изотоническом растворе NаСl. Для этого в штатив ставят 10 пробирок и в каждую из них вносят градуированной пипеткой по 1 мл изотонического раствора NаСl. Затем в первую пробирку той же пипеткой добавляют 1 мл испытуемой сыворотки и перемешивают ее с изотоническим раствором путем встряхивания пробирки. Из этой пробирки 1 мл смеси переносят во вторую и снова перемешивают и так до последней пробирки. В результате в пробирках образуются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
Непосредственно на пластинке можно приготовить разведения сыворотки в арифметической прогрессии. Для этого следует сделать в пробирке первое исходное разведение (любое).
Например, к одной капле сыворотки добавить 15 капель изотонического раствора хлорида натрия, получив таким образом разведение 1:16. Эту разведенную сыворотку нанести в 6 пронумерованных точек на пластинку: в первую точку - 2 капли, во вторую, третью и все последующие - по 1 капле. Затем добавить изотонический раствор: во вторую точку - 1 каплю, в третью - 2 капли, в четвертую - 3 капли, в пятую - 4 капли, в шестую - 5 капель. Капли перемешивают стеклянной палочкой, начиная с последней точки в направлении к первой. Так получают разведения сыворотки на пластинке: 1:16, 1:32, 1:48, 1:64, 1:80, 1:96.
При определении титра агглютинина альфа2 по отношению к эритроцитам А2 приготавливают дополнительно промежуточное разведение сыворотки 1:24.
Разведения сыворотки можно приготовить, отмеряя сыворотку и изотонический раствор NаСl каплями, для чего используют одну и ту же пипетку.
На пробирках отмечают степень разведения сыворотки. Далее 0,1 мл (одну большую каплю) каждого разведения сыворотки переносят на пластинку, предварительно надписав на ней обозначения степени разведения сыворотки: 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024
Разведения сыворотки можно приготавливать также непосредственно на пластинке. Для этого в десять пронумерованных точек наносят по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NаСl, в первую точку добавляют одну каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки, перемешивают капли, затем той же пипеткой переносят одну каплю смеси во вторую точку и т.д. до десятой, получая таким образом разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
На пластинку рядом с каждой каплей разведенной сыворотки наносят маленькую каплю (0,01 мл) стандартных эритроцитов соответствующей группы, т.е. эритроциты А, и А2, когда титруют агглютинины альфа и эритроциты группы В, когда титруют агглютинины бета. Соотношение эритроцитов и сыворотки должно быть 1:10.
Каждую каплю стандартных эритроцитов тщательно перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, после чего пластинку покачивают, затем оставляют на 1 - 1,5 минуты в покое, снова покачивают и одновременно наблюдают результат в течение 5 минут.
Наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила агглютинация стандартных эритроцитов до истечения 5 минут, принимают за титр агглютининов в этой сыворотке.
Основным показателем пригодности крови донора для изготовления из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. скорость наступления агглютинации и титр агглютининов.
Скорость наступления агглютинации должна быть не более чем 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В и не более 1 минуты с эритроцитами группы А2.
Титр сыворотки должен быть: для агглютинина альфа не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1, не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам А2, и для агглютинина бета не ниже, чем 1:32 к эритроцитам В.
При предварительном исследовании непосредственно взятой пробной порции крови титр агглютининов должен быть, хотя бы на одно разведение выше, в виду возможного его падения в процессе обработки и консервирования основной порции крови.
Одновременно следует учитывать, не вызывает ли сыворотка крови неспецифической агглютинации или гемолиза эритроцитов.
Если сыворотка вызывает слабую неспецифическую агглютинацию эритроцитов позднее, чем через 2 минуты, то это не является противопоказанием к использованию этой крови, так как эти свойства при дальнейшей обработке сыворотки обычно исчезают.
Если сыворотка вызывает неспецифическую агглютинацию ранее 2 минут, то брать у донора кровь для приготовления стандартной сыворотки не следует.
Гемолизирующих свойств крови у доноров обычно не наблюдается, но если это имеет место, то брать кровь у донора не следует.
В этом случае так же, как и при выраженной неспецифической реакции, донора следует подвергнуть дополнительному медицинскому обследованию.
Доноров, кровь которых соответствует требованиям, предъявляемым к стандартным сывороткам, следует брать на особый учет с целью дальнейшего использования их крови для изготовления стандартных сывороток.
Кровь у донора берут из вены в сухой стерильный сосуд. Через 15 - 30 минут сосуд с кровью встряхивают для отделения свертка от стенки и затем помещают на сутки в холодильник при 4 - 8 °С. Отделившуюся за это время сыворотку отсасывают или сливают в другой сосуд, а сосуд со свертком оставляют еще на одни сутки при 4 - 8 °С. Обычно через одни сутки из свертка отделяется еще некоторое количество сыворотки, которую присоединяют к первой порции. Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 - 3 г на 100 мл сыворотки, или азидом натрия из расчета 1 г на 1 мл сыворотки.
Для ускорения свертывания крови сосуд можно поставить сначала на один час в термостат, а затем в холодильник.
Паспортизация. На сосуде с кровью, а затем с сывороткой надписывают паспортные данные, т.е. фамилию, имя и отчество донора, групповую принадлежность, дату взятия крови, количество крови и полученной из нее сыворотки, а также результат исследования пробной порции крови. Эти же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки" (Дальнейшая обработка см. раздел IХ).
Получение сыворотки из крови, оставшейся во флакончиках (пробирках) - спутниках после взятия ее у доноров.
Для изготовления сыворотки может быть использована кровь из флакончиков (пробирок) - спутников. Для этого остатки крови сливают (каждую группу отдельно) в сухие флаконы. На флаконе надписывают группу крови и дату заготовки.
При получении сыворотки из плазмы из последней удаляется фибрин. Это можно осуществить несколькими способами:
1. К плазме прибавляют раствор хлорида кальция из расчета 3 мл 20 % или 6 мл 10 % на 100 мл плазмы. Через 30 - 40 минут во флаконе образуется сверток. Если сверток пристал к стенке, то флакон следует встряхнуть, чтобы сверток отделился. Флакон с содержимым оставляют на двое суток в холодильнике, после чего отделившуюся сыворотку переливают через воронку с марлей в другой флакон. Сыворотку консервируют и на флакон переносят паспортные данные.
Иногда во флаконе с сывороткой через некоторое время снова выпадает сверток фибрина; в этих случаях сыворотку еще раз переливают через воронку с марлей (с тканью) в другой флакон.
2. К плазме добавляют равный объем одногруппной сыворотки с титром антител не ниже 1:32. Содержимое флакона перемешивают, оставляют на одни сутки при комнатной температуре и затем помещают в холодильник на 10 - 14 дней. На паспорте флакона дописывают сведения о дате и количестве добавленной сыворотки.
За 10 - 14 дней образуется плотный сверток фибрина и, кроме того, может исчезнуть свойство вызывать гемолиз или неспецифическую, агглютинацию эритроцитов.
Отделившуюся сыворотку сливают в другой флакон через воронку с тканью, сыворотку консервируют, на флакон наносят паспортные данные.
Паспортизация. Паспортные записи о плазме переносят с флакона на флакон по мере отделения сыворотки. К ним добавляют запись о дате получения сыворотки. Те же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".
Дальнейшая обработка сыворотки (см. раздел IХ).
В тех случаях, когда в процессе лечения больному делается пункция грудной или брюшной полости с целью удаления жидкости, последнюю можно использовать для изготовления стандартной сыворотки. Для этого жидкость собирают в чистую посуду. По доставлении в лабораторию жидкость переливают во флакон через воронку с марлей или тканью для отделения свертка (если он имеется) и консервируют борной кислотой или азидом натрия, как указано выше.
Паспортизация. На флаконе надписывают сведения о том, из чего сыворотка приготовлена, и дату. Те же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".
1. Серологические исследования.
В сыворотке определяют:
а) групповую принадлежность (групповые агглютинины);
б) гемолизирующие свойства;
в) способность вызывать неспецифическую агглютинацию;
г) активность, т.е. скорость наступления агглютинации и ее выраженность;
д) титр агглютининов.
Методы исследования (см. раздел IV)
На основании этих исследований делают предварительное заключение о пригодности сыворотки. Основными показателями являются скорость наступления агглютинации и титр антител.
2. Сыворотку предварительно считают пригодной, если она вызывает агглютинацию эритроцитов групп А1 и В не позднее чем через 30 секунд, а эритроцитов группы А2 не позднее чем через 1 минуту, и если титр агглютининов в ней не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам групп А1 и В и не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам группы А2.
При этом также следят за тем, чтобы сыворотка не имела красной или бурой окраски.
Если агглютинация наступает позднее или титр агглютининов ниже, сыворотку считают непригодной.
Наличие неспецифической агглютинации или гемолизирующих свойств на этой стадии изготовления сыворотки не делает ее непригодной, что позволяет сохранить до 1-го контроля (раздел ХI).
3. Паспортизация. Результаты всех исследований, перечисленных в этом разделе, записывают на флаконе с сывороткой и в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной cыворотки".
Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у донора, и сыворотку, полученную из любого другого источника и признанную предварительно годной, консервируют.
Наиболее пригодным консервантом является борная кислота, которую прибавляют из расчета 2 - 3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия 1 г на 1 мл.
После прибавления консерванта сыворотку оставляют на срок 10 - 12 дней. За этот срок в ней, с одной стороны, может снизиться титр агглютининов, с другой - исчезнуть свойство вызывать гемолиз или неспецифическую агглютинацию, если это имело место. Сыворотку, имеющую высокий титр агглютининов, разрешается разводить изотоническим раствором NаСl до титра не ниже 1:64 и соответственно количеству разводителя добавляют борную кислоту или азид натрия.
1. Первый контроль производится через 10 - 12 дней после поступления сыворотки, ее предварительного испытания и консервирования. Он заключается в следующем:
а) проверяют правильность паспортизации сыворотки, т.е. сверяют записи на флаконе и в журнале;
б) определяют групповую принадлежность при помощи стандартных эритроцитов и результат сверяют с обозначением группы крови на флаконе и в журнале;
в) одновременно с определением групповой принадлежности проверяют способность сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию и гемолиз эритроцитов;
г) проверяют, нет ли в сыворотке признаков инфицирования, не помутнела и не потемнела ли она;
д) проверяют активность сыворотки, т.е. скорость наступления агглютинации и титр агглютининов;
е) результаты всех исследований записывают на флаконе и в журнал.
2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки делается при следующих условиях: если паспортные записи произведены правильно, в сыворотке нет признаков инфицирования, если она не помутнела, не потемнела и обладает достаточной активностью.
Под достаточной активностью при первом контроле понимают соответствие требованиям, указанным в разделе II.б при условии, что титр не только соответствует этим требованиям, но и не снизился более, чем на два разведения по сравнению с исходными цифрами.
Если сыворотка отвечает этим условиям, ее считают пригодной для дальнейшей обработки и оставляют еще на 10 - 12 дней, после чего производят второй контроль (см. п. ХIV).
При снижении титра более, чем на две ступени (даже если титр сыворотки после снижения остался равным или выше, чем 1:32) сыворотку считают непригодной.
При наличии признаков инфицирования, значительного потемнения и помутнения сыворотку считают непригодной.
При первом контроле сыворотки явления неспецифической агглютинации и гемолизирующие свойства наблюдаются редко, потому что эти свойства обычно исчезают за время хранения сыворотки с консервантом. Если эти свойства все же сохранились, это не делает сыворотку непригодной для дальнейшей обработки, так как при некоторых условиях они могут быть устранены в течение времени, предшествующему второму контролю сыворотки.
Устранение свойства сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию может быть достигнуто путем разбавления ее изотоническим раствором NаСl. Это допускается только для сыворотки групп О(I), А(II) и В(III) и только при высоком титре агглютининов в ней - не ниже, чем 1:64 - и при этом титре не более, чем половинным объемом изотонического раствора по отношению к объему сыворотки (с добавлением соответствующего количества борной кислоты или азида натрия). Предварительно испытывают ряд пробных разведений сыворотки, приготовленных в небольших количествах. Наблюдение проводят в течение 20 мин. После подбора разведения, устраняющего неспецифическую агглютинацию, разводят всю сыворотку.
Если разведение изотоническим раствором NаCl не устраняет неспецифической агглютинации, сыворотку считают непригодной.
Разведение сыворотки группы АВ(IV) не допускается. Сыворотку, вызывающую хотя бы незначительную неспецифическую агглютинацию, считают непригодной.
Для устранения гемолизирующего действия сыворотки ее прогревают при 56 °С в течение одного часа. Если такое прогревание не устраняет гемолизирующего действия, сыворотку считают непригодной.
1. Второй контроль производят через 10 - 12 дней после первого (приблизительно через 20 - 24 дня после начала обработки сыворотки) и проводят так же, как первый контроль (см. раздел ХI).
2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки делают при следующих условиях: если паспортные записи сделаны правильно, сыворотка не инфицирована, не помутнела, не потемнела, не вызывает неспецифической агглютинации и гемолиза эритроцитов и достаточно активна.
Под достаточной активностью при втором контроле понимают соответствие требованиям, указанным в разделе II.б, при условии, что титр не только соответствует этим требованиям, но и не снизился по сравнению с цифрами, полученными при первом контроле.
В других случаях сыворотку считают непригодной.
Для максимального использования сырья и упрощения контроля за образцами разлитой сыворотки допускается смешивание нескольких порций одногруппных сывороток после второго контроля их, до розлива (раздел ХIХ). Предварительно из каждой порции берут по 1 - 2 мл сыворотки и в смеси их определяют титр агглютининов. Затем титр проверяют еще раз через 2 - 3 дня и если он не изменился, то смешивают основные сыворотки. Сыворотку-смесь обозначают новым номером и ее снова испытывают, аналогично второму контролю (раздел ХIV).
Дополнительным условием, предупреждающим ошибки при определении группы крови, является окрашивание сывороток.
Окрашивание можно производить до фильтрации, если предполагается фильтровать сыворотку через бумажный фильтр. При использовании фильтра Зейтца сыворотку окрашивают после фильтрации.
Сыворотку группы А(II) окрашивают в синий (или сине-зеленый) цвет,
сыворотку группы В(III) - в красный цвет,
сыворотку группы АВ(IV) - в желтый цвет (см. дополнение п. ХХХ).
Сыворотку, признанную пригодной, фильтруют. Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у донора, обычно достаточно профильтровать через бумажный фильтр. Сыворотку, полученную из других источников, необходимо фильтровать через фильтр Зейтца со стерилизующей прикладкой. Такое фильтрование просветляет сыворотку и предупреждает развитие инфекции. Немедленно после фильтрования сыворотку окрашивают (см. Дополнение 2).
Окончательное заключение о пригодности сыворотки делают после ее фильтрования.
Сыворотку считают пригодной, если она:
а) специфична, т.е. содержит агглютинины альфа или бета, или оба вместе и не вызывает неспецифической агглютинации эритроцитов;
б) активна, т.е. вызывает первые признаки агглютинации в течение первых 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В, и в течение одной минуты с эритроцитами группы А2 и имеет титр агглютининов не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1 и В и не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам А2.
Для окончательного заключения о пригодности сыворотки, кроме абсолютной величины титра, принимают во внимание его динамику (см. раздел XI, первый контроль и раздел ХIV, второй контроль);
в) не оказывает на эритроциты гемолизирующего действия;
г) прозрачная. Допускается небольшая опалесценция;
д) предохранена от инфицирования консервированием;
е) имеет точную паспортизацию.
При соответствии этим требованиям сыворотке присваивается номер серии и она может быть разлита и выпущена как стандартная изогемагглютинирующая сыворотка для определения групп крови АВО с соответствующей записью в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".
Сыворотку групп О-альфа бета(I), А-бета(II) и В-aльфа(III) разливают во флаконы или ампулы по 1 - 5 мл, сыворотку АВ(IV) - по 0,5 мл.
Запрещается разливать сыворотки разных групп одновременно в одном помещении.
Немедленно после розлива на флаконы (ампулы) наклеивают этикетки. Флаконы закупоривают, ампулы запаивают.
1. Этикетки, наклеиваемые на флаконы (ампулы) с разлитой сывороткой, должны содержать следующие сведения:
а) название учреждения, в котором изготовлена сыворотка;
б) групповую принадлежность сыворотки с обязательным указанием агглютининов;
в) номер серии;
г) титр агглютининов в сыворотке. Титр альфа-агглютинина указывается по отношению к эритроцитам группы А1. Для сыворотки группы О-альфа бета(I) указывается титр только одного агглютинина альфа или бета и из них того, который слабее;
д) срок годности: число, месяц, год;
е) на этикетке наносят по диагонали цветные полосы:
для группы А(II)- две синие,
для группы В(III) - три красные,
для группы АВ(IV) - четыре желтые.
2. Этикетки изготавливают типографским способом, оставляя свободные места для цифровых обозначений (номера серии, титра и срока годности), которые вносят на этикетку к моменту розлива. Форму этикетки - см. Рисунок 1.
3. Сыворотку, разлитую во флаконы (ампулы), регистрируют в "Журнале для регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".
|
Наименование учреждения изготовителя |
|
Наименование учреждения изготовителя |
|
Изогемагглютинирующая сыворотка группы Оальфа бета(I) АНТИ - (А+В) Серия .......................... Титр ……............ мл .............................. годна до ............... |
|
Изогемагглютинирующая сыворотка группы Оальфа бета(I I) АНТИ - В Серия .......................... Титр ……............ мл .............................. годна до ............... |
|
|
|
|
|
Наименование учреждения изготовителя |
|
Наименование учреждения изготовителя |
|
Изогемагглютинирующая сыворотка группы Оальфа бета(III) АНТИ - A Серия .......................... Титр ……............ мл .............................. годна до ............... |
|
Изогемагглютинирующая сыворотка группы ABo(IV) Серия .......................... ……..................... мл .............................. годна до ............... |
Рис. 1. Форма этикеток стандартных изогемагглютинирующих сывороток системы АВО.
На этикетки наносят по диагонали цветные полосы:
- для сыворотки группы А бета(II) - две синие;
- для сыворотки группы В альфа(III) - три красные;
- для сыворотки группы АВо(IV) - четыре желтые.
Возможно печатать таким же цветом полностью текст этикеток.
Срок годности стандартной сыворотки устанавливают 6 месяцев с момента ее розлива.
Сыворотку, срок годности которой истек, можно проверить и при условии, если она сохранила без изменения свои свойства (см. разд. ХVIII), продлить срок годности еще на 2 месяца.
Контроль разлитой сыворотки производят в пределах срока ее годности. Для этого из каждой серии разлитой сыворотки в лаборатории оставляют несколько ампул, которые сохраняют как образцы для последующего контроля.
Контроль заключается в проверке внешнего вида сыворотки и сохранения ее специфичности и активности.
При контрольной проверке к сыворотке предъявляют следующие требования:
а) отсутствие помутнения, выпадения осадка и потемнения;
б) отсутствие способности вызывать неспецифическую агглютинацию и гемолиз эритроцитов;
в) наступление агглютинации с эритроцитами групп А1 и В не позднее, чем в течение 30 секунд и с эритроцитами группы А2 не позднее, чем в течение одной минуты;
г) сохранение титра агглютининов на высоте, установленной при втором контроле сыворотки до розлива.
Если титр снизился (не более, чем на одну ступень), но высота его не ниже требований, указанных в разделе II.б, то сыворотку проверяют еще через пять и десять дней. Если титр далее не снижается, сыворотку считают пригодной.
При контроле разлитой сыворотки титр можно определять более простым cпособом. Испытуемую сыворотку разводят изотоническим раствором NаСl соответственно указанному на ней титру. Например, при титре 1:64 в пробирку накапывают 63 капли изотонического раствора и той же пипеткой одну каплю испытуемой сыворотки. Сыворотку тщательно перемешивают с изотоническим раствором и одну каплю смеси переносят на пластинку. Сюда же прибавляют одну маленькую (приблизительно в 10 раз меньшую) каплю стандартных эритроцитов соответствующей группы. Эритроциты перемешивают с сывороткой и наблюдают за результатом при покачивании пластинки в течение пяти минут.
Если за это время появилась агглютинация, значит, титр сыворотки не снизился. Если в течение пяти минут агглютинация не наступила, значит, титр сыворотки снизился. В этих случаях для установления величины титра сыворотку титруют вновь, как указано в разделе IV.5.
Если при контроле разлитой сыворотки окажется, что она не соответствует предъявляемым требованиям (см. раздел ХХII, а, б, в, г), то сыворотку считают непригодной и ликвидируют.
В учреждения, в которые эта сыворотка была отпущена, немедленно сообщают по телефону или телеграфом о непригодности данной серии сыворотки.
Сыворотку, возвращенную из других учреждений из-за непригодности, ликвидируют так же, как сыворотку этой серии, оставшуюся неиспользованной в лаборатории, ее изготовившей.
Сыворотку выдают по требованиям учреждений, в которых определяют группу крови.
Выдают сыворотку комплектом в равных количествах групп О альфа бета(I), А бета(II), и В aльфа(III). Сыворотку группы АВо(IV) выдают по 1 мл на 15 мл общего количества сыворотки других трех групп. При выдаче сыворотки к ней обязательно прикладывают инструкцию по использованию (см. п. ХХIХ, Дополнение 1).
Сыворотку на всех стадиях ее изготовления можно хранить при комнатной температуре или в холодильнике при 4 - 8 °С. Если сыворотка замерзла, это не меняет ее свойства и она может быть использована после полного ее оттаивания.
Под паспортизацией подразумевают запись на флаконе всех сведений о находящейся в нем порции исходного материала, из которого получается сыворотка, и последовательную запись всех результатов, полученных при исследовании исходного материала, а затем сыворотки в процессе ее изготовления и контроля.
Паспортные записи производятся:
а) на флаконе с исходным материалом. Эти записи постепенно пополняются и переносятся с флакона на флакон по мере обработки и исследования этой порции сыворотки;
б) на этикетке, наклеиваемой на флакон или ампулы с разлитой сывороткой;
в) в "Журнале регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".
г) в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".
а) В "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО" записывают все сведения о поступившем материале и полученной из него сыворотки, включая контрольные исследования, проведенные до момента розлива сыворотки.
При смешивании сывороток различных серий смесь записывают под новым номером.
Записи в этом журнале повторяют записи на флаконах с неразлитой сывороткой.
б) В "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО" записывают сведения о сыворотке с момента ее розлива. В этот журнал вносят сведения, имеющиеся на этикетке разлитой сыворотки, и делают дополнительные записи о дате розлива и результатах контрольных проверок разлитой сыворотки. В этот же журнал записывают, куда и сколько было отпущено сыворотки каждой серии.
Нумерацию серий начинают с 1 января каждого года и ведут независимо от групповой принадлежности сыворотки.
Дополнение 1
Техника реакции
Определение группы крови АВО производится стандартными изогемагглютинирующими сыворотками на плоскости при комнатной температуре.
Стандартные сыворотки наносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью по одной большой капле (0,1 мл) у предварительно надписанного обозначения. Во избежание ошибки при каждом определении группы крови применяют по два образца сывороток каждой группы (разные серии), так что они образуют два ряда капель в следующем порядке по горизонтали: О альфа бета(анти-(А+В)), А бета(анти-В) и В альфа(анти-А).
Исследуемую кровь наносят по одной маленькой капле, приблизительно в 10 раз меньше капли сыворотки (0,01 мл), рядом с каждой каплей сыворотки. Кровь тщательно перемешивают с сывороткой стеклянной палочкой или углом предметного стекла, которые промывают и досуха вытирают перед размешиванием каждой капли.
Результат реакции
Наблюдение за ходом реакции производят при легком покачивании пластинки в течение пяти минут.
Результат реакции в каждой капле может быть положительным (+) или отрицательным (-).
Положительный результат (+) выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов - агглютинаты видны невооруженным глазом сначала в виде мелких красных зернышек, постепенно сливающихся в более крупные хлопья. При этом сыворотка постепенно обесцвечивается.
При отрицательной реакции (-) капля остается равномерно окрашенной.
Агглютинация наступает обычно в течение 10 - 30 секунд, однако наблюдение проводят не менее пяти минут ввиду возможности позднего наступления агглютинации в случае слабой агглютинабельности эритроцитов (А2 или А2В).
По мере наступления агглютинации, но не ранее трех минут, в эти капли добавляют по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NаСl для разрушения иногда наступающей ложной агглютинации - неспецифического склеивания эритроцитов, в том числе в так называемые монетные столбики.
В тех случаях, когда положительный результат получается со стандартными сыворотками всех групп (во всех каплях), для исключения неспецифической агглютинации производится дополнительное контрольное исследование испытуемых эритроцитов со стандартной сывороткой группы АВо(IV), не содержащей групповых агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации с сывороткой группы АВо(IV) позволяет учесть положительный результат реакции с сыворотками О альфа бета(I) (анти-А+В), А бета(II) (анти-В) и В альфа(III) (анти-А) как истинный.
|
Изогемагглютинирующие сыворотки группы |
Исследуемая кровь принадлежит к группе |
||
|
О альфа бета (I) Анти-(А+В) |
А бета(II) Анти-В |
В aльфа(III) Анти-А |
|
|
- - |
- - |
- - |
О (I) |
|
+ + |
- - |
+ + |
А (II) |
|
+ + |
+ + |
- - |
В(III) |
|
+ + |
+ + |
+ + |
АВ (IV) |
|
Контроль с сывороткой группы АВо(IV) |
|||
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы.
Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - отсутствие ее.
Примечание.
1. При использовании сывороток с титром не ниже, чем 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больных одной серией сывороток каждой группы. При повторном и перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены при первичном определении.
2. Уточнение техники реакции, оценки результатов, возможные ошибки и другие подробности см. в "Инструкции по определению групп крови системы АВО".
Дополнение 2
Для окрашивания изогемагглютинирующих сывороток используются следующие красители:
- для сыворотки группы А-бета(II) - метиленовая синяя, бриллиантовая зелень и трипан-блау вместе или любые две из них, взятые в равных количествах;
- для сыворотки группы В-альфа(III) - эозин (ВА), эозин натрия или конгорот;
- для сыворотки группы АВо(IV) - уранин (флуоресцеин растворимый - динатрий флюоресцеинат).
Краски растворяют в дистиллированной воде или изотоническом растворе NаСl до получения пересыщенного раствора (1 гр. на 50 мл жидкости). Краситель приготавливают, исходя из потребности 50 - 100 мл, и сохраняют для использования.
При изготовлении сывороток немедленно после фильтрования соответствующие растворы красок добавляют по 3 - 5 капель на каждые 100 мл сыворотки до получения требуемой окраски: синий или сине-зеленый для группы А-бета(II), светло-красный для группы В-альфа(II) и желтый для группы АВо(IV).
Следует иметь ввиду, что иногда при хранении запаянных ампул на свету синяя краска в сыворотке группы А-бета(II) слегка выцветает, но она восстанавливается после вскрытия ампулы (флакона).
Использование красок безвредно для сывороток, не влияет на титр и срок их годности.
"Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года № 05-14/26, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по определению групп крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
Введение
Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания антигенных свойств эритроцитов (агглютиногенов) и антител по отношению к ним (агглютининов), находящихся в плазме крови.
Существуют два групповых агглютиногена - А и В, и два агглютинина - альфа и бета. Различные сочетания этих свойств образуют четыре группы крови: О-альфа бета(I), А-бета(II), В-aльфа(III) и АВо (IV).
Возможны два способа определения группы крови:
1. Определение группы крови при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток. При этом способе в крови устанавливают наличие или отсутствие агглютиногенов и, исходя из этого, делают заключение о групповой принадлежности исследуемой крови.
2. Определение группы крови перекрестным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов. При этом способе, так же как и при первом, определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и, кроме того, при помощи стандартных эритроцитов устанавливают наличие или отсутствие групповых агглютининов.
Группа крови у больных и других лиц, которым предполагается сделать переливание крови, определяется сертифицированным специалистом, имеющим специальную подготовку. Во избежание ошибки процедуру взятия крови и определения группы повторяют.
Результат определения группы крови записывается в правом верхнем углу лицевого листа истории болезни с указанием даты и за подписью специалиста, производившего определение.
Группа крови у доноров определяется два раза сертифицированным специалистом: один раз при первичном обращении донора при помощи стандартных сывороток двух различных серий каждой группы; и второй раз при окончательном зачислении в доноры - перекрестным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных сывороток (также двух различных серий каждой группы) и стандартных эритроцитов. Результат обоих определений записывается на лицевой стороне донорского журнала (карты) с указанием даты и за подписью лиц, определявших группу крови.
Примечание: При использовании изогемагглютинирующих сывороток с титром не ниже, чем 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больных одной серией сыворотки каждой группы. При повторном и перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены при первичном определении.
Специальное оснащение
а. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп О-альфа бета(I), А-бета(II), В-aльфа(III) и стандартная сыворотка группы АВо(IV).
б. Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III).6
в. Изотонический раствор NаСl.
г. Белые фарфоровые или любые другие белые пластинки со смачиваемой поверхностью.
д. Пипетки.
е. Стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания капель крови и сыворотки.
_____________
6 Стандартные эритроциты приготавливаются учреждениями службы крови в консервированном виде. Можно использовать и нативные свежие стандартные эритроциты, приготовленные малыми дозами в соответствии с действующей инструкцией по их изготовлению.
Подготовительная работа
а. Определение группы крови производят в помещении с хорошим освещением при температуре 15 - 25 °С.
б. Ампулы, флаконы со стандартными сыворотками ставят в штатив с тремя гнездами (или в два штатива - при использовании двух серий сыворотки каждой группы). В левые гнезда ставят сыворотку группы О-альфа(I), в средние - сыворотку группы А-бета(II) и в правые - сыворотку группы В-aльфа(III). В ампулы опускают сухие чистые пипетки. Отдельно ставят сыворотку группы АВо (IV), употребляемую в качестве дополнительного контроля (см. раздел IV, в). Этот набор дополняют пробиркой или флаконом с изотоническим раствором NаСl.
в. Для определения группы крови перекрестным способом, кроме стандартных сывороток, подготавливают также стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III). Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в маленький (на три гнезда) штатив в следующем порядке: слева - группы О(I), в середине - группы А(II) и справа - группы В(III).
г. Для промывания стеклянных, пластмассовых палочек и пипеток подготавливают стаканы с водой и с изотоническим раствором NаСl.
Техника определения группы крови при помощи стандартных сывороток
а. На левой стороне пластинки надписывают О-альфа бета[анти-(А+В)], в середине - А-бета(анти-В) и справа - В-альфа(анти-А), на верхнем крае - фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.
Под соответствующим обозначением группы крови на пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки соответствующей группы. Если используют стандартные сыворотки двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: O-альфа бета[анти-(А+В), А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А)].
Сыворотку берут из ампулы пипеткой, которую тотчас же после того, как из нее была выпущена сыворотка, опускают в ту же ампулу с сывороткой, из которой она была взята.
б. Кровь для исследования берут из места укола мякоти пальца или мочки уха. Капли крови величиной приблизительно 0,01 мл последовательно наносят сухой стеклянной палочкой на пластинку, каждую рядом с каплей стандартной сыворотки (количество испытуемой крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества стандартной сыворотки, с которой она смешивается).
в. Другой стеклянной палочкой перемешивают каплю крови с сывороткой группы О-альфа бета[анти-(А+В)] до тех пор, пока смесь не окрасится равномерно в красный цвет. Другой стеклянной палочкой перемешивают следующую каплю крови с сывороткой группы А-бета(анти-В) и так же поступают с сывороткой В-альфа(анти-А). При использовании двух серий сывороток так же делают во втором ряду. Можно перемешивать кровь с сывороткой одной и той же палочкой, но в этом случае необходимо после размешивания каждой капли промывать палочку в стакане с водой и насухо ее вытирать.
г. После размешивания капель пластинку покачивают, затем на 1 - 2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают.
Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти минут. Хотя агглютинация начинается в течение первых 10 - 30 секунд, наблюдение следует вести и далее - до пяти минут в виду возможности более поздней агглютинации, например, с эритроцитами группы А2(II).
д. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через три минуты, в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых наступила агглютинация, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора NаСl и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения пяти минут.
Трактовка результатов реакции при определении группы крови при помощи стандартных сывороток
Реакция гемагглютинации в каждой капле может быть положительной или отрицательной.
При положительной реакции обычно в течение первых 10 - 30 секунд от начала перемешивания в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные комочки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Мелкие комочки постепенно сливаются в более крупные, а иногда в хлопья неправильной формы. При этом сыворотка полностью или почти полностью обесцвечивается.
При отрицательной реакции жидкость все время (5 минут) остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней не обнаруживается никаких агглютинатов.
Результаты реакций в каплях с сывороткой одной и той же группы должны совпадать.
Результаты с сыворотками трех групп: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А) могут дать четыре различные комбинации положительных и отрицательных реакций (см. табл.1).
а. Если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию, т.е. все смеси остались равномерно окрашенными в красный цвет без признаков агглютинации, это значит, что кровь не содержит агглютиногенов А и В, т.е. принадлежит к группе О(I).
б. Если сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)] и В-альфа(анти-А) дали положительную реакцию, а сыворотка группы А-бета(анти-В) - отрицательную, это значит, что кровь содержит агглютиноген А, т.е. принадлежит к группе А(II).
в. Если сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)] и А-бета(анти-В) дали положительную реакцию, а сыворотка группы В-альфа(анти-А) - отрицательную, то исследуемая кровь содержит агглютиноген В, т.е. принадлежит к группе В(III).
г. Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, это указывает на то, что исследуемая кровь содержит оба агглютиногена - А и В, и принадлежит к группе АВ(IV). Однако, в этих случаях для исключения неспецифической агглютинабельности исследуемых эритроцитов необходимо провести дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВо(IV). Для этого на пластинку наносят большую каплю (0,1 мл) сыворотки группы АВо(IV) (контроль) и к ней добавляют маленькую (0,01 мл) каплю исследуемой крови. Сыворотку и кровь перемешивают, после чего наблюдают за результатом в течение 5 минут при покачивании пластинки. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле, при наличии ее в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А), позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ(IV).
Техника определения группы крови перекрестным способом при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов
а. Определение группы крови перекрестным способом заключается в одновременном определении групповых агглютиногенов в эритроцитах испытуемой крови при помощи стандартных сывороток и групповых агглютининов в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартных эритроцитов.
б. Для определения группы крови перекрестным способом кроме стандартных сывороток используют стандартные эритроциты группы О(I), А(II) и В(III).
в. Кровь для исследования берут из вены или места укола пальца в сухую пробирку. Кровь центрифугируют или оставляют в покое на 20 - 30 минут для отделения сыворотки (для лучшего отделения сыворотки через 3 - 5 минут следует отделить сверток от стенок пробирки, обведя его стеклянной палочкой).
г. Определение производят на белой пластинке, на верхнюю часть которой наносят обозначения слева направо: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А). На верхнем крае надписывают фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.
д. Под соответствующими обозначениями групп крови на пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартных изогемагглютинирующих сывороток. При использовании стандартных сывороток двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А).
е. На правую часть пластинки также под соответствующими обозначениями наносят по одной маленькой (0,01 мл) капле стандартных эритроцитов в следующем порядке слева направо: О(I), А(II) и В(III).
ж. Из пробирки, содержащей кровь больного, пипеткой извлекают сыворотку (осторожно, чтобы не взболтать эритроциты) и накапывают ее по одной большой (0,1 мл) капле на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна пробирки эритроциты испытуемой крови и наносят их по маленькой (0,01 мл) капле рядом с каждой каплей подготовленной стандартной сыворотки.
з. Во всех каплях сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (сухой стеклянной палочкой), пластинку покачивают, затем на 1 - 2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти минут. Агглютинация в каплях со стандартной сывороткой обычно начинается быстро (10 - 30 секунд). Агглютинация в каплях, в которых сыворотку крови испытывают со стандартными эритроцитами, может наступить поздно (к концу пятой минуты), в связи с возможностью низкого титра содержащихся в исследуемой сыворотке агглютининов.
и. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 минуты в те капли, в которых она наступила, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора NаСl и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения пяти минут.
Трактовка результатов при определении группы крови перекрестным способом
Учет реакции производится путем сопоставления результатов, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов (см. табл.2).
Результаты реакций, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов, должны совпадать, т.е. указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов, соответствующих одной и той же группе крови. Эти результаты могут быть выражены в четырех различных комбинациях.
а. Реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие групповых агглютиногенов, т.е. на принадлежность исследуемой крови к группе О(I) (см. раздел IV.а). При этом сыворотка исследуемой крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы O(I) и положительную - с эритроцитами групп А(II) и В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютининов aльфа и бета, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе О-альфа бета(I).
б. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногена А (см. раздел IV.б). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп O(I) и А(II), но положительную с эритроцитами группы В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютинина бета, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе А-бета(II).
в. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови определяется наличие агглютиногена В (раздел IV.в). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп О(I) и B(III), но положительную с эритроцитами группы А(II). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютинина альфа, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе В-альфа(III).
г. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногенов А и В, и исследование с контрольной сывороткой группы АВ(IV) подтверждает специфичность реакции (см. раздел IV.г). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, что указывает на отсутствие агглютининов в исследуемой крови, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе АВо(IV).
Причины ошибок и меры их предупреждения
Отступление от изложенных правил может привести к ошибочным заключениям о групповой принадлежности исследуемой крови.
Отступлением от правил могут явиться: ошибочный порядок расположения стандартных сывороток или эритроцитов в штативах, ошибочный порядок нанесения их на пластинку, неправильное соотношение количества сыворотки и эритроцитов, несоблюдение времени, необходимого для проведения реакции (5 минут), неиспользование контрольной реакции c сывороткой группы АВо(IV), загрязнение или применение мокрых пипеток, пластинок, палочек, а также использование недоброкачественных стандартов, например, сыворотки с истекшим сроком годности (недостаточно активной), загрязненной или частично высохшей сыворотки, которая может вызвать неспецифическую реакцию агглютинации и т.д.
Эти отступления и связанные с ними ошибки могут привести к неправильной оценке результата реакции в целом и в каждой отдельной капле. Последнее может заключаться в следующем:
Лицо, определяющее группу крови, считает, что агглютинации не произошло, в то время как она фактически есть или должна появиться.
Лицо, определяющее группу крови, предполагает, что произошла агглютинация, в то время как она фактически отсутствует.
Первая ошибка, т.е. учет реакции как отрицательной при фактическом наличии агглютинации, может произойти:
а) в тех случаях, когда агглютинация начинается поздно или бывает слабо выражена. Это может зависеть от того, что стандартные сыворотки малоактивны, или от того, что эритроциты исследуемого лица обладают слабой агглютинабельностью. При одновременном наличии этих двух причин агглютинация может совсем не появиться, например, если малоактивная сыворотка группы В-альфа(анти-А) не даст агглютинации с эритроцитами группы А(II), если агглютинабельность последних низкая, например, подгруппа А2.
Во избежание этой ошибки необходимо наблюдать за ходом реакции не менее пяти минут и особенно внимательно за теми каплями, в которых еще не наступила агглютинация, а также работать только с активными сыворотками, агглютинирующая способность которых проверена и соответствует требованиям инструкции и в пределах срока ее годности;
б) при избытке крови, если взята слишком большая капля.
Во избежание этой ошибки следует соблюдать соотношение объема исследуемой крови и стандартной сыворотки (или стандартных эритроцитов и исследуемой сыворотки) приблизительно 1:10;
в) при высокой температуре (выше 25 °С) окружающего воздуха например, в жаркую погоду (см. раздел II. а).
Во избежание этой ошибки пластинку, на которой определяется группа крови, следует охладить.
Вторая ошибка, т.е. учет реакции как положительной при фактическом отсутствии агглютинации, может произойти:
а) когда эритроциты испытуемой крови складываются в "монетные столбики", которые невооруженным глазом можно принять за агглютинаты. Во избежание этой ошибки необходимо добавление изотонического раствора NаСl (см. раздел III. д) с последующим покачиванием пластинки что, как правило, уничтожает "монетные столбики";
б) когда исследуемые эритроциты дают феномен ауто- или панагглютинации.
Во избежание этой ошибки необходимо не допускать определение групп крови при температуре ниже 15 °С (см. раздел II. а) и обязательно использовать контрольные сыворотки группы АВо(IV) (см. раздел IV. г);
в) при использовании недоброкачественной сыворотки, дающей неспецифическую агглютинацию.
Во избежание этой ошибки следует просматривать ампулы (флаконы со стандартной сывороткой и не использовать ее, если в ней имеются помутнение или признаки высыхания.
г) когда пластинку со смесью эритроцитов и сыворотки не покачивают. В этом случае эритроциты, оседая на дно, могут образовать отдельные скопления, симулирующие агглютинацию.
Во избежание этой ошибки необходимо периодически покачивать пластинку, на которой проводится определение (см. раздел III. г и раздел V. з).
Однако и при правильной оценке реакции в каждой отдельной капле можно сделать неправильное заключение о групповой принадлежности, если спутать порядок расположения стандартов в штативе или на пластинке. Поэтому каждый раз в начале работы по определению групповой принадлежности следует тщательно проверять расположение в штативах пробирок со стандартными эритроцитами, а также всех ампул (флаконов) с сывороткой, их групповую принадлежность, номер серии и дату годности.
Во всех случаях нечеткого или сомнительного результата необходимо повторное определение группы крови при помощи стандартных сывороток других серий. Если результаты также остаются неясными, а определение проводилось только при помощи стандартных сывороток, то следует определить группу крови также и перекрестным способом.
Примечание 1. При определении групповой принадлежности крови больных в лечебных учреждениях могут встретиться трудности, вызванные изменением свойств крови при различных патологических состояниях. Это может выразиться в неспецифической агглютинабельности эритроцитов, например, при аутоиммунной гемолитической анемии, у новорожденных с гемолитической болезнью, у больных циррозом печени, с ожогами, при гнойно-септическом состоянии. При некоторых заболеваниях, например, при лейкозах, наблюдается снижение агглютинабельности эритроцитов, особенно группы А(II), а также снижение активности групповых агглютининов.
В таких случаях определение групповой принадлежности крови больного должно производиться повторно с использованием стандартных сывороток более высокой активности, желательно в лабораторных условиях.
Примечание 2. При использовании для определения групп крови системы АВО моноклональных антител следует руководствоваться специальной инструкцией, которая прилагается к комплектам моноклональных антител при их выдаче.
|
Изогемагглютинирующие сыворотки группы |
Исследуемая кровь принадлежит к группе |
||
|
Оальфа бета(I) Анти-(А+В) |
A-бета(II) Анти-В |
B-aльфа(III) Анти-А |
|
|
- - |
- - |
- - |
О(I) |
|
+ + |
- - |
+ + |
A(II) |
|
+ + |
+ + |
- - |
B(III) |
|
+ + |
+ + |
+ + |
AB(IV) |
|
Контроль с сывороткой группы АВо(IV) |
|||
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы. Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - отсутствие ее.
|
Изогемагглютинирующие сыворотки группы |
|
Изогемагглютинирующие сыворотки группы |
||||
|
Oaльфа бета (A+B) Анти-(А+В) |
Aбета(II) Анти-В |
B-aльфа (III) Анти-А |
|
Oaльфа бета (A+B) Анти-(А+В) |
Aбета(II) Анти-В |
B-aльфа (III) Анти-А |
|
- - |
- - |
- - |
|
+ + |
- - |
+ + |
|
Стандартные эритроциты |
|
Стандартные эритроциты |
||||
|
O(I) - |
A(II) + |
B(III) + |
|
O(I) - |
A(II) - |
B(III) + |
|
Исследуемая кровь группы О(I) |
|
Исследуемая кровь группы О(II) |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Изогемагглютинирующие сыворотки группы |
|
Изогемагглютинирующие сыворотки группы |
||||
|
Oaльфа бета (A+B) Анти-(А+В) |
Aбета(II) Анти-В |
B-aльфа (III) Анти-А |
|
Oaльфа бета (A+B) Анти-(А+В) |
Aбета(II) Анти-В |
B-aльфа (III) Анти-А |
|
+ + |
+ + |
- - |
|
+ + |
+ + |
+ + |
|
Стандартные эритроциты |
|
Стандартные эритроциты |
||||
|
O(I) - |
A(II) + |
B(III) - |
|
O(I) - |
A(II) - |
B(III) - |
|
Исследуемая кровь группы О(III) |
|
Исследуемая кровь группы О(IV) |
||||
Таблица 2. Оценка результатов определения групп крови перекрестным методом при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы и стандартных эритроцитов.
"Инструкцию по определению групп крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года № 05-14/27, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция7 по применению Цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических жидких для определения групп крови человека системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ) ТУ 9398-205-27575295-94
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Назначение
Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с поликлональными иммунными сыворотками.
_____________
7 Амниотическая жидкость нейтрализует альфа и бета антитела, относящиеся к классу IgM, неполные альфа и бета антитела, относящиеся к классу IgG, при этом не нейтрализуются.
2. Характеристика и основные свойства цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ
Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М. Цоликлоны изготавливаются из асцитной жидкости мышей-носителей анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В антител. Технология изготовления реагента исключает возможность его контаминации патогенными для человека вирусами.
3. Техника определения групп крови человека системы АВО с помощью цоликлонов
Определение производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на плоскости: и на пластине или планшете. Определение группы крови производится в помещении с хорошим освещением при температуре 15 - 25 °С.
3.1. Нанесите на планшет или пластину индивидуальными пипетками Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.
3.2. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01 - 0,03 мл).
3.3. Смешайте кровь с реагентом.
3.4. Наблюдайте за ходом реакции с Цоликлонами визуально при легком покачивании пластины или планшета в течение трех минут. Агглютинация эритроцитов с Цоликлонами обычно наступает в первые 3 - 6 секунд, но наблюдение следует вести три минуты ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.
3.5. Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.
3.6. Интерпретация результатов реакции агглютинации исследуемой крови с Цоликлонами представлена в таблице.
|
Результат реакции* с Цоликлоном: |
Исследуемая кровь принадлежит к группе** |
||
|
анти-А |
анти-В |
анти-АВ |
|
|
- |
- |
- |
О(I) |
|
+ |
- |
+ |
A(II) |
|
- |
+ |
+ |
B(III) |
|
+ |
+ |
+ |
AB(IV) |
* Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - отсутствие агглютинации.
** Окончательно АВО принадлежность устанавливается только по результатам перекрестного определения: антигенов А и В на эритроцитах и изогемагглютининов в сыворотке.
4. Контроль специфичности реакции агглютинации
В составе Цоликлонов нет высокомолекулярных добавок, способных вызвать неспецифическую полиагглютинацию эритроцитов, поэтому не требуется проведение контроля с растворителем. При положительном результате реакции агглютинации со всеми тремя Цоликлонами необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого смешайте на плоскости одну каплю исследуемой крови (эритроцитов) с каплей физиологического раствора. Кровь можно отнести к группе АВ(IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.
5. Форма выпуска
Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5 - 10 мл. Цоликлон анти-А - красного цвета, анти-В - синего и анти-АВ - бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1 %.
6. Хранение
Срок хранения - два года при температуре 2 - 8 °С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре 2 - 8 °С в закрытом виде в течение одного месяца.
7. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным. Необходимо также приложить протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2 - 3 невскрытых флакона с Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цолициклонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических жидких для определения групп крови человека системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ)", утвержденную Управлением научных исследований Минздравмедпрома России 17 марта 1995 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
______________
Составители инструкции: профессор И.Л. Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю. Митерев, научные сотрудники Л.Н. Леменева, Н.И. Оловникова, Е.В. Белкина.
Инструкция по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
Стандартные сыворотки антирезус служат для определения резус - принадлежности крови людей и приготавливаются из крови лиц, сенсибилизированных к резус-фактору, содержащих в крови активные резус - антитела.
Источники получения сыворотки антирезус
Кровь (плазма) для изготовления сывороток антирезус может быть получена: а) от женщин, сенсибилизированных к резус-фактору во время беременности; б) от больных, перенесших трансфузионные реакции или осложнения, которым производят кровопускание в процессе их лечения (обменные трансфузии, плазмаферез) и от тех же лиц после их излечения; в) от доноров, дающих кровь для переливания больным, в тех (редких) случаях, когда у них обнаружены в крови резус-антитела; г) от лиц, специально иммунизированных антигеном резус. (см. Метод.рекоменд. "Иммунизация доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус").
Выявление женщин, сенсибилизированных к резус-антигену и содержащих в крови резус-антитела
Наиболее часто сенсибилизация к резус-антигену происходит у женщин во время беременности. Выявление таких лиц производится персоналом женских консультаций и родильных домов. Кровь резус-отрицательных женщин исследуют на наличие антител. При выявлении резус-антител сведения о таких лицах передаются в учреждения Службы крови.
Учет лиц, в крови которых содержатся резус-антитела
В тех случаях, когда устанавливается сенсибилизация к резус-антигену, т.е. наличие в крови у женщин резус-антител, таких женщин регистрируют и заводят на них карту "Учета изоимунных лиц". Карты заполняются персоналом родильных домов, в женских консультациях и в учреждениях Службы крови.
Привлечение к донорству лиц, в крови которых содержатся резус-антитела
У женщин, в крови которых содержатся резус-антитела, может быть взята кровь для изготовления стандартной сыворотки.
Привлечение таких лиц к донорству требует особого подхода. Следует учитывать, что большинство из них перенесло тяжелую психическую травму в связи с болезнью, а иногда и смертью ребенка. Желательно рассказать женщине, что из ее крови будет приготовлена сыворотка-реактив, которую необходимо использовать при лечении детей с таким же заболеванием.
При согласии женщины дать кровь необходимо обследовать состояние ее здоровья и установить возможность и дозы взятия крови.
В дальнейшем, но не ранее, чем через полгода после родов и по окончании периода лактации желательно привлечение женщин, иммунизированных во время беременности, к систематическому донорству, а при падении титра антител - к реиммунизации, в соответствии с "Методическими рекомендациями по иммунизации доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус".
Показатели пригодности крови для изготовления из нее стандартной сыворотки антирезус
Показателем пригодности крови для приготовления из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. титр резус-антител.
В виду возможного снижения титра антител при обработке сыворотки следует привлекать к донорству лиц, в крови которых содержатся антитела анти-D с титром, превышающим окончательные требования, предъявляемые к стандартным сывороткам. Для полных антител титр должен быть не ниже, чем 1:32, для неполных антител при исследовании их в непрямой пробе Кумбса - не ниже чем 1:128, а при исследовании реакцией с применением желатина в пробирках или реакцией в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:64.
Исходный титр резус-антител при изготовлении стандартного универсального реагента должен быть не ниже 1:32.
Методы и дозы взятия крови
Взятие крови от лиц, сенсибилизированных к резус-антигену предыдущими беременностями или трансфузиями крови, а также от искусственно иммунизированных доноров, состояние здоровья которых соответствует требованиям инструкции, предъявляемым к донорам, дающим кровь для переливания больным, допускается в дозах, предусмотренных этой инструкцией.
Плазму, содержащую резус-антитела, рекомендуется получать также методом плазмафереза, однако только вне периода беременности.
Оплата на усиление питания лицам, из крови которых изготавливается сыворотка антирезус, при любом методе взятия крови и последующего отделения сыворотки или плазмы, производится в тройном размере.
Первичная обработка сыворотки и плазмы
При получении плазмы из крови донора методом плазмафереза, плазма не позже, чем через 2 - 3 дня должна быть дефибринирована. Для этого плазму переливают из пластикатного мешка во флакон, добавляют в нее 20 % раствор хлорида кальция из расчета 3 мл на 100 мл плазмы и содержимое флакона тщательно перемешивают. Через несколько минут после этого, а затем еще раз через 30 минут, флакон с плазмой встряхивают для отделения свертка от стенок флакона и оставляют на 2 часа при комнатной температуре, после чего помещают в холодильник при температуре 4 - 8 °С. На следующий день сыворотку отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют борной кислотой из расчета 2 - 3 г на 100 мл сыворотки или азидом натрия - 1 г на 1 л.
Если кровь берут обычным путем в сухой флакон, то через несколько минут после взятия крови, а затем еще раз через 30 минут, флакон встряхивают для отделения свертка от стенок и оставляют на 2 ч при комнатной температуре, после чего помещают в холодильник при температуре 4 - 8 °С. На следующий день сыворотку отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют. При высоком титре резус-антител можно получить дополнительное количество сыворотки антирезус путем приготовления смывов со свертка. Для этого сверток измельчают (разрезают на много частей) и заливают его до половины объема изотоническим раствором NаСl или сывороткой группы АВ(IV) с высокими конглютинирующими свойствами, стандартным разводителем или альбумином.
Флакон со свертком, залитым жидкостью, плотно закрывают пробкой и несколько раз переворачивают для того, чтобы лучше вымыть из свертка сыворотку антирезус, а затем помещают в холодильник при температуре 4 - 8 °С. На следующий день сыворотку-смыв сливают в другой сосуд и оставляют в холодильнике до полного оседания эритроцитов, после чего переливают в другой сосуд и полученный смыв исследуют на активность резус-антител. Если титр соответствует требованиям, изложенным в пункте 11, смыв соединяют с первоначально полученной сывороткой или обрабатывают далее отдельно, предварительно добавляя в него борную кислоту из расчета 2 - 3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия - 1 г на 1 л. Приготовление смыва можно повторить. Изотонический раствор NаСl применяется для смывов в тех случаях, когда предполагается последующее использование сыворотки антирезус реакцией агглютинации в солевой среде (в маленьких пробирках) или реакцией конглютинации с применением желатина или полиглюкина.
После такой первичной обработки сыворотку хранят при 4 - 8 °С не менее 2 - 3 недель и затем приступают к дальнейшим исследованиям.
Исследование сыворотки
Исследование сыворотки следует производить через 2 - 3 недели после ее заготовки и консервирования ввиду того, что в этот период может происходить снижение титра антител. Исследование начинают с проверки групповой принадлежности сыворотки по системе АВО. Полученные результаты сверяют с паспортными записями на флаконе с сывороткой. Следует учесть, что если исследуется смыв со свертка, полученный сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем группы АВ(IV), то может произойти нейтрализация групповых антител альфа и бета. Если это будет установлено, то делают соответствующие изменения в паспортных записях. Далее определяют в сыворотке присутствие полных и неполных антител с помощью методов, описанных в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие резус-антител".
Для испытания применяется не менее трех образцов стандартных эритроцитов одноименной с испытуемой сывороткой группы или группы О(I), содержащих в том или ином сочетании три антигена резус: D, С и Е, а также два образца резус-отрицательных (ссddее) эритроцитов. Положительный результат с резус-положительными эритроцитами и отрицательный с резус-отрицательными подтверждает наличие в сыворотке резус - антител. После этого сыворотку титруют тем же методом, которым в ней были выявлены антитела. Например, если сыворотка дала положительный результат в солевой среде, ее титруют в солевой среде; если сыворотка дала положительный результат в непрямой пробе Кумбса или в реакции с применением желатина, ее титруют, используя эти методы; если сыворотка оказалась активной при использовании обоих методов, она титруется также с помощью двух методов (методы титрования см. в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие резус-антител").
Сыворотку считают пригодной для дальнейшей обработки и исследования, если в ней выявляют антитела любым методом и если при этом антитела достаточно активны. Активность антител определяется их титром, который на этом этапе исследования должен быть для полных антител не ниже 1:16, а для неполных антител в непрямой пробе Кумбса не ниже 1:64, реакциями с применением желатина или полиглюкина, и в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:32.
Сыворотки сохраняют в холодильнике при 4 - 8 °С еще не менее 2 недель, после чего повторно титруют.
Примечание: в тех случаях, когда сыворотка антирезус принадлежит к группе О-альфа бета(I), А-бета(II) или В-альфа(III) для удобства последующего использования ее рекомендуется абсорбировать, т.е. удалить из нее групповые агглютинины, сделав таким образом ее универсальной.
Если в сыворотке присутствуют слабые антитела анти-С или анти-Е, их необходимо также удалить из сыворотки путем абсорбции.
После абсорбции (нейтрализации) сыворотку антирезус вновь исследуют и титруют как сказано выше.
Способы удаления или нейтрализации антител см. в Методических рекомендациях "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой специфичности".
Повторное титрование сыворотки
Повторное титрование сыворотки производят, используя метод, который дал положительный результат при первом исследовании сыворотки. Если титр антител сохранился или снизился не более чем на одну ступень, но так, что все же остался не ниже цифр, указанных в пункте 8, сыворотку можно подвергнуть стандартизации.
Стандартизация сыворотки антирезус
Стандартизация заключается в исследовании специфичности антител и в определении пригодности ее для практического использования. Для стандартизации сыворотку исследуют с помощью того же метода, в котором оказались активными содержащиеся в сыворотке антитела. Испытание ведется со стандартными эритроцитами одноименной группы или группы О(I), содержащими различные антигены резус, в том числе каждый из этих антигенов в отдельности: ссDее, Ссddее и ссddЕе, и резус-отрицательными - ссddее. В число резус-отрицательных включают образцы эритроцитов, содержащих и не содержащих факторов Даффи (Fу) и Келл (К). Если при стандартизации сыворотка дает положительный результат со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, независимо от их антигенной структуры, и отрицательный результат с эритроцитами Ссddее, ссddЕе и резус-отрицательными - ссddее, то значит в сыворотке содержатся резус-антитела анти-D. Если в сыворотке таким образом выявлены антитела cпецифичности анти-D, то ее титруют при использовании того же метода.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат с некоторыми образцами резус-положительных эритроцитов и с эритроцитами Ссddee или ссddEе, но дает отрицательный результат с эритроцитами ссDее и с резус-отрицательными - ссddее, то это значит, что в сыворотке содержатся резус-антитела анти-С или анти-Е.
Антитела анти-С и анти-Е также титруют, используя метод, при помощи которого они были выявлены.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат одновременно со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, а также с эритроцитами Ссddeе и ссddEe, но отрицательный результат со всеми резус-отрицательными эритроцитами ссddее, то это значит, что сыворотка содержит антитела соответственно к двум или трем антигенам резус, т.е. анти-D+С, анти-D+Е или анти-D+С+Е.
Каждое из антител титруют отдельно теми методами, при использовании которых они оказались активными.
Следует отметить, что различные резус-антитела в одной и той же сыворотке бывают полными и неполными и поэтому могут быть соответственно активными в той или иной среде. В этих случаях их титрование следует проводить, используя разные методы.
Если исследуемая сыворотка дала положительный результат избирательно среди резус-отрицательных образцов, это значит, что в ней содержатся другие антитела, например, анти-Даффи или анти-Келл.
Исследование и обработку таких сывороток см. в "Инструкции по изготовлению сывороток редких групп".
Окончательное заключение о пригодности сыворотки
Сыворотка считается стандартной и пригодной для практического использования, если она содержит одно или несколько резус-антител в любой форме (полные или неполные) с титром для анти-D: в солевой среде не ниже 1:16; в непрямой пробе Кумбса - не ниже 1:64; для реакции с применением желатина или полиглюкина.
Ввиду редкости антител анти-С и анти-Е допускается использование таких сывороток с более низким титром при условии хорошо выраженного положительного результата. Сыворотки, отвечающие этим требованиям, считаются стандартными сыворотками данной специфичности.
Назначение сыворотки антирезус
Сыворотка антирезус, признанная стандартной, может быть использована в зависимости от формы установленных в ней антител: реакцией агглютинации в солевой среде, реакцией с применением желатина, реакцией в сывороточной среде на плоскости.
Кроме того сыворотка, содержащая неполные резус-антитела, может быть использована для приготовления стандартного универсального реагента антирезус с применением 33 % раствора полиглюкина. Для этого требуется ее дальнейшая обработка (см. п. 16).
Во всех случаях сыворотка и реагент, предназначенные для практического использования, должны быть расфасованы и паспортизированы.
Розлив и паспортизация стандартных сывороток антирезус
После стандартизации и заключения о пригодности сыворотки фильтруют и разливают в ампулы или в маленькие флаконы по 2 - 5 мл, в зависимости от потребности. На флаконы (ампулы) наклеивают этикетки с наименованием учреждения-изготовителя, номера серии, обозначения группы крови по системе АВО, специфичности, формы антител антирезус и срока годности.
Хранение и срок годности стандартной сыворотки антирезус
Расфасованные стандартные сыворотки антирезус хранят в холодильнике при 4 - 8 °С или в замороженном состоянии при - 15 °С и ниже.
При хранении в замороженном состоянии сыворотка не изменяет свойств в течение 2 лет.
При размораживании или хранении ее при 4 - 8 °С срок годности устанавливают 4 мес.
Активность резус-антител в большинстве случаев сохраняется и дольше. Поэтому по истечении срока годности сыворотки могут быть проверены (см. п. 10) и при сохранении их специфичности и титра срок годности продлевают: для сыворотки, хранящейся в замороженном состоянии, - еще на 1 год, а для сыворотки, хранившейся при 4 - 8 °С, - на 2 месяца.
|
|
Наименование учреждения изготовителя Сыворотка антирезус |
|
|
|
Наименование учреждения изготовителя Сыворотка антирезус |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
анти-....... неполные антитела для метода ................... Группа крови ................. Серия........... ........ мл Годна до .................. |
|
анти-....... полные антитела для метода ................... Группа крови ................. Серия........... ........ мл Годна до .................. |
||||
Рисунок 1. Форма этикеток для стандартных сывороток антирезус.
На этикетках группы А(II), В(III) и АВ(IV) наносят по диагонали цветные полосы:
для сыворотки группы А(II) - синие;
для сыворотки группы В(III) - красныe;
для группы АВ(IV) и специально приготовленной - универсальной - желтые.
Выдача стандартной сыворотки антирезус
При выдаче стандартной сыворотки антирезус к ней необходимо приложить инструкцию по использованию. Для сыворотки антирезус это особенно важно, так как сыворотки, содержащие антитела, разные по форме (полные и неполные) и приготовленные для разных методов исследования, активны только при применении определенного метода и будут неактивными или неспецифическими при неправильном их использовании. Инструкции по использованию для каждого метода см. дополнения 1, 2, 3.
Изготовление стандартного универсального реагента антирезус для определения резус-принадлежности в пробирках без подогрева
Стандартный универсальный реагент антирезус пригоден для определения резус-фактора крови, независимо от ее групповой принадлежности по системе АВО. Реагент готовят из сывороток, содержащих неполные резус-антитела, предварительно обработанных, исследованных и признанных пригодными, как стандартные (см. п. 6 - 11).
Для изготовления реагента отбирают сыворотки группы АВ(IV) или другой группы, но освобожденные от групповых агглютининов альфа и бета путем удаления или нейтрализации (см. Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой специфичности").
Для изготовления реагента пригодны сыворотки антирезус с титром не ниже, чем 1:32. Если исходные сыворотки имеют более высокий титр, допускается их разведение до титра 1:32 изотоническим раствором NаСl, сывороткой группы АВ(IV) или стандартным универсальным разводителем (см. Методические рекомендации "Приготовление сыворотки - разводителя и стандартного разводителя").
Титрование сывороток производят с применением 33 % раствора полиглюкина.
В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначением 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024. Во все пробирки вводят по 2 капли изотонического раствора NаСl.
Затем в первую пробирку вводят той же пипеткой 2 капли исследуемой сыворотки антирезус, из первой пробирки, после перемешивания содержимого переносят 2 капли во вторую, из третьей - в четвертую и т.д. до последней, из которой 2 капли удаляют.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле резус-положительных эритроцитов или их смеси и по 1 капле 33 % раствора полиглюкина.
Примечание: смесь эритроцитов готовят из крови 4 - 6 доноров группы О(I) резус - положительной, взятой не более, чем за 2 - 3 дня.
Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого, затем наклоняют почти до горизонтали и в таком положении медленно поворачивают по оси так, чтобы содержимое растеклось по стенкам пробирки. Такой контакт сыворотки с эритроцитами при поворачивании пробирок продолжают 3 минуты.
Через 3 - 5 минут во все пробирки добавляют по 2 - 3 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 1 - 2-кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!)
Результат наблюдают в проходящем свете невооруженным глазом или через лупу.
Оценку результата производят по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов в виде комочков или хлопьев на фоне полностью или частично обесцвеченной жидкости.
Последнее разведение, в котором имеется агглютинация эритроцитов, принимают за титр исследуемой сыворотки.
Установив, что титр резус-антител в данном методе не ниже 1:32, переходят к дальнейшему исследованию, для чего готовят пробный образец реагента.
Изготовление пробного образца реагента антирезус
К 2 объемам сыворотки антирезус с неполными антителами добавляют 1 объем 33 % раствора полиглюкина, тщательно перемешивают и далее проводят исследование в отношении специфичности и активности.
Исследование на специфичность и активность
Пробный образец реагента исследуют с 2 - 3 образцами резус-положительных эритроцитов, а также с резус-отрицательными ссddеe группы O(I), А(II) и В(III). Кроме того, в исследование включают эритроциты генотипа Ссddее и ссddЕe. Среди резус-отрицательных должны быть образцы положительные и отрицательные по факторам Даффи(Fу) и Келл(К).
Для исследования устанавливают ряд пробирок по числу образцов эритроцитов, пробирки маркируют. На дно пробирок помещают по 2 капли исследуемого реагента и затем в соответствии с маркировкой в пробирки вводят по 1 капле эритроцитов. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, затем пробирки наклоняют почти до горизонтального положения, медленно поворачивают и т.д., как сказано выше.
Трактовка результата
Результат учитывают по отсутствию или наличию агглютинации эритроцитов и скорости ее наступления в каждой пробирке.
Специфичность оценивают по отсутствию агглютинации с D-отрицательными эритроцитами различного фенотипа в каждой отдельной пробирке.
Если агглютинация произошла во всех пробирках с резус-положительными образцами, а со всеми резус-отрицательными образцами и образцами Ссddeе и ссddЕе - реакция отрицательная, пробный образец считают специфическим.
Активность пробного образца можно оценивать одновременно с оценкой специфичности.
Если агглютинация резус-положительных эритроцитов проявилась при поворачивании наклоненной пробирки в течение 1-й минуты и через 3 минуты после добавления изотонического раствора NаСl агглютинаты образуют крупные хлопья на фоне полностью просветленной жидкости и при этом титр антител, определенный на предыдущем этапе исследования не ниже 1:32, реагент считают пригодным для практического использования.
Изготовление полного объема (серии) стандартного универсального реагента антирезус
После заключения о пригодности пробного образца можно готовить стандартный универсальный реагент в полном объеме, исходя из потребности. Изготовленный реагент вновь контролируют теми же методами, т.е. титруют и исследуют на специфичность и активность и делают заключение о его пригодности.
После этого реагент фильтруют, разливают по 2 - 5 мл во флаконы или ампулы, которые тщательно закупоривают (запаивают) и наклеивают на них этикетки с указанием учреждения, изготовившего реагент, название реагента, специфичности, номера серии и срока годности.
|
|
Наименование учреждения-изготовителя |
|
|
|
Универсальный реагент антирезус анти - ................................................. для метода в пробирках без подогрева Серия ........................... ............. мл Годен до ......................................... |
|
Рисунок 2. Форма этикетки для стандартного универсального реагента антирезус.
Хранение и срок годности
Реагент хранят в холодильнике при 4 - 8 °С.
Срок годности - 6 месяцев. Активность и специфичность реагента контролируют 1 раз в месяц в лаборатории, его изготовившей.
Выдача стандартного универсального реагента антирезус
Реагент антирезус выдается в другие учреждения в комплекте с 33 % раствором полюглюкина и с инструкцией по использованию (см. дополнение 2).
Регистрация работы по изготовлению сыворотки и реагента антирезус
Все этапы работы по изготовлению сывороток, предназначенных для разных методов определения резус-принадлежности, а также реагента антирезус, регистрируются в "Журнале регистрации материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки антирезус" и в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки антирезус".
Дополнение 1
Инструкция по использованию стандартной сыворотки антирезус для
определения резус-принадлежности реакцией с применением желатина.
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция с применением желатина пригодна для работы с сыворотками, содержащими неполные резус-антитела.
Общие замечания
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность сыворотки антирезус по системе АВО.
Сывороткой антирезус или группы АВ(IV) специально приготовленной - универсальной определяют резус-принадлежность в эритроцитах любой группы по системе АВО. Сывороткой антирезус группы O(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах группы O(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы O(I) и А(II) и сывороткой антирезус группы В(III) - в эритроцитах группы O(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что и исследуемая кровь и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 5 мл в обычную пробирку без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество свободных эритроцитов, которые и следует употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно, следует встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого натрия (0,25 мл на 1 мл крови) или другим стабилизатором. В этом случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить доверху изотонический раствор NаСl, содержимое ее перемешать и центрифугировать. Отмытые эритроциты используют для исследования. Допустимо хранить кровь в течение 2 - 3 суток при 4 - 8 °С.
Техника реакции
а) В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок объемом не менее 10 мл по количеству исследуемых образцов эритроцитов и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. На двух пробирках каждого ряда надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться.
б) В одинаково обозначенные пробирки вводят согласно маркировке по одной капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, в контрольные пробирки: - по одной капле (0,05 мл) стандартных резус-положительных эритроцитов и по 1 капле (0,05 мл) стандартных резус-отрицательных эритроцитов.
в) Во все пробирки добавляют по две капли (0,1 мл) 10 % раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения в теплой воде (46 - 48 °С). Перед употреблением желатин следует просмотреть. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойств застудневать при 4 - 8 °С желатин непригоден.
г) Во все пробирки 1-го ряда добавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус.
2-ой ряд служит контролем для исключения возможной неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за счет аутоантител.
д) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с пробирками помещают в водяную баню при 46 - 48 °С на 15 минут или в суховоздушный термостат при той же температуре на 30 - 45 минут.
е) По извлечении пробирок из водяной бани или термостата в них доливают 8 - 10 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 1 - 2-краткого перевертывания пробирок.
Трактовка результатов
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в виде красных комочков на прозрачном, почти обесцвеченном, фоне жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно окрашенная слегка опалесцирующая жидкость.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, считают резуc - положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I), а также после просмотра результатов во втором ряду. В пробирках второго (контрольного) ряда агглютинации быть не должно. Наличие агглютинации во втором (контрольном) ряду указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, напр., из-за аутоантител и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует применить сыворотку антирезус с полными антителами в реакции солевой агглютинации или предварительно отмыть эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl, для элюирования с них аутоантител.
Примечание.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабо выраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их несколькими сериями сыворотки антирезус высокой активности и, по возможности, сывороткой с полными антителами.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус - отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительное исследование сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В число резус - отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е и Сw производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус - антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа. Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
Дополнение 2
Инструкция по использованию стандартного универсального реагента
для определения резус-принадлежности в пробирках без подогрева
(Прилагается при выдаче реагента)
Стандартный универсальный реагент антирезус не содержит групповых агглютининов альфа и бета и поэтому может быть использован для определения резус-антигена D в эритроцитах любой группы системы АВО. Для контроля активности и специфичности реагента антирезус необходимо одновременно с основным исследованием ставить контроль, используя стандартные резус-положительные и стандартные резус - отрицательные эритроциты.
Предварительной обработки исследуемой крови и стандартных эритроцитов не требуется. Может быть использована кровь, взятая непосредственно из места укола пальца, консервированная кровь и осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови, взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2 - 3 суток при 4 - 8 °С.
Техника реакции
а) В штатив устанавливают 2 ряда пробирок по числу исследуемых эритроцитов в каждом ряду и по 2 пробирки для контрольных исследований. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.
б) Во все пробирки 1-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки 2-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33 % раствора полиглюкина.
2-й ряд служит контролем для исключения возможной неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за счет аутоантител.
в) В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови (эритроцитов) и стандартные резус-положительные (Rh+) и резус-отрицательные (rh-) эритроциты.
г) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального положения так, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки. Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной.
Как правило, агглютинация эритроцитов наступает уже в течение первой минуты, но для образования устойчивости комплекса антиген+антитело и четко выраженной реакции, а также ввиду возможности замедленной реакции при слабовыраженной агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом при поворачивании пробирок проводят не менее 3 минут.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2 - 3 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 2 - 3-кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!).
Трактовка результатов
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости, исследуемую кровь относят к резус-положительной (Rh+). При отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное окрашивание) исследуемую кровь можно считать резус-отрицательной (rh-).
Однако эти результаты можно учитывать как истинные только после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами и отрицательной - со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, а также после просмотра результатов во 2-м (контрольном) ряду. Во всех пробирках контрольного ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации эритроцитов во втором (контрольном) ряду указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, например, за счет аутоантител и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует применять другую активную сыворотку антирезус и сыворотку антирезус с полными антителами или предварительно отмытые эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl для элюирования с них аутоантител.
Примечание.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их несколькими сериями сывороток антирезус высокой активности и параллельно сывороткой антирезус с полными антителами в реакции солевой агглютинации.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их на резус-положительных и резус-отрицательных по реагенту анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус - антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
Дополнение 3
Инструкция по использованию стандартной сыворотки антирезус
анти-D для определения резус-принадлежности реакцией агглютинации в солевой
среде
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция агглютинации в солевой среде пригодна для работы с сывороткой, содержащей полные резус-антитела.
Общие замечания
Определение резус-фактора следует производить двумя сериями стандартных сывороток антирезус. В настоящей инструкции описывается определение двумя сериями сыворотки с использованием одной и той же методики - агглютинации в солевой среде.
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность сыворотки по системе АВО.
Сыворотка группы АВ(IV) и специально приготовленная - универсальная - предназначена для определения резус-принадлежности крови любой группы по системе АВО.
Сывороткой группы O(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы O(I) и А(II) и сывороткой группы В(III) - в эритроцитах группы O(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы O(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов
Кровь для исследования берут в количестве 0,5 - 1 мл в обычные пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора лимоннокислого натрия или любого другого стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, содержимое их перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь и без стабилизатора. При этом после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2 % взвесь, для чего одну каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NаСl. Такую взвесь употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2 - 3 суток при 4 - 8 °С.
Техника реакции
а) в штатив устанавливают два ряда пробирок высотой 2 - 2,5 см с внутренним диаметром 0,5 - 0,6 см и с гладким дном округлой формы в каждом ряду по числу исследуемых эритроцитов и по две пробирки для контрольных исследований. Предварительно штатив накрывают листом бумаги, в котором слегка накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется. Можно использовать планшет для иммунологических реакций, имеющий лунки с круглым дном.
б) во все пробирки (лунки) 1-го ряда вносят по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки) 2-го ряда - по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой серии и в оба ряда добавляют по 1 капле изотонического раствора NаСl;
в) в соответственно обозначенные пары пробирок (лунок) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2 % взвеси исследуемых эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2 % взвеси стандартных резус-положительных эритроцитов и по одной капле взвеси стандартных резус-отрицательных эритроцитов;
г) содержимое пробирок (лунок) тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37 °С на 1 час. (Можно затем оставить планшет при комнатной температуре еще на 1 - 2 часа до учета результатов).
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов
Пробирки (планшеты) рассматривают по продольной оси над источником света закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными, они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается равномерным слоем без шероховатости и неровностей, иногда с небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой правильно очерченный круг.
Диаметр при отрицательном результате всегда меньше, чем при положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D - резус - положительные (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательные (rh-).
Однако результаты можно учитывать как истинные только при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус - отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I).
Рисунок 3. Осадок эритроцитов при определении резус-принадлежности.
Примечания:
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их несколькими сериями сыворотки антирезус высокой активности. Антиген крови Dv в реакции солевой агглютинации не выявляется.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е, фенотипа ссddее.
3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.
3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус-антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
"Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года № 05-14/28, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по удалению из сыворотки антирезус антител другой специфичности
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
Общие сведения
В практической работе по определению резус-принадлежности крови наибольшее удобство представляет использование сывороток антирезус группы крови АВ(IV), не содержащих групповых агглютининов альфа и бета. Такие сыворотки являются универсальными, так как позволяют определять резус-принадлежность в крови любой группы по системе АВО.
Сыворотки антирезус, принадлежащие к группам О(I), А(II) и В(III), также могут быть превращены в универсальные путем абсорбции или нейтрализации в них групповых агглютининов альфа и бета.
Помимо групповых агглютининов использованию сыворотки антирезус мешают также имеющиеся в отдельных случаях изоиммунные антитела другой специфичности, чаше всего анти-С и анти-Е. Если эти антитела имеют низкий титр, они могут быть удалены при помощи абсорбции или путем разведения сыворотки.
Использование универсальных сывороток антирезус упрощает работу, повышает эффективность лабораторной службы и исключает получение ошибочных результатов из-за несоответствия группы сыворотки антирезус и исследуемых эритроцитов. Для освобождения сыворотки антирезус от агглютининов альфа, бета и от антител анти-С и анти-Е можно применять разные способы:
а) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета соответствующим групповым веществом, содержащимся в амниотической жидкости (см. п. 1)
б) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета естественным групповым веществом А и В (субстанция Витебского) (см. п. 2);
в) абсорбцию групповых агглютининов aльфа и бета резус - отрицательными эритроцитами, находящимися в свертках крови после снятия с них сыворотки (см. п. 3);
г) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета путем разведения сыворотки (см. п. 4);
д) абсорбцию антител анти-С и анти-Е эритроцитами этой специфичности (см. п. 5);
е) нейтрализацию антител анти-С и анти-Е путем разведения сыворотки (см. п. 6).
1. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета при помощи амниотической жидкости7
Амниотическая жидкость содержит растворенную групповую субстанцию, соответствующую группе крови плода. Она может быть использована как в нативном виде, так и предварительно высушенная и затем растворенная дистиллированной водой (получение и обработку амниотической жидкости см. п. 8).
Для нейтрализации агглютининов альфа и бета в сыворотке антирезус группы O-aльфа бета(I) используют амниотическую жидкость группы АB(IV) или смесь ... образцов амниотической жидкости групп А(II) и В(III). Для нейтрализации агглютининов бета в сыворотке группы А-бета(II) используют амниотическую жидкость группы В альфа (III). Для нейтрализации агглютининов альфа в сыворотке антирезус группы Ва(III) используют амниотическую жидкость группы А(II).
Для полного истощения групповых агглютининов в исходной сыворотке антирезус проводят подбор оптимального соотношения амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки антирезус, для чего:
- в штатив устанавливают пять пробирок с обозначениями 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6,
во все пробирки вносят по 2 капли амниотической жидкости - нативной или растворенной после высушивания;
- в первую пробирку добавляют 4 капли нейтрализуемой сыворотки, во вторую - 6 капель, в третью - 8 капель, в четвертую - 10 капель, в пятую - 12 капель;
- содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре;
- после 10-ти минутной экспозиции смесь из каждой пробирки контролируют на плоскости на полноту нейтрализации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, содержащими антиген, соответствующий нейтрализуемым агглютининам;
- последнее разведение, в котором отсутствует агглютинация (время наблюдения 5 минут) принимается за оптимальное соотношение амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки;
- если агглютинация отсутствует во всех разведениях, готовят разведения: 1:7, 1:8, 1:9 и продолжают исследование, как сказано выше;
- после того как выбрано оптимальное соотношение, к основному объему сыворотки антирезус добавляют соответствующее количество амниотической жидкости и перемешивают их. Через 10 - 20 мин. после перемешивания вновь проверяют сыворотку на полноту абсорбции на плоскости с 6 - 8 образцами резус - отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III).
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
Примечание:
В целях упрощения получения универсальных сывороток из сывороток антирезус группы А-бета(II) и В-aльфа(III) их можно предварительно смешивать, что позволяет нейтрализовать одномоментно агглютинины альфа и бета амниотической жидкостью группы АВ(IV) или смесью амниотической жидкости группы А(II) и группы В(III). Предварительное смешивание сыворотки противоположных групп целесообразно еще и потому, что при этом происходит частичная взаимная нейтрализиция групповых агглютининов, что снижает количество амниотической жидкости, необходимое для полной нейтрализации, а, следовательно, снижается степень разведения абсорбируемой сыворотки.
Использование высушенной амниотической жидкости
При низком титре сыворотки антирезус, ограничивающем ее разведение, для нейтрализации агглютининов целесообразно использовать сухой порошок. К нейтрализации приступают так же - с определения оптимального соотношения сыворотки антирезус и сухого порошка, полученного из амниотической жидкости, для чего:
- в штатив устанавливают четыре пронумерованные пробирки, в которые вносят по 0,5 мл сыворотки антирезус;
- в первую пробирку добавляют 2 мг высушенной амниотической жидкости, во вторую - 4 мг, в третью - 8 мг и в четвертую - 16 мг. Содержимое пробирок перемешивают до полного растворения порошка и оставляют при комнатной температуре;
- через 10 минут проводят испытание на плоскости на полноту нейтрализации с эритроцитами групп А(II) и В(III) и выбирают оптимальное соотношение ингредиентов;
- выбранное соотношение используют для изготовления основного объема сыворотки;
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
2. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета естественными групповыми веществами специфичности А и В (субстанция Витебского)
Групповые специфические вещества А и В являются высокомолекулярными полисахаридами, приготавливаются в производственных условиях из слизистой оболочки свиных и лошадиных желудков путем их ферментативного переваривания с последующим осаждением и очисткой органическими растворителями. Количество группового специфического вещества, необходимого для нейтрализации антител в сыворотке, зависит от активности вещества. Для нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке антирезус добавляют групповое специфическое вещество из расчета:
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы О(I) - 0,1 г группового вещества А и 0,1 г - группового вещества В;
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы А(II) - 0,1 г группового вещества В;
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы В(III) - 0,1 г группового вещества А.
Для растворения группового вещества необходимое его количество сначала растирается стеклянной палочкой в пробирке или на часовом стекле с небольшим количеством (1 мл) сыворотки антирезус, подогретой до 37 °С, затем это групповое вещество переносят в общее количество сыворотки антирезус, тщательно многократно смывая его сывороткой со стекла. Сыворотку антирезус перемешивают с групповым веществом и помещают в термостат на 3 часа, перемешивая каждые 30 минут.
После этого сыворотку помещают в холодильник при 4 °С не менее, чем на трое суток, а затем исследуют на пластинке на содержание групповых агглютининов с 6 - 8 образцами резус-отрицательной крови группы А(II) и В(III).
Отсутствие агглютинации означает, что групповые агглютинины полностью нейтрализованы. Наличие агглютинации означает неполную нейтрализацию групповых агглютининов. В случае неполной нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке вновь добавляют такое же или большее (до 0,5 г) количество группового вещества и вся процедура повторяется.
При полной нейтрализации групповых агглютининов сыворотку исследуют и обрабатывают далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
3. Абсорбция групповых агглютининов резус-отрицательными эритроцитами на свертках крови группы АВ(IV)
Неотмытые свертки крови группы АB(IV), оставшиеся после отсасывания сыворотки антирезус, допустимо хранить при 4 - 8 °С в течение 1 - 2 суток.
Для абсорбции охлажденный сверток измельчают при помощи стеклянной палочки и добавляют к нему также охлажденную сыворотку антирезус в количестве 1/6 - 1/3 объема по отношению к объему, занимаемому измельченным свертком (к 300 мл свертка приливают 50 - 100 мл абсорбируемой сыворотки, в зависимости от активности групповых антител). Сыворотку тщательно смешанную со свертком оставляют на 18 - 20 часов при 4 - 8 °С, после чего отделяют от свертка путем центрифугирования.
Далее сыворотку проверяют на плоскости с 6 - 8 образцами резус отрицательных эритроцитов и в случае полной абсорбции групповых агглютининов обрабатывают и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
4. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета при помощи разведения сыворотки
Для нейтрализации сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NаСl специально подобранной сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем.
Нейтрализация групповых антител при помощи разведения возможна только лишь при большом различии титра групповых и резус - антител.
Например, если титр групповых антител 1:8, сыворотку следует развести не менее чем в 16 раз, что возможно только в том случае, если титр резус-антител в ней после разведения сохранится не ниже требований, предъявляемых к стандартной сыворотке антирезус.
В процессе работы в начале следует приготовить пробные разведения сыворотки антирезус и исследовать титр резус-антител, а также степень нейтрализации групповых антител с 6 - 8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и B(III).
При сохранении достаточного титра резус - антител и полноте абсорбции групповых антител, разводят основной объем сыворотки антирезус и далее исследуют ее и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
5. Удаление из сыворотки антирезус сопутствующих антител анти-С и анти-Е
Если на какой-либо стадии обработки сыворотки антирезус-D выяснится, что в ней содержатся еще и другие антитела антирезус, последние могут быть удалены путем абсорбции или разведения сыворотки.
Абсорбция производится трижды отмытыми эритроцитами, взятыми приблизительно в половинном объеме по отношению к сыворотке. Если в сыворотке имеется примесь антител анти-С, то для абсорбции применяются эритроциты фенотипа Ссddее, а если имеется примесь анти-Е, то эритроциты фенотипа ссddЕе. Абсорбция проводится в течение 2 - 3 час. при температуре 37 °С при помешивании с последующей проверкой сыворотки на специфичность и активность. Если сопутствующие антитела не удалились, сорбцию можно повторить.
Разведение сыворотки антирезус для удаления сопутствующих антител можно проводить при титре антител анти-D не ниже чем 1:128 - 1:256 и титре сопутствующих антител не выше 1:2.
Сыворотку антирезус разводят изотоническим растворов NaCl, сывороткой-разводителем или стандартным разводителем.
В начале следует делать пробные порции, которые исследовать на полноту нейтрализации сопутствующих антител и на сохранность достаточного титра резус - антител-D. При положительном результате разводят основной объем сыворотки. Как после абсорбции так и после разведения основного объема сыворотки, ее вновь обрабатывают и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
6. Получение и обработка амниотической жидкости для использования ее при изготовлении сывороток антирезус
Амниотическую жидкость собирают в родильных домах от каждой роженицы отдельно в чистые флаконы. От одной роженицы может быть получено от 100 до 1500 мл. На этикетке флакона указывают фамилию роженицы, дату взятия, количество и, по возможности, группу крови новорожденного.
Групповая принадлежность амниотической жидкости соответствует группе крови новорожденного.
Оплата за сбор амниотической жидкости производится учреждениями службы крови аналогично оплате за ретроплацентарную кровь из средств на заготовку крови.
Подготовка амниотической жидкости к использованию
Групповую принадлежность амниотической жидкости устанавливают путем определения групповой принадлежности крови новорожденного или методом истощения агглютининов альфа и бета в гемагглютинирующей сыворотке группы О(I). Для этого в пробирке смешивают равные объемы (по 1 мл) стандартной гемагглютинирующей сыворотки с титром 1:32 и испытуемой амниотической жидкости. Смесь перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Затем смесь сыворотки и амниотической жидкости исследуют на плоскости со стандартными эритроцитами группы А(II) и В(III). Соотношение эритроцитов и смеси должно соответствовать примерно 1:10, экспозиция 5 - 7 минут.
Трактовка результатов
- Наличие агглютинации в каплях с эритроцитами группы А(II) и группы В(III) указывает на отсутствие в амниотической жидкости групповых антигенов А и В, т.е. на принадлежность ее к группе О(I). Такая амниотическая жидкость не пригодна для нейтрализации групповых агглютининов.
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы А(II) и наличие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе А(II).
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III) и наличие ее с эритроцитами группы А(II) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе В(III).
- Отсутствие агглютинации в каплях, как с эритроцитами группы А(II), так и группы В(III) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе АВ(IV).
Групповую принадлежность записывают на этикетке, которую наклеивают на флаконе с амниотической жидкостью.
Контроль амниотической жидкости на специфичность
Следует учитывать возможность попадания в амниотическую жидкость крови роженицы, в связи с чем необходимо исследовать каждый образец амниотической жидкости на наличие групповых агглютининов.
Исследование амниотической жидкости с эритроцитами группы А(II) и В(III) проводится аналогично определению групповой принадлежности крови.
Наличие агглютинации означает наличие в амниотической жидкости групповых агглютининов крови роженицы. Такой образец непригоден для работы.
Фильтрация и консервирование амниотической жидкости
После определения групповой принадлежности и контроля на специфичность амниотическую жидкость фильтруют через обычный бумажный фильтр или под вакуумом через фарфоровую воронку Бюхнера, в которую помещает измельченную фильтровальную бумагу толщиной 5 - 7 мм. После фильтрования амниотическая жидкость становится прозрачной.
Консервирование производится борной кислотой из расчета 2 гр на 100 мл или азидом натрия 1 г на 1000 мл.
Срок хранения амниотической жидкости 12 месяцев при 4 - 8 °С.
Высушивание амниотической жидкости
С целью удлинения срока годности амниотическую жидкость высушивают по 150 - 250 мл во флаконах емкостью 250 - 500 мл. На флаконы наклеивают этикетки с указанием группы амниотической жидкости по системе АВО, ее исходного количества и даты высушивания.
Высушенную амниотическую жидкость хранят при комнатной температуре. Срок годности 5 лет. Высушенную амниотическую жидкость перед употреблением разводят дистиллированной водой до исходного объема. После растворения используют аналогично нативной.
Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус антител другой специфичности", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября, 1990 года № 10-11/136, считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по определению резус-принадлежности крови
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
I. Введение
Определение резус-принадлежности заключается в выявлении в эритроцитах людей антигена D системы Резус.
В систему Резус входят шесть антигенов: D, d, С, с, Е, е, которые определяют с помощью соответствующих антисывороток. Антиген d серологически не выявляется. Существуют также разновидности антигенов резус: Du, Сw, сv, сx и другие.
Антигены системы Резус встречаются со следующей частотой:
D - 85 %
С - 70 %
с - 80 %
Е - 30 %
е - 97,5 %
Антигены системы Резус обладают способностью вызывать образование изоиммунных антител.
Наиболее активным в этом отношении является антиген D, который и подразумеваетcя под термином резус-фактор. Именно по наличию или отсутствию антигена D все люди делятся на резус-положительных и резус - отрицательных.
Различные сочетания антигенов резус в крови отдельных людей составляют 28 групп системы Резус (Табл.1). В четырнадцати из них содержится антиген D - они являются резус-положительными, а другие четырнадцать не содержат антигена D (нижняя часть таблицы) - их относят к резус - отрицательным.
Таблица 1
Система резус
|
№ п/п |
Резус-положительные |
|||
|
Фенотип |
Частота в % |
Генотип |
Частота в % |
|
|
1 - 2 |
ССDEE CwCDEe |
0,00 |
|
|
|
3 |
CCDEe |
0,07 |
CDE/CDe |
|
|
4 |
CcDEE |
0,035 |
CDE/cdE cDE/CdE |
0,006 0,029 |
|
5 |
CcDEe |
13,69 |
CDe/cDE CDE/cDe CDe/cdE cDE/Cde CDE/cde cDE/cdE |
12,24 0,01 0,97 0,27 0,19 0,006 |
|
6 |
CwcDEe |
1,23 |
|
|
|
7 |
ccDEe |
11,82 |
cDE/cde cDE/cDe cDe/cdE |
10,04 0,72 0,06 |
|
8 |
ccDEE |
2,49 |
cDE/cDE cDE/cdE |
2,16 0,33 |
|
9 |
CcDee |
31,93 |
Cde/cde CDe/cDe cDe/Cde |
29,90 1,98 0,05 |
|
10 |
CwcDee |
2,38 |
|
|
|
11 |
CCDee |
16,81 |
CDe/СDe СDe/СDe |
16,01 0,80 |
|
12 |
CwCDee |
2,60 |
|
|
|
13 |
CwCwDe |
0,00 |
|
|
|
14 |
ccDee |
2,21 |
cDe/cde cDe/cDe |
2,10 0,11 |
|
Резус-отрицательные |
||||
|
15 |
ccddee |
12,71 |
cde/cde |
|
|
16 |
Ccddee |
1,54 |
Cde/cde |
|
|
17 |
CCddee |
0,03 |
Cde/Cde |
|
|
18 |
Cwcddee |
0,035 |
Cwde/cde |
|
|
19 |
ccddEe |
0,070 |
cde/cdE |
|
|
20 |
CcddEe |
0,35 |
Cde/cdE |
|
|
21 - 28 |
CwCddee CwCwddee ccddEE CcddEE CCddEE CCddEe CcddEe CwCddEe |
0,00 |
|
|
II. Общие замечания
1. Определение резус-принадлежности
Определение резус-принадлежности производится специалистом, имеющим специальную подготовку.
Определение резус-принадлежности реципиентов производится стандартной сывороткой анти-D, что дает возможность разделить их на резус - положительных (Rh+) и резус - отрицательных (rh-).
В отличие от реципиентов определение резус-принадлежности крови доноров производится в два этапа: сначала кровь доноров исследуется стандартной сывороткой анти-D, а затем кровь доноров, давшую отрицательную реакцию с сывороткой анти-D, исследуют дополнительно стандартными сыворотками антирезус, содержащими антитела анти-С и анти-Е. Антитела анти-С и анти-Е могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в сочетании с антителами анти-D, например: анти-D+С; анти-D+Е или анти-D+С+Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых дает отрицательную реакцию со всеми сыворотками, т.е, не содержит ни одного из этих трех антигенов резус D, С, Е.
Иногда такие дополнительные исследования требуется проводить и у других лиц - у больных с подозрением на изосенсибилизацию и у беременных женщин.
Результат определения резус-принадлежности крови доноров записывается в специальных листах или журнале и на лицевом листе донорского журнала (карточке) с указанием даты и за подписью лиц, производивших определение.
Результат определения резус-принадлежности крови больных и других лиц записывается в специальный журнал и на бланке с указанием даты и за подписью лиц, производивших определение. Этот бланк вклеивается в историю болезни и, кроме того, результат, указанный на этом бланке, записывается лечащим врачом в правом верхнем углу лицевого листа истории болезни и скрепляется его подписью с указанием даты.
2. Учет групповой принадлежности сыворотки антирезус.
Сыворотки антирезус изготавливаются обычно в виде "универсальных", т.е. лишенных групповых антител анти-А и анти-В. Такие сыворотки пригодны для определения резус-принадлежности крови людей любой гhуппы по системе АВО.
Однако, если изготовляются сыворотки антирезус различных групп по системе АВО, то в этих случаях при определении резус-принадлежности необходимо учитывать специфичность сыворотки. Сывороткой антирезус группы О(I) определяется резус-принадлежность только в эритроцитах группы O(I); сывороткой антирезус группы А(II) - только в эритроцитах групп O(I) и А(II); сывороткой антирезус групп B(III) - только в эритроцитах групп O(I) и B(III); сыворотной антирезус группы АВ(IV) и специально приготовленной "универсальной" резус-принадлежность определяется в эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови.
3. Контрольные исследования
При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяются стандартные резус - положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и cтандартные резус-отрицательные эритроциты.
О стандартных эритроцитах см. "Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов".
4. Особенности стандартных сывороток антирезус
Стандартные сыворотки для определения резус-принадлежности могут содержать резус-антитела разные по форме - полные и неполные (см."Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител"). Каждые из этих антител активны только в особых условиях, поэтому методика определения резус - принадлежности зависит от того, какие резус антитела находятся в стандартной сыворотке.
Метод использования каждой стандартной сыворотки антирезус указывается в сопроводительной инструкции.
III. Различные методы определения резус-принадлежности
Метод определения резус-принадлежности зависит от формы антител в стандартной сыворотке и способа ее изготовления.
При выдаче сыворотки антирезус к ней придается краткая сопроводительная инструкция с описанием того метода, для которого предназначена данная серия выдаваемой сыворотки.
1. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации с применением желатина в пробирке с подогревом 46 - 48 °С
а) Специальное оснащение.
Стандартная сыворотка антирезус анти-D с неполными антителами.
Стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля.
Центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл.
Водяная баня 46 - 48 °С. Суховоздушный термостат 46 - 48 °С
10 % раствор желатина. (Желатин можно сохранять с консервантом - сульфацилом натрия (альбуцид) - из расчета 100 мг альбуцида на 10 мл 10 % раствора желатина).
Лупа с 2 - 4-кратным увеличением.
б) Предварительная обработка испытуемой крови и стандартных эритроцитов. Кровь для исследования следует брать в количестве 5 - 8 мл в пробирку без стабилизатора. На пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество свободных эритроцитов, которые следует употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно, следует встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Допустимо хранить кровь в течение 2 - 3 суток при температуре +4 - 8 °С.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого натрия или другого стабилизатора (0,25 мл на 1 мл крови). В этом случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить доверху изотонический раствор NаСl содержимое ее перемешать и центрифугировать. Отмытые эритроциты использовать для исследования.
Непосредственно перед исследованием кровь может быть взята из места укола пальца стеклянной палочкой и немедленно помещена в пробирку с заранее введенной сывороткой антирезус, смешанной с желатином 1:2.
в) Техника определения. В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. На каждых двух пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться. Пробирки нумеруют. В одинаково обозначенные пробирки (в два ряда) вводят по 1 капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) стандартных Rh+ и rh- эритроцитов.
Во все пробирки первого ряда добавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус.
Во все пробирки (в два ряда) добавляют по две капли (0,1 мл) 10 % раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения.
Второй ряд является контролем для исключения возможного неспецифического склеивания исследуемых эритроцитов (прямая желатиновая проба).
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с пробирками помешают в водяную баню при 46 - 48 °С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 25 - 30 минут.
При извлечении пробирок из водяной бани или термостата доливают в них 5 - 8 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 1 - 2-кратного перевертывания пробирок.
г) Трактовка результатов. Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в виде красных комочков в прозрачной, почти обесцвеченной жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно окрашенная в светло-красный цвет, опалесцирующая жидкость.
Резус-положительная Резус-отрицательная.
Рисунок 1. Результат реакции определения резус-принадлежности методом с применением желатина.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-). Однако результаты учитывают как истинные после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус - положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I). В пробирках второго (контрольного) ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда (прямая желатиновая проба положительная) говорит о неспецифичности реакции. При этих условиях положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный. В таких случаях рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl для элюирования с них аутоантител и повторить исследование. При сомнительном результате для определения резус-принадлежности следует применить метод агглютинации в солевой среде с использованием сывороток антирезус, содержащих полные антитела.
2. Определение резус-принадлежности при помощи стандартного универсального реагента (в пробирках без подогрева)
Специальное оснащение:
стандартный универсальный реагент антирезус - анти-D;
33 % раствор полиглюкина;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл;
лупа с 2 - 4-кратным увеличением.
Предварительная обработка исследуемой крови не требуется. Может быть использована кровь, взятая непосредственно перед исследованием из места укола пальца, консервированная кровь и осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови, взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2 - 3 суток при 4 - 8 °С.
Техника реакции
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждой ряду и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус - отрицательных эритроцитов. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.
Во все пробирки первого ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки второго (контрольного) ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) изотонического раствора NаСl и по 1 капле (0,05 мл) 33 % раствора полиглюкина.
В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови. В пробирки, предназначенные для контроля, вводят стандартные резус-положительные и резус - отрицательные эритроциты.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального положения так, чтобы содержимое растекалось по ее стенкам. Такое растекание крови по стенкам пробирок делает реакцию более выраженной. Как правило, агглютинация наступает уже в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и четко выраженной реакции, а также в виду возможности замедленной реакции при слабо выраженной агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом при поворачивании пробирок проводят не менее 3 мин.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2 - 3 мл изотонического 0,85 % раствора NаСl и перемешивают содержимое 2 - 3-кратным перевертыванием пробирок, не встряхивая.
Трактовка результатов
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости исследуемую кровь считают резус-положительной (Rh+). При отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное окрашивание) исследуемую кровь следует считать резус-отрицательной (rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами, отрицательной - с резус-отрицательными, а также после просмотра результатов во 2-ом контрольном ряду.
Во всех пробирках 2-го контрольного ряда агглютинации быть не должно.
Резус-положительная. Резус-отрицательная.
Рисунок 2. Результат определения резус-принадлежности с помощью реагента.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов и, следовательно, не позволяет учесть результат исследования как истинный.
В этом случае рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl для элюирования с них аутоантител и повторить исследование.
В сомнительных случаях для определения резус-принадлежности следует применить метод агглютинации в солевой среде, используя сыворотку с полными антителами.
3. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации в сывороточной среде на плоскости с подогревом
Специальное оснащение:
стандартные сыворотки антирезус анти-D с неполными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пластмассовые пластины;
водяная баня 46 - 48 °С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 3 - 5 мл в обычные пробирки без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого берется кровь. Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество эритроцитов, которые следует употреблять для реакции. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встрянуть сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Эритроциты используют для исследования в виде 5 - 10 % взвеси в собственной сыворотке. Взвесь готовят на глаз в этих же пробирках путем встряхивания содержимого.
Допустимо хранить кровь в течение 2 - 3 суток при 4 - 8 °С.
Техника определения
На пластмассовую пластину у обозначений наносят по 1 большой капле (0,1 мл) сыворотки антирезус в три ряда по горизонтали, всего в 6 точек (3 - одной серии сывороток и 3 - другой). Кроме того, в одну точку наносят большую каплю (0,1 мл) стандартной сыворотки группы АВ(IV), не содержашей резус-антител (контроль на неспецифическую агглютинацию).
К первой капле каждой серии сыворотки добавляют одну каплю (0,05 мл) взвеси исследуемых эритроцитов, ко второй капле каждой серии - 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-положительных, одноименных с группой крови больного или группы O(I), и к третьей капле каждой серии - 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-отрицательных эритроцитов, обязательно одноименных с группой крови больного по системе АВО. В контрольную каплю с сывороткой группы АВ(IV), не содержащей резус-антител добавляют 1 каплю (0,05 мл) исследуемых эритроцитов. Капли перемешивают стеклянной палочкой и пластину опускают в водяную баню при 46 - 48 °С на 10 минут.
Трактовка результатов
Результаты исследований просматривают при легком покачивании пластины и трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы на почти обесцвеченном фоне жидкости.
При отрицательном результате капля остается равномерно окрашенной в красный цвет.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+).
Образцы эритроцитов, не давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-отрицательными (rh-). Однако, эти результаты учитывают как истинные только при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов эритроцитов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I), а также при отрицательном результате в контрольной капле с сывороткой группы АВ(IV), не содержащей резус-антител. Наличие агглютинации в этой капле говорит о неспецифическом склеивании эритроцитов и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный. В этих случаях резус-принадлежность следует определять, применяя другие методы исследования.
4. Определение резус-принадлежности реакцией агглютинации в солевой среде
Специальное оснащение:
стандартные сыворотки антирезус анти-D с полными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пробирки высотой 1,5 - 2,0 см и диаметром 0,5 - 0,6 cм с гладким дном округлой формы или планшеты для иммунологических реакций с углублениями такой же конфигурации и объема;
лупа с 2 - 4-кратным увеличением;
термостат 37 °С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 0,5 - 1 мл в обычные пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора лимоннокислого натрия или другого стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, содержимое их перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь без стабилизатора. При этом после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают как сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2 % взвесь, для чего 1 каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NаСl.
2 % взвесь эритроцитов употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2 - 3 суток при 4 - 8 °С.
Техника определения
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и две - для контролей. Предварительно штатив накрывают листом бумаги. На нем слегка накалывают отверстия, сквозь которые и устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться.
Во все пробирки (лунки планшета) первого ряда вводят по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки) второго ряда - по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой серии и во все пробирки (лунки) обоих рядов по 1 капле изотонического раствора NаСl.
В соответственно обозначенные пары пробирок (лунок планшета) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2 % взвеси испытуемых эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2 % взвеси контрольных (стандартных) резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.
Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37 °С на 1 час. Можно затем оставить пробирки на столе при комнатной температуре еще на 1,5 - 2 часа до учета результата.
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов
Пробирки (планшеты) следует рассматривать по продольной оси над источником света, закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными, они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается равномерным слоем без шероховатостей и неровностей, иногда с небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой правильно очерченный круг.
Диаметр осадка при отрицательном результате всегда меньше, чем при положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-).
Рисунок 4. Определение резус-принадлежности в солевой среде.
Резус-положительная. Резус-отрицательная.
Рисунок 5. Осадок эритроцитов при определении резус-принадлежности в солевой среде.
Однако результаты учитывают как истинные при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус - положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I).
Примечание. Полные антитела не выявляют слабый антиген Du.
Повторное использование сыворотки. После определения резус-принадлежности из всех пробирок осторожно отсасывают сыворотку (эритроциты остаются на дне) и собирают ее в пробирку. Эту сыворотку можно повторно несколько раз применять для определения резус-принадлежности, пока активность ее не иссякнет, т.е. пока она будет давать четкую агглютинацию со стандартными резус-положительными эритроцитами и отрицательную реакцию - со стандартными резус-отрицательными эритроцитами.
IV. Общие примечания
1. При определении резус-принадлежности независимо от метода определения результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность каждой серии сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус - отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I) и в других контрольных пробах, применяемых для каждого метода.
2. Если при определении резус-принадлежности наблюдается слабая или сомнительная реакция, то следует повторно исследовать кровь данного лица другими сериями сывороток антирезус и другими методами, включая метод агглютинации в солевой среде с сыворотками, содержащими полные антитела.
Если при этом все серии сывороток, содержащих неполные антитела, дадут также слабую или сомнительную реакцию, а с полными антителами реакция будет отрицательная, это значит, что эритроциты содержат слабую разновидность антигена резус, так называемый антиген Du, частота которого около 1 %. В этих случаях резус-принадлежность крови больного или беременной женщины указывают как резус-отрицательную (rh-), а резус - принадлежность крови донора как резус-положительную (Rh+), не допуская, таким образом, переливания его крови резус-отрицательным реципиентам.
V. Исследование других антигенов системы резус
При использовании сывороток, содержащих антитела анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е, анти-Сw в чистом виде, а также в сочетании с анти-D, например D+С; D+Е; D+С+Е, применяются те же методы, что и при использовании сыворотки антирезус анти-D. При этом учитывается форма антител.
В качестве контролей используют эритроциты, содержащие и не содержащие соответствующий антиген.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года № 05-14/29, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
Общие сведения
Методы определении резус-принадлежности на плоскости без подогрева позволяют быстро проводить исследование без применения особого лабораторного оборудования непосредственно у постели больного, а также у доноров как в единичных случаях, так и при массовых обследованиях.
Методы основаны на использовании сывороток антирезус, изготовленных в сочетании с коллоидными растворами (альбумин, полиглюкин), в присутствии которых неполные резус-антитела приобретают способность агглютинировать резус-положительные эритроциты на плоскости при комнатной температуре, аналогично реакции по определению групп крови АВО.
Наиболее удобными для практики являются методы определения на плоскости без подогрева, при помощи сыворотки антирезус, изготовленной в сочетании с альбумином и при помощи реактива антирезус, изготовленного из сыворотки антирезус в сочетании с сухим полиглюкином и альбумином.
1. Определение резус-принадлежности на плоскости без подогрева при помощи сыворотки антирезус, приготовленной с альбумином (прилагается при выдаче сыворотки)
Оснащение:
а) специально приготовленная универсальная сыворотка антирезус анти-D в комплекте с контрольной сывороткой;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NaCl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно из места укола или взятую заранее в пробирку со стабилизатором, но не более 2 суток хранения при 4 - 8 °С.
Техника реакции
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется и, сделав соответствующее обозначение, наносят на нее в две точки: слева по 2 капли сыворотки антирезус и справа по 2 капли контрольной сыворотки. Рядом с этими каплями наносят по 1 капле исследуемой крови. Кровь тщательно смешивают с сывороткой стеклянной палочкой и размазывают на пластинке до получения тонкого слоя. Затем пластинку периодически покачивают в течение 4 - 5 минут и добавляют в обе смеси по 1 капле изотонического раствора NaCl для снятия возможной неспецифической агглютинации. Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут, после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, то есть с сывороткой антирезус, произошла агглютинация эритроцитов, а справа (контроль) ее нет- кровь остается равномерно окрашенной, без признаков агглютинации, это значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
При наличии агглютинации в контрольной капле, что может произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, необходимо исследовать кровь повторно другими методами, желательно в лабораторных условиях.
2. Определение резус-принадлежности при помощи реактива антирезус, изготовленного с использованием сухого полиглюкина (прилагается при выдаче реактива)
Оснащение:
а) специально приготовленный реактив антирезус анти-D в комплекте с контрольным реактивом;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NаСl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со стабилизатором не более чем за 2 суток до исследования. Кровь хранят при 4 - 8 °С.
Техника реакции
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется и, сделав соответствующие обозначения, наносят на нее слева 1 каплю реактива анти-резус и справа - 1 каплю контрольного реактива, затем добавляют и к реактиву антирезус, и к контрольному реактиву по 1 капле густой взвеси исследуемой крови.
Кровь тщательно смешивают с реактивом и размазывают по пластинке стеклянной палочкой тонким слоем. Затем пластинку периодически покачивают в течение 3 - 4 минут и добавляют в обе смеси для исключения неспецифической агглютинации по 5 - 8 капель изотонического раствора NаСl.
Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут, после чего учитывают результат.
Трактовка результата
Если слева, т.е. с реактивом антирезус, произошла агглютинация эритроцитов, а справа (в контроле) ее нет - это значит, что исследуемая кровь резус - положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
Однако результат учитывают как истинный только при отсутствии агглютинации в контроле.
При наличии агглютинации в контроле, что может произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, кровь необходимо исследовать повторно другими методами, желательно в лабораторных условиях.
3. Изготовление универсальной сыворотки антирезус анти-D в сочетании с альбумином для определения резус-принадлежности на плоскости без подогрева
Сыворотка антирезус содержит неполные антитела анти-D. Выпускается в комплекте с контрольной сывороткой, не содержащей резус-антител. Сыворотка предназначена для определения резус-антигена D.
Материалом для изтотовления сыворотки антирезус в сочетании с альбумином служит сыворотка крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленная - универсальная с титром неполных резус-антител анти-D не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана годной, как стандартная сыворотка антирезус в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как резус-антител, так и групповых агглютининов альфа и бета.
Контрольная сыворотка должна соответствовать требованиям, предъявляемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.
При изготовлении сывороток антирезус в сочетании с альбумином необходимы:
- альбумин 20 - 30 % раствор, полученный из плазмы крови человека;
- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови, взятой на гепарине;
- гепарин;
- изотонический раствор NаСl.
Работу по изготовлению сыворотки начинают с подбора оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина. Подбор можно вести двумя способами:
а) используя одну и ту же сыворотку антирезус, испытывая с ней разные образцы (серии) альбумина, и выбирая таким образом образец альбумина с высокой конглютинационной активностью;
б) используя один и тот же образец (серию) альбумина, испытывая его с разными образцами сыворотки антирезус.
Выбор альбумина с высокой конглютинационной активностью.
Сыворотку антирезус с титром неполных антител 1:64 - 1:128 разводят в пробирках в 2 - 4 раза отдельно различными образцами раствора альбумина.
Разные смеси сыворотки антирезус с альбумином исследуют на пластинке с 5 - 6 образцами Rh+ и с 5 - 6 образцами крови ссddeе, а также с кровью фенотипа Ссddее и сcddEе.
Cыворотку антирезус, смешанную с альбумином, переносят в 2 точки по 2 капли (0,1 мл) на пластинку, добавляют к ней по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли перемешивают и размазывают по пластинке до получения тонкого слоя. Наблюдение ведут до истечения 5 минут при покачивании пластинки.
Учет и оценка результата
Результат учитывают по скорости наступления и величине агглютинатов резус-положительных эритроцитов и отсутствии агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами. На основании этого отбирают образwы альбумина, наиболее пригодные для использования.
Для последующего использования применяют образцы альбумина, при испытании которых агглютинация резус-положительных эритроцитов появляется в течение первых 20 - 30 секунд, а неспецифическая аггрегация резус-отрицательных эритроцитов отсутствует до истечения 10 минут.
Подбор сыворотки антирезус с высокой конглютинационной активностью в альбуминовой среде
Несколько различных образцов сыворотки антирезус наносят отдельно в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку и добавляют к ним по капле (0,05 мл) 20 - 30 % альбумина.
Сыворотку тщательно смешивают с альбумином и добавляют к ней по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли перемешивают с эритроцитами на плоскости до получения тонкого слоя. Наблюдение ведут до 5 минут при покачивании пластинки.
Так поступают отдельно для каждого испытуемого образца сыворотки, испытывая их с 5 - 6 образцами Rh+ крови и с 5 - 6 образцами крови ссddее, а также с кровью фенотипа Ссddее и сcddEe.
Учет и оценка результата
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и по отсутствию с резус-отрицательными эритроцитами ссddее и эритроцитами генотипа Ссddее и ссddЕе.
Для последующего использования выбирают сыворотки антирезус анти-D, при испытании которых четко выраженная агглютинация резус - положительных эритроцитов наступает в течение первых 20 - 30 секунд, а неспецифическая агглютинация резус-отрицательных эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe отсутствует до истечения 10 минут.
Подбор оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина
После выбора альбумина с наиболее высокой коглютинирующей способностью или, наоборот, выбора сыворотки антирезус с высокой агглютинирующей активностью в альбуминовой среде, приступают к подбору оптимального их соотношения, для чего:
в штатив устанавливают 5 пронумерованных пробирок;
в первую пробирку вносят 2 капли (0,1 мл) выбранной серии альбумина, во вторую пробирку - 4 капли, в третью - 6, в четвертую - 8 и в пятую - 10 капель;
в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) сыворотки антирезус и содержимое тщательно перемешивают;
из каждой пробирки переносят в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку, образуя таким образом 2 ряда сыворотки с альбумином;
во все капли первого ряда вносят по 1 капле (0,05 мл) свежей резус-положительной крови, во 2-ой - резус-отрицательной крови (кровь предварительно берут с гепарином - 1 капля на 10 мл крови). Смесь перемешивают и ведут наблюдение в течение 3 минут при покачивании пластинки.
Учет и оценка результатов
Четкая аглютинация Rh-эритроцитов и отсутствие аглютинации rhэритроцитов ccddee и эритроцитов фенотипа Ссddee и ccddEe указывает на оптимальное соотношение данного образца сыворотки антирезус и альбумина.
Приготовление основного объема (серии) сыворотки антирезус анти-D в сочетании с альбумином
Для приготовления полного объема (серии) стандартной сыворотки используют выбранные оптимальные соотношения сыворотки и альбумина. И сыворотку и альбумин используют тех же серий, которые применялись для установления оптимального их соотношения.
К изготовленному полному объему смеси сыворотки с альбумином добавляют гепарин из расчета - 1 капля на 20 мл сывортки.
Приготовленную таким образом сыворотку проверяют на пластинках с 5 - 6 образцами резус-положительных эритроцитов и с 5 - 6 образцами резус-отрицательных ccddee , а также с эритроцитами фенотипа Ccddee и ccddEe.
При наличии четко выраженной агглютинации с резус-положительной кровью, наступающей через 30 - 40 сек, и отрицательной реакции с резус - отрицательной кровью ссddee и кровью фенотипа Ссddee и ссddЕe, сыворотку антирезус в сочетании с альбумином считают пригодной в качестве стандартной сыворотки анти-D для определения резус - принадлежности на плоскости без подогрева.
Исследование проводят с одновременным параллельным использованием контрольной сыворотки.
Изготовление контрольной сыворотки
Для изготовления контрольной сыворотки используют изогемагглютинирующую сыворотку группы АВ(IV) и добавляют к ней альбумин того же образца (серии) и в том же количестве и в соотношении, которые были использованы для приготовления данной серии сыворотки антирезус.
Контрольную сыворотку испытывают аналогично тому, как описано выше для сыворотки антирезус. Контрольная сыворотка не должна вызывать агглютинацию эритроцитов.
Консервирование сыворотки
Сыворотку антирезус и контрольную сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл сыворотки.
Розлив и паспортизация сыворотки антирезус и контрольной сыворотки.
Сыворотку антирезус разливают по 1 - 2 мл в ампулы, которые запаивают, или во флаконы, которые плотно укупоривают резиновыми пробками. На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего сыворотку, специфичности сыворотки, метода, для которого она предназначена, количества, номера серии и срока годности.
Контрольную сыворотку разливают, в таких же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и так же наклеивают этикетки. Номер серии контрольной сыворотки повторяет номер серии основной сыворотки антирезус.
Хранение, срок годности и контроль
Сыворотки антирезус, изготовленные в сочетании с альбумином, и контрольные сыворотки хранят при 4 - 8 °С.
Срок годности - 4 месяца.
По истечении срока годности, но при сохранении активности и специфичности сывороток, срок годности может быть продлен еще на 1 месяц.
Выдача сыворотки антирезус
Сыворотка антирезус выдается в комплекте с контрольной сывороткой.
К каждому комплекту прилагают инструкцию по использованию.
|
Наименование учреждения изготовителя |
|
Наименование учреждения изготовителя |
|
Сыворотка антирезус-D для метода на плоскости без подогрева Для всех групп крови системы АВО Серия __________ мл ______ Годна до ________________ |
|
Контрольная сыворотка для метода на плоскости без подогрева Для всех групп крови системы АВО Серия __________ мл ______ Годна до ________________ |
Формы этикеток для сыворотки антирезус и контрольной сыворотки.
4. Изготовление реактива антирезус с использованием сухого полиглюкина для определения резус принадлежности на плоскости без подогрева
Реактив содержит неполные активные антитела антирезус анти-D, представляет собой вязкий опалесцирующий мутноватый раствор. При хранении может выпадать осадок. Выпускается в комплекте с контрольным реактивом, не содержащим резус-антител.
Материалом для изготовления реактива антирезус служат нативные сыворотки крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленные - универсальные с титром неполных резус-антител не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана годной, как стандартная сыворотка антирезус.
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как резус-антител, так и групповых антител альфа и бета. Контрольная сыворотка должна ... тов.
Содержимое капель перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и оставляют на 3 минуты, периодически покачивая пластинку; через 3 минуты во все капли добавляют по 5 - 6 капель изотонического раствора NаСl, перемешивают и через 2 минуты учитывают результат.
Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты Ссddeе и ссddЕе.
Учет и оценка результатов
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее с резус-отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа Ссddеe и rccddEe.
Показателем пригодности реактива для последующего использования является наличие крупно-зернистой агглютинации резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1 минуты и отсутствие ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddee) и эритроцитами фенотипа СсddEe и ссddEe.
Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.
Консервирование реактивов
Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл реагента.
Розлив и паспортизация
Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают или парафинируют.
На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого он предназначен, количества, номера серии и срока годности.
Контрольный реактив разливают в такие же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и также наклеивают этикетки с соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива повторяет номер серии основного реактива антирезус.
Соответствовать требованиям, предъявлаемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.
При изготовлении реактива антирезус необходимы:
полиглюкин, высушенный лиофильным способом;
альбумин - 2,5 % раствор;
изотонический раствор NаСl;
образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови.
Примечания:
1. Полиглюкин высушивают лиофильным способом на сублимационном аппарате по регламенту, установленному для сушки плазмы. Сушку ведут во флаконах емкостью 250 - 500 мл.
2. 2,5 % раствор альбумина получают из готового 10 %-20 % раствора альбумина путем разведения его изотоническим раствором NаСl.
Изготовление реактива антирезус
Сыворотку, содержащую антитела анти-D с титром не ниже чем 1:64 - 1:1288, переносят во флакон с предварительно высушенным полиглюкином в объеме, равном количеству жидкого полиглюкина, высушенного в данном флаконе. В результате конечная концентрация полиглюкина составит 6 %.
Содержимое флакона тщательно перемешивают путем встряхивания до полного растворения порошка полиглюкина.
_____________
8 Примечание: сыворотку антирезус с более высоким титром можно развести до этого значения сывороткой группы АВ(IV), стандартным разводителем или 2,5 % раствором альбумина в изотоническом растворе NаСl.
Изготовление контрольного реактива.
Для изготовления контрольного реактива в другой такой же флакон с высушенным полиглюкином той же серии добавляют стандартный разводитель или 2,5 % раствор альбумина так же до исходного объема полиглюкина. Содержимое тщательно перемешивают до полного растворения порошка полиглюкина.
Исследование качества изготовленных реактивов.
Исследование реактивов производят непосредственно после их изготовления с резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами и оценивают по характеру агглютинации и специфичности реакции:
на пластинку помещают два ряда, слева - по две капли (0,1 мл) реактива антирезус и справа - по две капли (0,1 мл) контрольного реактива;
в первый ряд добавляют по одной капле (0,05 мл) резус - положительных эритроцитов, во второй ряд также по одной капле резус - отрицательных эритроцитов. Содержимое капель перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и оставляют на три минуты, периодически покачивая пластинку;
через три минуты во все капли добавляют по 5 - 6 капель изотонического раствора NаСl, перемешивают и через две минуты учитывают результат.
Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных эритроцитов групп А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты Ссddее и ссddEе.
Учет и оценка результатов
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа Ссddее и rccddЕе.
Показателем пригодности реактива для последующего использования является наличие крупно-зернистой агглютинации резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1 минуты и отсутствие ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа СсddЕе и ссddЕе.
Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.
Консервирование реактивов
Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл реагента.
Розлив и паспортизация
Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают или парафинируют.
На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого он предназначен, количества, номера серии и срока годности.
Контрольный реактив разливают в такие же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и также наклеивают этикетки с соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива повторяет номер серии основного реактива антирезус.
|
Наименование учреждения изготовителя |
|
Наименование учреждения изготовителя |
|
Реактив антирезус - D для метода на плоскости без подогрева Серия _________ мл ______ Годен до _______________ |
|
Контрольный реактив для метода на плоскости без подогрева Серия _________ мл ______ Годен до _______________ |
Формы этикеток для реактива антирезус и контрольного реактива
Хранение, срок годности и контроль
Реактив антирезус, приготовленный с сухим полиглюкином и контрольный реактив хранят при 4 - 8 °С. Срок годности 4 месяца.
Реактив антирезус и контрольный реактив проверяют на активность и специфичность через месяц.
Выдача реактива антирезус
Реактив антирезус выдается, в комплекте с контрольным реактивом.
К каждому комплекту (или набору комплектов) придается инструкция по использованию.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 6 декабря 1990 года № 05-14/38-14 считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция9 по применению Цоликлона анти-В диагностического жидкого для определения D антигена системы резус (Антитела моноклональные анти-D) ТУ 9398-215-27575295-95
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Назначение
Цоликлона анти-D предназначен для выявления D антигена системы резус в эритроцитах человека и применяется в серологических тестах взамен или параллельно с изоиммунной анти-D сывороткой.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен "Инструкцией по определению резус-принадлежности крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в 1997 году и Методическими рекомендациями по определению резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994 года.
_____________
9 Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю. Митерев, научные сотрудники Л.Н. Леменева, Н.И. Оловникова, Е.В. Белкина.
2. Характеристика и основные свойства Цоликлона Анти-D
Действующим началом Цоликлона Анти-D являются моноклональные анти-D антитела, продуцируемые лимфобластонаной линией клеток человека, полученной из лимфоцитов донора, гипериммунного против D антигена. Антитела, продуцируемые клетками одного клона, являются моноклональными, принадлежат к одному классу иммуноглобулинов, полностью идентичны по структуре и биологической активности.
Поскольку линия клеток, секретирующих моноклональные анти-D антитела, получена из лимфоцитов здорового донора, исключена контаминация реагента патогенными вирусами (гепатит, СПИД и др.). Однако с исследуемыми образцами крови следует работать в перчатках во избежание заражения патогенными вирусами, передающимися через кровь.
Цоликлон анти-D представляет собой неразбавленную или разведенную солевым раствором культуральную жидкость, кондиционированную клетками - продуцентами антител. Анти-D моноклональные антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса G (IgGl). Цоликлон Анти-D не содержит антител иной специфичности и поэтому может быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой группы крови.
Анти-D антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G (неполные антитела), не вызывают прямой агглютинации эритроцитов, содержащих D антиген, и могут быть использованы в реакции конглютинации с желатином, непрямом антиглобулиновом тесте (пробе Кумбса), в реакции агглютинации эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, в том числе в автоматизированных системах типа "Группоматик".
3. Техника определения D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной с помощью применяемых консервантов, в крови, взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов. Заключение о присутствии D-антигена в исследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакции агглютинации.
3.1. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса)
Является наиболее чувствительным методом выявления D антигена. Взвесь (2 - 3 %) в физиологическом растворе трижды отмытых исследуемых эритроцитов помещают в круглодонную пробирку (0,1 мл взвеси эритроцитов) или 96-ячеечную круглодонную плату (0,05 мл/ячейку), добавляют равный объем Цоликлона и инкубируют в течение 45 - 60 минут при 37 °С. Затем после однократного отмывания физиологическим раствором к осадку эритроцитов добавляют 0,05 - 0,1 мл антиглобулиновой сыворотки, тщательно перемешивают и немедленно или через 15 - 30 минут инкубации при комнатной температуре центрифугируют при 200 g в течение 35 - 20 секунд. Осадок мягко взвешивают и по наличию агглютинатов, выявляемых макро- или микроскопически, делают заключение о присутствии D антигена в исследуемых эритроцитах.
3.2. Реакция конглютинации с желатином
В агглютинационную пробирку вносят одну каплю (0,05 - 0,1 мл) свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или эритроцитов, отмытых от консерванта. Затем добавляют две капли (0,3 - 0,2 мл) 10 % раствора желатина, предварительно прогретого при 45 - 50 °С до разжижения, и одну каплю Цоликлона Анти-D. Суспензию тщательно перемешивают, инкубируют 10 - 15 минут в водяной бане или 30 минут в термостате при 48 °С, прибавляют 5 - 6 мл физиологического раствора и после осторожного переворачивания пробирки визуально определяют наличие агглютинатов. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о присутствии в них D антигена.
3.3 Реакция с препаратом на основе полиглюкина
Полиглюкин практически всегда вызывает неспецифическую агглютинацию D-отрицательных эритроцитов, поэтому невозможно объективное заключение об отсутствии D антигена или о наличии его слабого варианта в исследуемых эритроцитах. В связи с этим использование полиглюкина для моноклональных антител не рекомендуется.
3.4. Реакция агглютинации с эритроцитами, обработанными протеолитическими ферментами
Цоликлон Анти-D, содержащий моноклональные антитела класса lgG, способен вызывать прямую агглютинацию D-положительных эритроцитов, обработанных такими протеолитическими ферментами как бромелин, папаин и др., и поэтому может применяться в автоматических системах типирования крови.
3.5. Контроль специфичности реакции агглютинации
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики исследования) необходимо использовать стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты. Желательно также включение образцов со слабовыраженным D антигеном.
4. Форма выпуска
Цоликлон Анти-D выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1 %.
Срок хранения - два года в холодильнике при 2 - 8 °С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным, протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2 - 3 невскрытых флакона данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-D диагностического жидкого для определения D антигена системы резус (Антитела моноклональные анти-D)", утвержденную Главным техническим Управлением Минздрава СССР 21 августа 1990 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция10 по применению анти-D IgM моноклонального реагента для определения резус-принадлежности крови человека (Цоликлона анти-D Супер) ТУ 9398-206-27575295-94
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Назначение
Цоликлон анти-D Супер предназначен для выявления антигена D системы резус в эритроцитах человека.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен "Инструкцией по определению резус-принадлежности крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в 1997 году и Методическими рекомендациями по определению резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994 года.
В связи с тем, что IgM антитела не вызывают агглютинации некоторых образцов эритроцитов со слабовыраженным D антигеном (Du), образцы донорской крови, которые при исследовании Цоликлоном анти-D Супер были определены как D-отрицательные, необходимо дополнительно тестировать с помощью анти-D реагентов, содержащих lgG-антитела (поликлональной сывороткой или моноклональным анти-D lgG реагентом).
_____________
10 Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю. Митерев, научные сотрудники Л.Н. Леменева, Н.И. Оловникова, Е.В. Белкина.
2. Характеристика и основные свойства Цоликлона Анти-D Супер
Действующим началом Цоликлон Анти-D Супер являются моноклональные анти-D антитела, которые продуцируются гетерогибридомой, полученной в результате слияния человеческой лимфобластоидной линии с миеломной клеточной линией мыши.
Цоликлон Анти-D Супер изготовлен на основе культуральной жидкости, кондиционированной клетками-продуцентами антител Анти-D. Реагент не содержит антител иной специфичности и поэтому может быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой группы крови.
Моноклональные антитела принадлежат к одному классу иммуноглобулинов - IgM, полностью идентичны по структуре и биологической активности. Анти-D антитела класса М являются полными антителами, т.е. вызывают прямую агглютинацию эритроцитов, содержащих D антиген. Цоликлон Анти-D Супер может быть использован для выявления D антигена в любых вариантах прямой реакции агглютинации: на плоскости, в пробирках, в микроплате.
3. Определение D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной консервантом; в крови, взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
На пластину со смачиваемой поверхностью нанесите большую каплю (около 0,1 мл) реагента. Рядом поместите маленькую каплю (0,01 - 0,05 мл) исследуемой крови и смешайте кровь с реагентом. Наиболее крупная агглютиниция наблюдается при использовании эритроцитов в высокой концентрации. Реакция агглютинации начинает развиваться через 10 - 15 секунд, четко выраженная агглютинация наступает через 30 - 60 секунд. Использование подогретой до 37 - 40 °С пластинки сокращает время наступления агглютинации. Результаты реакции учитывайте через три минуты. Пластинку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20 - 30 секунд, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
В круглодонную пробирку внесите одну каплю (около 0,1 мл) реагента и добавьте одну каплю 5 % суспензии исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе. Содержимое пробирки тщательно перемешайте встряхиванием и инкубируйте 30 минут при комнатной температуре. После инкубации пробирку центрифугируйте при 1500 - 2000 оборотах в минуту в течение одной минуты. Мягко покачивая пробирку, отслоите осадок ото дна. При отрицательном результате осадок эритроцитов разбивается, образуя непрозрачную гомогенную суспензию. При положительном результате в пробирке видны агглютинаты на фоне прозрачной жидкости.
3.3 Реакции агглютинации в микроплате
В лунку 96-ячеечной круглодонной микроплаты внесите 0,05 мл реагента и 0,05 мл 2 % суспензии исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе (эритроциты предварительно дважды отмойте). Через 45 - 60 минут инкубации при комнатной температуре визуально оцените результат реакции по рисунку осадка эритроцитов на дне лунки: при отрицательном результате осадок эритроцитов собирается в точку, при положительном - имеет больший диаметр, располагается неравномерным слоем, имеет неровные или завернутые края.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики) необходимо использовать стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты.
4. Форма выпуска
Цоликлон Анти-D Супер выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 2,5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1 %
Срок хранения - один год в холодильнике при 2 - 8 °С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным, протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2 - 3 невскрытых флакона данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению анти-Rho(D) IgМ моноклонального реагента для определения резус-принадлежности крови человека (Цоликлона анти-D Супер)", утвержденную Управлением научных исследований МЗ и МП РФ 14 июля 1994 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по исследованию сыворотки на наличие резус-антител
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
I. Введение
Резус-антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам, они не являются нормальным свойством сыворотки человека, а появляются в крови резус-отрицательных людей лишь при особых условиях.
Условиями, способствующими образованию резус-антител, являются введение резус-отрицательному человеку резус - положительной крови или беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом.
Определение резус-антител наряду с определением резус - принадлежности больного и донора необходимо для предупреждения переливания резус - несовместимой крови, а также для диагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью.
Определение резус-антител требуется также при подготовке материала в целях использования для приготовления сывороток антирезус.
Резус-антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные.
Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них резус-антигены.
Полные антитела, соединяясь с резус-антигенами эритроцитов, вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта реакция ничем не проявляется.
Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между неполными резус-антителами и эритроцитами, необходимы специальные условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин, полиглюкин), или использование сыворотки для пробы Кумбса, реагирующей с человеческим белком (непрямая проба Кумбса). При всех перечисленных условиях реакция между резус-антителами и эритроцитами, содержащими резус-антиген, в конечном итоге также проявляется в виде агглютинации эритроцитов.
Разные методы определения резус-антител требуют различных оптимальных для них температурных условий.
II. Общие замечания
1. Учет специфичности антител. Специфичность стандартных эритроцитов
Наиболее часто при иммунизации резус-отрицательных людей повторными трансфузиями крови или беременностями образуются антитела анти-D, но при этих же условиях могут образоваться и другие резус-антитела. Поэтому при определении антител в сыворотке крови человека эту сыворотку испытывают с резус-положительными эритроцитами, обязательно содержащими антигены резус: D, С, Е, с, е.
Если антигены С и Е в эритроцитах специально не определялись, то число резус-положительных образцов должно быть не менее 20 для того, чтобы среди них обязательно встретились все антигены резус.
В качестве контроля на специфичность реакции, а также для выявления антител анти-с и е в исследование включаются стандартные резус-отрицательные - сcddee эритроциты и, если возможно, собственные эритроциты лица, сыворотка которого испытывается.
Такое исследование является предварительным. Для уточнения специфичности требуются дополнительные специальные исследования (см. п. IХ).
2. Учет формы антител
Чаще всего при иммунизации резус-антигеном образуются неполные антитела: иногда одновременно с ними образуются и полные. Кроме того, встречаются случаи, в которых у человека образуются только полные резус-антитела.
Поэтому определение резус-антител следует производить не менее чем двумя методами, одним из которых обязательно должен быть метод солевой агглютинации, выявляющий полные антитела, а другим - любой метод, выявляющий неполные антитела.
III. О выборе метода выявления резус-антител
Ниже в п. III, IV, V, VI описаны различные методы исследования сывороток. Из них непрямая проба Кумбса (см. III), реакция с применением желатина (см. IV) и реакция с применением полиглюкина (см. V) выявляют неполные резус-антитела, и для этой цели может быть использован любой из них.
Метод исследования сыворотки в солевой среде (см. VI) выявляет полные резус-антитела и должен обязательно использоваться одновременно с любым из упомянутых выше.
IV. Исследование сыворотки на наличие неполных резус-антител непрямой пробой Кумбса
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут в количестве 0,5 - 1 мл в обычные пробирки емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Пробирки доливают доверху изотоническим раствором NаСl, затем содержимое пробирок перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды. После отмывания на дне пробирки остаются отмытые эритроциты, которые и применяют для исследования сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают и нумеруют пробирки высотой 4 - 10 см с внутренним диаметром 0,5 - 0,8 см (первые размеры удобнее). Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) испытуемой сыворотки.
в. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые стандартные эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой набирают маленькую каплю (0,01 мл) эритроцитов и переносят ее в пробирку с испытуемой сывороткой согласно нумерации пробирок.
г. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и помещают для инкубации в термостат на 45 мин. при температуре +37 °С. За это время резус-антитела, если они имеются в испытуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
д. После инкубации в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют, после чего надосадочную жидкость отсасывают.
Такое отмывание эритроцитов повторяют 3 - 4 раза.
е. В каждую пробирку к отмытым таким образом эритроцитам добавляют 4 - 7 капель изотонического раствора NаСl для получения 5 % взвеси (так как при отмывании эритроциты частично захватываются, интенсивность взвеси контролируют глазом).
ж. Одну каплю (0,05 мл) взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью и к каждой капле прибавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки, приготовленной для пробы Кумбса.
з. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (стеклянной палочкой или углом предметного стекла), после чего пластинку слегка покачивают. При этом наблюдают результат (наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов).
Агглютинация обычно начинается в течение первых 10 - 30 сек, но при слабом титре резус-антител может наступить до 20 мин.
3. Трактовка результата
Наличие агглютинации в каплях с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на присутствие в сыворотке неполных резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные резус-антитела - анти-D, С, Е, с, и е - не выявлены.
Определение специфичности выявленных антител см. п. IХ.
4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) изотонического раствора NаСl.
в. В первую пробирку (с обозначением 1:2) вводят три капли (0,15 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания ее содержимого переносят три капли в следующую и т.д. до последней пробирки, из которой три капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения испытуемой сыворотки от 1:2 до 1:1024.
г. Во все пробирки добавляют пастеровской пипеткой по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных резус - положительных эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4 - 5 резус-положительных лиц и приготовленных так же, как готовят стандартные эритроциты.
д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив помещают на 45 мин. в термостат при температуре +37 °С.
е. После инкубации эритроциты отмывают и из них готовят 5 % взвесь. Затем из каждой пробирки переносят одну каплю (0,05 мл) взвеси на белую пластинку и к каждой капле взвеси прибавляют одну каплю (0,05 мл) сыворотки для пробы Кумбса, которую смешивают с эритроцитами. Далее в течение пяти минут наблюдают результат при покачивании пластинки.
ж. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация (время наблюдения 5 мин), принимается за титр выявленных неполных резус-антител. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.
V. Исследование сыворотки на наличие неполных резус-антител с применением желатина
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут не более, чем за 2 - 3 дня до исследования в количестве 3 - 5 мл в обычные пробирки без стабилизатора. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. При этом обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество эритроцитов, которые и применяют для исследования. Эритроциты берут со дна пробирки пастеровской пипеткой: если при этом захватывается небольшое количество собственной сыворотки, это не влияет на ход реакции.
Если эритроцитов, оставшихся свободными после свертывания крови, недостаточно, то допускается интенсивное встряхивание свертка для отделения дополнительного количества эритроцитов.
Можно брать кровь с цитратом натрия. В этом случае эритроциты необходимо отмыть изотоническим раствором NаСl.
Для установления титра антител эритроциты готовят ех tempore. В пробирку к одной части эритроцитов добавляют 9 частей 10 % раствора желатина, подогретого до разжижения. При этом получается 10 % взвесь эритроцитов в желатине.
2.Техника исследования
а. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около 10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.
в. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10 % раствора желатина, подогретого до разжижения. (Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойства застудневать при температуре 4 - 8 °С желатин не пригоден).
г. После этого во все пробирки вводят по 1 - 2 капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого и помещают в водяную баню при температуре 46 - 48 °С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 45 мин.
д. В пробирки по извлечении из водяной бани наливают 5 - 8 мл изотонического раствора NаСl. Содержимое пробирок перемешивают путем одно - двукратного перевертывания их и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результата
Результат реакции просматривают на свет.
Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.
Для этого каплю содержимого пробирки помещают с помощью стеклянной палочки на предметное стекло и просматривают под малым увеличением.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в испытуемой сыворотке неполных резус - антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные резус-антитела анти-D, С, Е, а также с и е - не выявлены.
Определение специфичности выявленных антител см. п. IХ.
4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями: 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
б. Во все пробирки вводят по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NаСl.
в. В первую пробирку этой же пипеткой вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания две капли переносят во вторую, из второй - в третью, из третьей - в четвертую и так до последней пробирки, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения сывороток от 1:2 до 1:1024.
г. Во все пробирки добавляют по две капли стандартных резус - положительных эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4 - 5 резус-положительных лиц и приготовленных, как сказано ниже в виде 10 % взвеси в желатине.
д. Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при температуре +46 - 48 °С на 10 мин. или в суховоздушный термостат на 30 мин.
е. По извлечении пробирок из водяной бани в них доливают по 5 - 8 мл изотонического раствора NаСl и наблюдают результат. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимается за титр выявленных неполных резус-антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжать разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.
VI. Исследование сыворотки на наличие неполных антител с применением полиглюкина (в пробирках без подогрева)
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут не более чем за 2 - 3 дня до исследования в обычные пробирки. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Может быть использована любая кровь: непосредственно взятая из пальца, эритроциты из осадка в пробирке после образования свертка и консервированная, отмытая изотоническим раствором NаСl.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают пробирки вместимостью 8 - 10 мл, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по две капли исследуемой сыворотки.
в. Согласно нумерации в пробирки вводят по одной капле стандартных эритроцитов.
г. Во все пробирки вводят по одной капле 33 % раствора полиглюкина.
д. Пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого, затем наклоняют почти до горизонтального положения и медленно поворачивают по горизонтальной оси так, чтобы содержимое растекалось по их стенкам. Контакт эритроцитов с исследуемой сывороткой при поворачивании пробирок продолжают три минуты.
е. Через 3 - 5 мин в пробирки наливают 3 - 4 мл изотонического раствора NаСl, осторожно перемешивают содержимое путем 2 - 3-кратного перевертывания пробирки (не взбалтывать!) и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результатов
Результаты просматривают на свет невооруженным глазом.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в исследуемой сыворотке резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные антитела анти-D, С, Е, а также с и е не выявлены.
Определение специфичности антител см. п. IХ.
VII. Исследование сыворотки на наличие полных антител в реакции агглютинации в солевой среде
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут в количестве 1 - 2 мл (и более, смотря по потребности) в пробирки вместимостью 8 - 10 мл, содержащие изотонический раствор лимонно-кислого натрия (из расчета 0,25 мл на 1 мл крови). Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию и инициалы лица, от которого взята кровь.
После взятия крови в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, затем содержимое их перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды.
Можно брать кровь и без стабилизатора. В этом случае после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как сказано выше.
Из отмытых эритроцитов готовят 2 % взвесь в других пробирках, взятых по числу образцов стандартных эритроцитов и так же пронумерованных.
Для приготовления 2 % взвеси в эти пробирки капают по 2,5 мл (49 капель) изотонического раствора NаСl и в каждую пробирку в соответствии с ее нумерацией переносят одну каплю эритроцитов. Содержимое пробирок перемешивают для получения равномерной 2 % взвеси эритроцитов, которая применяется для исследования сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают ряд маленьких пробирок (высотой 2 - 2,5 см с внутренним диаметром 0,5 - 0,6 см, с гладким дном округлой формы) по числу образцов эритроцитов, с которыми испытывается сыворотка. Предварительно штатив покрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки. Против каждой пробирки на бумаге пишут порядковый номер, а также фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь.
Вместо пробирок можно использовать планшеты для иммунологических реакций с лунками, имеющими закругленное дно.
б. Во все пробирки (лунки планшета) вводят по одной капле (0,05 мл) испытуемой сыворотки и по одной капле изотонического раствора NаСl.
Штатив с пробирками (планшет) встряхивают для перемешивания их содержимого.
в. В пробирки (лунки), согласно их нумерации и обозначению, вводят по одной (0,05 мл) капле 2 % взвеси эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.
г. Содержимое снова перемешивают и штатив (планшет) помещают для инкубации в термостат при +37 °С на один час и затем оставляют на столе при комнатной температуре на 2 - 3 часа.
д. После инкубации штатив с пробирками (планшет) вынимают и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результата
Результат реакции учитывают при помощи лупы с 6 - 8-кратным увеличением по форме осадка эритроцитов на дне пробирки (лунки) (см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности крови методом агглютинации в солевой среде").
Наличие агглютинации с резус-положительными образцами эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывают на присутствие в сыворотке полных резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что полные резус антитела анти-D, С, Е, а также с и е не выявлены.
Определение специфичности см. п. IХ.
4. Титрование сыворотки, содержащей полные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 маленьких пробирок для разведения сывороток 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024. Можно использовать планшет для иммунологических реакций.
б. Во все пробирки (лунки) капают по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NаСl.
в. В первую пробирку (лунку) (с обозначением 1:2) вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. После перемешивания из первой пробирки (лунки) переносят две капли во вторую, из второй - в третью и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате получаются разведения сыворотки от 1:2 до 1: 1024.
г. В каждую пробирку (лунку) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2 % взвеси стандартных эритроцитов или смеси, приготовленной от 4 - 5 резус-положительных лиц. Эритроциты для взвеси готовят, как сказано выше.
д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив (планшет) помещают в термостат при температуре +37 °С на один час.
е. После инкубации штатив (планшет) вынимают из термостата и наблюдают результат.
Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимают за титр выявленных полных резус-антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В таких случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.
VIII. Феномен зоны
При очень высокой степени иммунизации организма образующиеся резус-антитела иногда дают феномен зоны. Этот феномен заключается в том, что сыворотка крови таких лиц, будучи взята неразведенной или в небольшом разведении (1:2), может не дать или дать слабую положительную реакцию при ее испытании с резус-положительными эритроцитами. Однако, если такую сыворотку развести, то при некотором разведении (чаще всего 1:8, 1:16, иногда и более) резус-антитела в ней становятся активными и дают хорошо выраженную положительную реакцию. Реже всего феномен зоны бывает выражен в методе конглютинации с желатином или при испытании сыворотки непрямой пробой Кумбса. Поэтому, а также ввиду большей ее чувствительности, проба Кумбса является очень ценной реакцией для выявления неполных резус-антител.
Если все методы, включая непрямую пробу Кумбса, не выявляют в сыворотке резус-антител, а в анамнезе у лица, кровь которого испытывается, есть указания на сенсибилизацию к резус - антигену, то для исключения феномена зоны следует испытать эту сыворотку, взятую в разведениях. Для этого сыворотка разводится и испытывается, как указано для каждого метода в разделах "Титрование сыворотки".
Если при наблюдении результата в каких-либо разведениях сыворотки отмечается положительная реакция, следовательно, в испытуемой сыворотке есть антитела. В этих случаях для дальнейшего исследования сыворотки ее следует развести, при этом выбрать то разведение, в котором наблюдалась наиболее выраженная положительная реакция. В качестве разводителя при исследовании применяют изотонический раствор NаСl. Исследование разведенной сыворотки проводится как описано выше для каждого метода. При установлении высоты титра учитывается общее разведение нативной сыворотки, начиная с 1:2.
IХ. Специфичность антител
Сыворотки, давшие положительный результат со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, могут содержать как "чистые" антитела анти-D, так и одновременно антитела к нескольким антигенам: анти-С+D, анти-D+Е или анти-С+D+Е.
В некоторых случаях исследуемые сыворотки, содержащие резус-антитела, могут вызвать агглютинацию избирательно - не всех образцов резус-положительных эритроцитов. Это может быть связано с тем, что в испытуемой сыворотке имеются антитела не анти-D (наиболее часто встречающиеся, а анти-С или анти-Е).
Положительный результат может также наблюдаться и с резус-отрицательными эритроцитами за счет других антигенов системы резус - с, е или антигенов других систем.
Для выяснения специфичности резус-антител необходимо специальное исследование сыворотки с набором стандартных эритроцитов, включающих редкие группы ссDее, Сcddeе, ссddЕе, а также резус-отрицательные образцы (сcddeе), включающие как содержащие, так и не содержащие антигены Келл (К) и Даффи (Fу). С ними же проводится и титрование сыворотки.
Х. Общее заключение
1. Заключение о наличии в сыворотке резус-антител можно сделать при положительном результате, полученном любым методом исследования.
2. Заключение об отсутствии в сыворотке резус-антител можно сделать только при отрицательном результате, полученном при исследовании не менее чем двумя методами, одним из которых является любой метод, выявляющий неполные резус - антитела, а другим - реакция агглютинации в солевой среде, выявляющая полные резус-антитела. При этом следует учитывать возможный феномен зоны.
"Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года № 05-14/30, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по изготовлению редких сывороток, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Введение
Под редкими группами крови понимаются такие сочетания групповых антигенов в эритроцитах человека, в которых: а) отсутствует какой-либо из антигенов высокой частоты, б) отсутствуют одновременно несколько антигенов, в том числе, активных и высокой частоты, в) содержатся различные редкие антигены; г) имеются редкие сочетания антигенов разных систем.
Под редкими сыворотками подразумеваются сыворотки крови людей, чаще с редкой группой крови, содержащие изоиммунные антитела, редко возникающие у людей вследствие естественной сенсибилизации при беременности. Причиной редкости такой сенсибилизации является редкость или наоборот высокая частота антигенов, против которых могут быть направлены антитела, а также низкая иммуногенная активность некоторых антигенов.
К редким сывороткам относятся моноспецифические сыворотки, содержащие антитела к какому-либо одному антигену системы резус-С, Е, с, е, Сw, или к одному из антигенов других систем - Келл, Даффи, Кидд, Левис, Лютеран, MNSs и другие.
К редким сывороткам относятся также полиспецифические сыворотки, содержащие два или более вида антител, одними из которых чаще всего бывают антитела анти-D, а другими- антитела редкой специфичности. К таким редким полиспецифическим сывороткам относятся сыворотки анти - С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е, анти-D+анти-Fуа, анти-D+Келл и другие сочетания антител анти-D с какими-либо редкими антителами, а так же все а сочетания только редких антител, например анти-С+е, анти-С + анти-Fу и т.д.
Трансфузионная терапия, проводимая лицам, принадлежащим к редким группам, повышает возможность образования редких антител, особенно, если кровь переливалась повторно и реципиент имел в прошлом беременности.
Реиммунизация соответствующим антигеном, проводимая лицам, иммунизированным естественным путем при беременности или вследствие трансфузий крови еще более повышает возможность образования активных редких антител.
Лица, иммунизированные естественным путем при беременности или вследствие гемотрансфузий, могут привлекаться в кадры доноров с дополнительной реиммунизацией соответствующим антигеном. Привлечение к донорству и реиммунизация для получения редких сывороток проводятся так же, как это предусмотрено для сывороток антирезус ("Инструкцией по иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус").
Реиммунизация допустима для повышения активности любых антител, так как не вносит ничего качественно нового в иммунологический статус иммунизируемого лица, и следовательно, не создает дополнительной опасности в случае необходимости переливания крови.
Эффективной мерой получения некоторых редких сывороток является искусственная иммунизация доноров-добровольцев.
Искусственная иммунизация ранее несенсибилизированных лиц допустима только теми антигенами и при тех условиях, когда это не может повлечь каких-либо осложнений для иммунизируемого лица в смысле возможности неблагополучных исходов последующих беременностей или несовместимости в случае переливания крови.
Исходя из сказанного, а также из того, что потребность в редких сыворотках разной специфичности различна, для получения таких сывороток рекомендуется дифференцированный подход и разные способы.
2. Основное назначение редких сывороток в учреждениях Службы крови
Моноспецифические сыворотки антирезус - анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е, анти-Сw, а также моноспецифические сыворотки других систем применяются наряду с сыворотками анти-D при фенотипировании крови доноров для создания панели стандартных эритроцитов и кадров типированных доноров, в том числе доноров редких групп, а также для установления фенотипа крови больных и других лиц с целью выяснения причин и предупреждения сенсибилизации и трансфузионных осложнений.
Полиспецифические сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е применяются при обследовании доноров и при обработке их крови на втором этапе исследования на резус-принадлежность. При этом сыворотки анти-С+D и анти-D+Е должны быть использованы одновременно или могут быть заменены одной сывороткой анти-С+D+Е (см. "Инструкцию по определению резус - принадлежности").
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела других систем, например анти-Fуа или анти-Келл, являющиеся главным образом случайными находками, могут быть использованы при исследовании крови резус - отрицательных лиц для определения у них антигенов, против которых направлены дополнительные антитела.
3. Источники и способы получения сыворотки
Для получения моноспецифических сывороток анти-С и анти-Е необходимо выявление лиц, сенсибилизированных естественным путем, и привлечение их к донорству с последующей реиммунизацией.
Допускается искусственная иммунизация этими антигенами доноров добровольцев, которая требует длительных курсов, так как не всегда бывает успешной, особенно для получения активных сывороток анти-С.
Моноспецифические сыворотки анти-с и анти-е следует получать только от лиц, сенсибилизированных естественным путем. Рекомендуется привлечение таких лиц к донорству с последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация антигеном с и антигеном е недопустима, так как в этих случаях нужно было бы иммунизировать резус - положительных лиц, то есть сделать их реципиентами, для которых будет несовместимой вся резус-отрицательная и в большинстве случаев резус-положительная кровь.
Моноспецифические сыворотки анти-Келл, анти-Даффи, анти-Кидд, анти-S, анти-s, анти-Сw следует получать от лиц, сенсибилизированных естественным путем. Поскольку такие антитела возникают исключительно редко, чаще всего при беременности в сочетании с многократными трансфузиями крови, то выявление таких сенсибилизированных лиц, то есть первичный поиск редких антител следует организовать с привлечением к этой работе отделений переливания крови при больницах.
После выздоровления этих лиц желательно привлекать к донорству с последующей реиммунизацией.
Искусственная иммунизация антигенами Келл, Даффи, Кидд, S, е, Сw разрешается только для ограниченного числа доноров в институтах переливания крови, а также в Центре изосерологических стандартов при Нижегородской областной станции переливания крови и Станции переливания крови Комитета здравоохранения г.Москвы.
Моноспецифические сыворотки анти-М, анти-N, анти-Р, анти-Левис могут быть выявлены при массовых обследованиях крови доноров, поскольку такие антитела иногда (очень редко) бывают у людей врожденными. Также редко встречаются такие антитела у лиц, сенсибилизированных естественным путем - беременностями и трансфузиями крови. Таких лиц следует привлекать к донорству с последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация этими антигенами противопоказана.
Систематическое получение сывороток анти-М, анти-N, анти-Р и анти - Левис производятся путем иммунизации животных в учреждениях судебной медицины.
Сыворотки двойной специфичности анти-С+D следует получать от лиц, сенсибилизированных естественным путем с последующим привлечением их к донорству и реиммунизации.
Сыворотки двойной и тройной специфичности - анти-D+Е и анти - С+D+Е могут быть получены почти исключительно путем искусственной иммунизации доноров - добровольцев, так как такое сочетание антител очень редко возникает при естественной сенсибилизации.
Антитела специфичности анти-С+D, анти-D+Е и анти-С+D+E иногда образуются при искусственной иммунизации доноров-добровольцев антигеном D. В этих случаях допустимо продолжение иммунизации с использованием тех антигенов, против которых требуется повысить титр антител.
Сыворотки анти-D в сочетании с антителами какой-либо другой специфичности могут быть получены от лиц сенсибилизированных естественным путем при беременности и трансфузиях крови и при этом на протяжении небольшого срока, так как редкие антитела у таких сенсибилизированных лиц быстро ослабевают или исчезают из крови. Искусственная иммунизация для получения таких сывороток противопоказана.
4. Методы иммунизации и реиммунизации
Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С и анти-Е следует производить согласно инструкции "По иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус".
Реиммунизацию с целью получения антител другой специфичности следует производить аналогично реиммунизации антигенами С и Е с использованием эритроцитов соответствующего фенотипа. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов.
Иммунизацию антигенами системы Келл, Даффи, Кидд, антигенами S, s, Сw следует производить аналогично иммунизации антигенами С и Е. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов. Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С+D, анти-D+Е и анти-С+D+Е, следует производить на фоне уже имеющихся активных антител анти-D, вводя те антигены, против которых имеются дополнительные антитела. Дозы введения антигена аналогичны дозам при иммунизации антигенами С и Е.
Длительность курса зависит от срока появления антител.
Иммунизированным и реиммунизированным лицам выдается справка по форме, предусмотренной действующей инструкцией "По иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус" с указанием антигена, которым проводилась иммунизация. Иммунизация животных для получения сывороток анти-М и анти-N, анти-Р, анти-Левис и обработка этих сывороток производится согласно ТУ и лабораторным регламентам на эти сыворотки.
5. Методы и дозы взятия крови
У лиц, содержащих антитела, следует брать кровь для последующего получения сыворотки или плазмы (методом плазмафереза).
Дозы взятия крови и плазмы зависят от состояния здоровья таких лиц и предусмотрены действующими инструкциями "О порядке сбора крови, содержащей изоиммунные антитела, пригодные для изготовления стандартных сывороток" и "По медицинскому освидетельствованию доноров крови".
6. Показатели пригодности редких сывороток для практического использования
Сыворотки должны быть прозрачными или слегка опалесцировать. Допустим красный оттенок цвета, а также желтое окрашивание вследствие присутствия желчных пигментов.
Моноспецифические редкие сыворотки рекомендуются для практического использования при титре полных или неполных антител не ниже 1:16. Ввиду редкости и трудности получения таких сывороток, при хорошем авидитете допускается использование их с титром 1:4.
Сыворотки анти-С+D, анти-D+E и анти-С+D+Е должны иметь титры антител анти-D не ниже: полных - 1:16, неполных - 1:32. Титр антител анти-С и анти-Е как полных, так и неполных должен быть не ниже 1:16.
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела к антигенам других систем, годны для использования в руках специалистов серологических лабораторий учреждений Службы крови при любом титре антител от 1:4 при хорошем их авидитете. Выдача комбинированных сывороток в другие учреждения допустима лишь при титре всех антител не ниже 1:16. Если в сыворотке, содержащей редкие антитела одной специфичности, одновременно содержатся другие антитела с низким титром и слабым авидититом, то сыворотка нуждается в абсорбции или может быть использована в руках специалистов в институтах, на станциях переливания крови. Выдаче в другие учреждения без абсорбции такая сыворотка не подлежит.
7. Организация поиска и первичное исследование сывороток
Поскольку изоиммунные антитела возникают редко, для получения сывороток редкой специфичности следует организовать работу по выявлению сенсибилизированных лиц как среди резус - отрицательных, так среди резус - положительных больных и доноров с привлечением к этой работе лабораторий, в которых проводятся определение резус - принадлежности крови.
Первичное исследование сывороток лиц с подозрением на сенсибилизацию производится в учреждениях Службы крови, включая отделения переливания крови при больницах. Первичное исследование сывороток лиц, подвергающихся искусственной иммунизации, производится на станциях переливания крови, производящих иммунизацию.
Первичное исследование проводится непрямой пробой Кумбса или реакцией конглютинации с применением желатина для выявления неполных антител и реакцией агглютинации в солевой среде для выявления полных антител.
С целью сокращения объема работы при первичном исследовании сывороток следует использовать эритроциты с содержанием возможно больного числа антигенов в одном образце; удобнее всего фенотип СсDЕе, К+, Fуа+, Jk+.
В случае отсутствия типированных эритроцитов для выявления антител следует приготовить смеси эритроцитов группы О(I) по 5 - 6 образцов и использовать 3 - 4 таких смеси в качестве стандартов, считая каждую смесь за один образец.
Для изготовления стандартов можно использовать эритроциты из осадка крови, взятой из вены со стабилизатором или из места укола пальца.
При массовых исследованиях крови выявление изоиммунных антител можно производить одновременно с определением резус - принадлежности, подвергая испытанию сыворотку каждого исследуемого лица. При этом допустимо предварительно исследовать сыворотку методом конглютинации с желатиной с помощью одного "стандарта" эритроцитов. В качестве такого стандарта следует использовать смесь 2 - 3 образцов резус-положительных эритроцитов группы О(I), содержащих антигены D, С, Е, с, е, Сw, Келл, Fу и другие.
Кровь лиц, в сыворотке которых выявлены антитела, исследуется далее в лабораториях институтов, станций переливания крови, где устанавливается специфичность, активность и форма антител.
8. Исследование сывороток на специфичность, активность и форму антител
Исследование сывороток начинается с проверки групповой принадлежности по системе АВО. Затем сыворотка исследуется на специфичность, активность и форму антител. Для исследования применяется непрямая проба Кумбса, метод конглютинации с применением желатина, реакция агглютинации в солевой среде. Следует иметь ввиду, что в одной и той же сыворотке могут содержаться как полные, так и неполные антитела, причем их специфичность может совпадать или быть различной. Так, например, сыворотка может содержать неполные антитела анти-D, анти-С и анти-Е и в то же время полные антитела анти-С и анти-Е или только полные анти-Е. Титр полных и неполных антител также может быть различен.
Широта исследований зависит от возможности станции переливания крови. В тех случаях, когда станция не располагает всеми указанными ниже стандартными типированными эритроцитами, для дальнейшего исследования сыворотка должна передаваться в республиканские станции или в институты переливания крови.
Для полного выявления антител, установления их специфичности, формы и титра следует использовать панель типированных стандартных эритроцитов. Для удобства в панели целесообразно использовать эритроциты группы О(I).
В качестве образцов в панель можно включать эритроциты типированных доноров, для чего берут у них кровь из вены в изотонический раствор цитрата натрия или консервант. Эритроциты перед употреблением отмывают двукратно изотоническим раствором хлорида натрия. Срок хранения таких эритроцитов до отмывания - 2 - 3 дня, после отмывания - 1 день.
Если кровь взята у донора в стерильных условиях в контейнер с консервантом, применяемым для консервирования крови, она может храниться 1 месяц при +4 - 8 °С. Перед использованием эритроциты двукратно отмывают изотоническим раствором хлорида натрия. Срок годности отмытых эритроцитов 1 день.
Более эффективно использование эритроцитов доноров редких групп, сохраняемых в замороженном состоянии, лучше в малых объемах - 2 - 5 мл. Для использования эритроциты отмывают специальными растворами (см. действующие методические рекомендации "Методы долгосрочного хранения в замороженном состоянии эритроцитов, предназначенных для трансфузии"). После отмывания эритроциты используются в тот же день.
В панели должны быть представлены стандартные эритроциты, позволяющие выявлять и идентифицировать антитела в пределах следующих систем: Rh-Нr, Даффи, Келл, Кидд, Левис, MNSs, Лютеран, Р. В зависимости от возможности учреждения, эта панель может быть расширена за счет увеличения образцов или уменьшения, но так, чтобы по возможности были включены как положительные, так и отрицательные образцы для каждого антигена.
Панель включает резус-положительные и резус-отрицательные образцы эритроцитов разных фенотипов. Среди резус-положительных содержащие пять антигенов системы резус - СсDЕе. В этих же образцах имеются в том или ином сочетании антигены всех других систем. Таким образом положительная реакция с этими образцами укажет на наличие в сыворотке любых антител, но без уточнения их специфичности.
Следующие резус-положительные образцы относятся к фенотипам ССDЕе, СсDЕЕ, СсDее, ССDее, ссDЕе и ссDЕЕ. Часть их гомозиготна, а часть - гетерозиготна по антигенам С и Е. Эти образцы необходимы для идентификации антител анти-с и анти-е.
Затем следуют образцы фенотипов ссDеe, Ссddde и сссdEe. Эти образцы дают возможность выявлять специфичность антител в системе резус, причем очень ценным является образец с двойным содержанием антигена С (фенотип ССdее). Этот образец даст возможность идентифицировать антитела в очень редких сыворотках, например, анти-D + анти-с.
Среди резус-положительных образцов в панели должны быть разновидности с содержанием антигена Du и антигена Сw. Образец Du служит для того, чтобы установить достаточно ли активны антитела анти-D.
Образец с содержанием антигена Сw служит для выявления антител анти-Сw.
Панель включает резус-отрицательные образцы, положительная реакция с которыми указывает на наличие антител по другим системам. Эти образцы содержат разнообразные сочетания антигенов других систем: положительные и отрицательные по антигенам Fуa, Fуb и Кидд.
Необходимы Келл - положительные образцы. Некоторые из них чрезвычайно редкого фенотипа, не содержащего второго аллеля этой системы, т.е. Челлано - отрицательные. Келл - положительные образцы подразделяются также в зависимости от наличия или отсутствия в них антигенов Даффи.
Исследование сыворотки с этими образцами позволяет выявить специфичность в пределах этих систем и это очень важно, так как антитела анти - Келл и анти-Даффи являются следующими по частоте после антител антирезус.
Дальнейшее подразделение резус-отрицательных образцов включает различия по системе Кидд и Левис с наиболее редкими фенотипами этой системы -Jkа--; Jkb-+; Lea+; Leb-.
И наконец в панели представлены фенотипы по другим системам MNSs, Р, Лютеран, причем наибольшую ценность представляют различия по этим системам внутри группы резус-отрицательных образцов.
Использование представленной панели стандартных эритроцитов дает возможность выявлять и определять специфичность полных и неполных антител всех серологических систем как в том случае, когда эти антитела одной специфичности, так и в том - когда антитела различаются и по специфичности и по форме.
В практической работе исследование следует начинать следующим порядком: сначала используются выборочно 10 - 12 образцов эритроцитов, подобранных с таким расчетом, чтобы выявить сенсибилизацию к любому из основных антигенов резус - D, С, Е, с, е, Сw. Среди резус-отрицательных включаются образцы также с максимальным набором различных других антигенов.
Если сыворотка содержит резус-антитела какой-либо одной специфичности или их сочетание, то агглютинация наступит также с соответствующими образцами эритроцитов.
Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные образцы, имеющие антигены Fу или Келл, то следует произвести дополнительные исследования с включением образцов эритроцитов различного фенотипа по этим антигенам. Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные эритроциты независимо от антигенов Fу и Келл, то панель для исследования следует еще более расширить с включением образцов с различными сочетаниями по системам Кидд, Левис, MNSs и т.д.
Если сыворотка агглютинирует все образцы, взятые для первичного исследования, независимо от резус-принадлежности, то проводятся дополнительные исследования с использованием стандартов, гомозиготных по антигенам С и Е, т.е. не содержащих антигена с и антигена е. Отсутствие агглютинации с этими образцами свидетельствует о наличии соответствующих антител - анти-с и анти-е. При наличии агглютинации с указанными фенотипами следует иметь ввиду другие, широко распространенные антигены, например Челлано и поэтому использовать Челлано - отрицательные стандарты. В случае положительного результата и с этим стандартом следует расширить панель с включением образцов одновременно отрицательных по многим антигенам, так как в этих случаях можно предположить наличие в сыворотке нескольких антител.
Титрование сыворотки. После выявления антител и установления их специфичности и формы следует определить титр антител. Титрование проводится отдельно для неполных и полных антител, непрямой пробой Кумбса, в методе конглютинации с желатином и реакцией агглютинации в солевой среде, аналогично титрованию сывороток антирезус (см. инструкцию "По исследованию сывороток на наличие резус-антител"). Для титрования используются образцы эритроцитов, содержащие антиген против которого направлены антитела. По возможности титрование проводится с гомозиготными и гетерозиготными образцами. Для антител анти-с это является обязательным, так как эти антитела обладают выраженным феноменом дозы и будучи активными с гомозиготными образцами (сс) могут оказаться неактивными и дать ложноотрицательный результат при исследовании гетерозиготных образцов (Сс). При решении вопроса о возможности практического использования таких сывороток учитывается титр с гетерозиготным образцом и этот титр указывается на этикетке.
Описанное в настоящем разделе исследование сыворотки даст возможность решить вопрос о специфичности антител, содержащихся в сыворотке, а также об их форме и активности (титре). Далее каждая сыворотка, имеющаяся в достаточном количестве, для дальнейшего ее использования должна быть обработана и расфасована как указано в пункте 10. Расфасованные сыворотки хранятся в течение 3 недель после чего проводится их стандартизация.
9. Стандартизация сыворотки
Стандартизация редких сывороток производится на областных станциях переливания крови, располагающих необходимыми стандартами, или на станциях и в институтах переливания крови. При стандартизации производятся исследования, предусмотренные в параграфе 8. Результаты сопоставляются с данными, указанными на этикетке, оценивается внешний вид сыворотки, качество укупорки флаконов, ампул и правильность оформления этикеток.
При стандартизации окончательно решается вопрос о том, какой специфичности, формы и титра антитела содержатся в данной сыворотке и для определения какого (каких) антигенов и в какой именно реакции пригодна данная сыворотка.
Если качество сыворотки отвечает требованиям, изложенным в пункте 6, титр в ней сохранился или снизился, но не стал ниже требуемого и при этом правильно оформлены этикетки и наставление по использованию, то учреждение, проводившее стандартизацию, дает заключение о возможности использования данной сыворотки как стандартного реактива. Это заключение сообщается в учреждение, представившее сыворотку для стандартизации.
В случае несоответствия сыворотки необходимым требованиям в учреждение, изготовившее сыворотку, также сообщаются результаты с указанием причин непригодности сыворотки или неправильности имеющейся в ее паспортизации. При этом даются рекомендации по возможному устранению отмеченных недостатков.
В случае несоответствия сыворотки необходимым требованиям в учреждение, изготовившее сыворотку, также сообщаются результаты с указанием причин непригодности сыворотки или неправильности имеющейся в ее паспортизации. При этом даются рекомендации по возможному устранению отмеченных недостатков.
В случае затруднений проведения стандартизации (наличие каких-либо неизвестных антител и т.п.) редкие сыворотки могут направлаться в Центр по изучению и стандартизации групп крови в ГНЦ РАМН.
Центр по изучению и стандартизации групп крови производит также выборочный контроль редких сывороток, изготавливаемых в учреждениях Службы крови страны.
10. Обработка и расфасовка сыворотки
После того, как у сенсибилизированного лица при первичном исследовании его сыворотки выявлены редкие антитела, от него получают сыворотку или плазму (методом плазмафереза). Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 грамма на 100 мл сыворотки или азида натрия 1 г на 1000 мл. К плазме для удаления фибрина добавляют 10 % раствор хлорида кальция из расчета 6 мл на 100 мл плазмы и после ретракции сгустка отсасывают сыворотку в другой флакон и так же консервируют.
На флаконы с сывороткой наклеивают этикетки с указанием фамилии и.о. донора, групповой принадлежности по системе АВО и характеристики изоиммунных антител с теми подробностями, которые удалось выявить при первичном исследовании. Через два-три дня (можно несколько позже) сыворотку вновь исследуют на наличие, специфичность, форму и титр антител, как указано в пункте 8. Результат исследования записывают на этикетке сосуда с сывороткой и регистрируют в журнале.
Если в сыворотке выявлены активные редкие антитела и имеется возможность получить от сенсибилизированного лица еще некоторое количество сыворотки, эту новую порцию исследуют так же, как сказано выше. Флаконы с сывороткой хранят при +4 - 8 °С.
Если показатели специфичности и активности (титра) антител и внешний вид сыворотки отвечают требованиям, указанным в пункте 6, сыворотку можно считать пригодной для практического использования и разлить в ампулы или маленькие флаконы по 1, 2, 3 или 5 мл в зависимости от предполагаемых объемов использования. Чем большая редкость антител, тем меньшие объемы рекомендуются для расфасовки сыворотки.
Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают и этикетируют.
Через три недели после розлива в сыворотке вновь исследуется специфичность, форма и активность антител, проверяется правильность паспортизации и решается вопрос о возможности использования этой сыворотки и методе, рекомендуемом для практической работы.
Для удаления антител системы АВО сыворотки рекомендуется абсорбировать. Абсорбция проводится эритроцитами соответствующей групповой принадлежности с отсутствием в них антигена, против которого в сыворотке имеются изоимунные антитела. Адсорбция или нейтрализация антител альфа и бета проводится после исследования сыворотки на наличие, специфичность, активность и форму антител до ее расфасовки.
После абсорбции и еще через три неделя сыворотку исследуют на наличие в ней групповых антител, а также специфичность, форму и титр изоиммунных антител. Если групповые антитела альфа и бета исчезли, а показатели изоиммунных антител отвечают требованиям, указанным в пункте 6, сыворотку можно расфасовать.
11. Паспортизация сыворотки
На ампулы (флаконы) с расфасованной сывороткой наклеивают этикетки, на которых указывают название учреждения и город, где изготовлена сыворотка, номер серии (или символ, избранный для ее обозначения), например, сокращенная фамилия донора, специфичность антиэритроцитарных антител, их форму. Указывается также групповая принадлежность по системе АВО. Для сыворотки группы АВ(IV) или, специально абсорбированной, вместо символа, обозначающего групповую принадлежность, пишутся слова "для всех групп крови". На этикетках наносятся по диагонали цветные полосы: для группы А(II) - две синие, для группы В(III) - три красные, для сыворотки с символом "для всех групп крови" - четыре желтые.
На этикетках указывается количество, срок годности и условия хранения.
Примеры наставлений по использованию редких сывороток
|
Станция переливания крови КЗ г. Москвы |
||
|
Стандартная сыворотка для определения антигенов эритроцитов методом конглютинации с желатином в пробирках Метод использования: 1. В пробирку к одной капле сыворотки (0,05 мл) добавить одну каплю испытуемых эритроцитов (0,05 мл) и 2 капли желатина (0,1 мл). Содержимое перемешать путем встряхивания/ 2. Инкубировать в термостате при +48 - +50 °С в течение 30 минут или в водяной бане при +48 - +50 °С в течение 15 минут. 3. После прогревания в пробирку долить 8 - 10 мл физиологического раствора, содержимое перемешать путем перевертывания пробирки. 4. Учесть результат реакции. Во всех сомнительных случаях результат оценить путем микроскопирования. |
||
|
Серия 85 |
анти-E |
для всех групп крови |
|
Станция переливания крови КЗ г. Москвы |
||
|
Стандартная сыворотка для определения антигенов эритроцитов в методе солевой агглютинации (в маленьких пробирках или на планшетах) Метод использования: 1. Приготовить 2 % взвесь эритроцитов, дважды отмытых изотоническим раствором хлорида натрия. 2. К одной капле тест-сыворотки добавить одну каплю исследуемой взвеси эритроцитов. 3. Инкубировать пробирки (планшеты) 1 час при температуре 37 °С. 4. Учесть результаты реакции с помощью лупы. |
||
|
Серия 52 |
анти- С |
для всех групп крови |
12. Хранение и выдача сыворотки
Расфасованные редкие сыворотки хранят или в замороженном состоянии при температуре не выше -15 °С или при +4 - 8 °С.
Редкие сыворотки после стандартизации используются для нужд учреждений, в которых они изготовлены, и могут выдаваться в другие учреждения Службы крови.
При выдаче сыворотки к ней прилагают наставление по использованию, в котором указывают в каком методе для каждого из антител следует использовать данную сыворотку.
При хранении сыворотка контролируется один раз в месяц или (в целях экономии сыворотки) непосредственно перед выдачей. Срок годности редких сывороток при хранении в замороженном состоянии - один год, при хранении в условиях +4 - 8 °С - четыре месяца. По истечении срока годности сыворотку проверяют и, если титр не снизился или снизился не более чем на два разведения и при этом сохранился не ниже требований, указанных в пункте 6, срок продляют еще на два месяца. Если через два месяца титр также сохранился - срок снова продляется.
"Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких групп, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 26 марта 1979 года № 06-14/3, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция11 по применению Цоликлона анти-С моноклонального для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека (Цоликлон анти-С Супер) ТУ 9398-207-27575295-94
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Назначение
Цоликлон анти-С Супер предназначен для выявления антигена С системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с аллоиммунной анти-С сывороткой.
_____________
11 Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю. Митерев, научные сотрудники Л.Н. Леменева, Н.И. Оловникова, Е.В. Белкина.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-С антитела продуцируются бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-С Супер изготавливается на основе культуральной жидкости, кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология производства реагента исключает возможность его контаминации патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-С Супер содержит IgМ антитела, которые вызывают прямую агглютинацию С+ эритроцитов. Реагент не содержит антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена С в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена С
Цоликлон анти-С Супер может быть использован в реакции агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение антигена С производится в нативной крови с консервантом, в крови без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1.1. На предварительно подогретую (35 - 40 °С) пластинку нанести одну большую каплю реагента (примерно 0,1 мл), одну маленькую каплю исследуемой крови или эритроцитов (0,02 - 0,05 мл) и смешать.
3.1.2. Через 20 - 30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию агглютинации. Четкая реакция наступает через 30 - 60 секунд после смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5 % суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона анти-С и эритроцитарной взвеси, тщательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37 °С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500 - 3000 оборотах в минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики) необходимо использовать стандартные С+ и С-эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-С Супер - один год при температуре 2 - 8 °С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре 2 - 8 °С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности. неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с результатами тестирования и 2 - 3 невскрытых флакона с Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-rh(С) моноклонального для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека (Цоликлон анти - С Супер)", утвержденную Управлением научных исследований Минздравмедпрома России 17 марта 1995 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция12 по применению Цоликлона анти-Е моноклонального для определения антигена Е системы резус на эритроцитах человека (Цоликлон анти-Е Супер)
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Назначение
Цоликлон анти-Е Супер предназначен для выявления антигена Е системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с аллоиммунной анти-Е сывороткой.
_____________
12 Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю. Митерев, научные сотрудники Л.Н. Леменева, Н.И. Оловникова, Е.В. Белкина.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-Е антитела продуцируются бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-Е Супер изготавливается на основе культуральной жидкости, кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология производства реагента исключает возможность его контаминации патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-Е Супер содержит IgМ антитела, которые вызывают прямую агглютинацию Е+ эритроцитов. Реагент не содержит антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена Е в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена Е
Цоликлон анти-Е Супер может быть использован в реакции агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение антигена Е производится в нативной крови с консервантом, в крови без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1. На пластинку нанести одну большую каплю реагента (примерно 0,1 мл), одну маленькую каплю исследуемой крови или эритроцитов (0,02 - 0,05 мл) и смешать.
3.1.2. Через 20 - 30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию агглютинации. Четкая реакция наступает через 30 - 60 секунд после смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5 % суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона анти-Е и эритроцитарной взвеси, тшательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37 °С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500 - 3000 оборотах в минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики) необходимо использовать стандартные Е+ и Е-эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-Е Супер - один год при температуре 2 - 8 °С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре 2 - 8 °С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с результатами тестирования и 2- 3 невскрытых флакона с Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция13 по предупреждению посттрансфузионных осложнений, обусловленных факторами Кеll и с(hr')
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
Наиболее выраженным антигенными свойствами среди минорных антигенов эритроцитов обладают факторы Кеll(K) и с. Фактор K стоит на втором месте после антигена D в шкале трансфузионно опасных антигенов эритроцитов. Третье место занимает фактор с.
Индекс сенсибилизации (процент лиц с повышенным риском посттрансфузионного осложнения) к обоим указанным факторам высокий.
Фактор К встречается примерно у 10 % людей, поэтому почти каждая десятая гемотрансфузия - это трансфузия К-положительной крови К-отрицательному реципиенту, каждая десятая беременность - это беременность К-отрицательной женщины К-положительным плодом.
С тем, чтобы избежать посттрансфузионных осложнений по фактору К, необходимо выдавать в лечебные учреждения Е-отрицательные эритроциты. В кабинетах, отделениях и станциях переливания крови следует производить определение К фактора у всех доноров в обязательном порядке наряду с определением групповой- и резуспринадлежности крови, после чего отбирать К-положительные образцы, не допуская их выдачи для переливания К-отрицательным больным.
К-положительным донорам целесообразно рекомендовать другой вид донорства (плазмы, тромбоцитов, лейкоцитов и др.), но не эритроцитов. Такие мероприятия позволят существенно снизить индекс сенсибилизации населения к фактору К, что в свою очередь будет способствовать предупреждению посттрансфузионных осложнений, обусловленных этим фактором, сократит частоту гемолитической болезни новорожденных.
Определение антигена К в эритроцитах производят с помощью следующих методов:
1. Непрямая проба Кумбса.
2. Желатиновый метод в пробирках.
3. Экспресс-метод на плоскости.
Индекс сенсибилизации населения к фактору с так же достаточно высок. Около 20 % людей не содержат антигена с в эритроцитах. Именно эти люди представляют группу повышенного риска развития посттрансфузионного осложнения, поскольку им в 80 % случаев переливают эритроциты, содержащие фактор с. Число переливаний с-положительных эритроцитов с-отрицательным реципиентам составляет 16 на 100 гемотрансфузий. Число беременностей с-положительным плодом с-отрицательных женщин составляет также 16 на 100.
С тем, чтобы уменьшить индекс сенсибилизации населения и избежать посттрансфузионных осложнений, обусловленных несовместимостью по этому фактору, целесообразно у каждого резус-положительного реципиента определять с-антиген и при его отсутствии переливать реципиенту кровь доноров с-отрицательных (гомозиготных по антигену С). На станциях и в отделениях переливания крови необходимо иметь резервную группу таких доноров или запас с-отрицательной эритроцитной массы.
Антиген с определяют теми же методами, что и антиген D.
_____________
13 Составители: С.И. Донсков, А.Г. Башлай, Т.М. Пискунова, В.И. Червяков, И.С. Липатова.
Инструкция по определению Келл-фактора экспресс-методом
Оснащение: специально приготовленные сыворотки анти-К универсальные, физиологический раствор NaCl, пластинки (тарелки) с гидрофильным покрытием, стеклянные палочки, песочные часы.
Для исследования используют свежие - не более 2-х дневного хранения, неотмытые или отмытые эритроциты, взятые со дна пробирки после отстаивания от сыворотки (третья фракция эритроцитов), плазмы с консервантом или физиологического раствора. Используют также цельную кровь, взятую из прокола пальца непосредственно перед исследованием.
Техника определения: на плоскость помещают одну каплю (0,05 - 0,06 мл)14 сыворотки анти-К и каплю эритроцитов в количестве 1/3 от объема взятой сыворотки. Капли перемешивают стеклянной палочкой и при плавном периодическом покачивании пластинки наблюдают за ходом реакции в течение 5 минут.
Оценка результатов: при положительном результате агглютинация эритроцитов появляется к 30 сек. - 1 мин. и в дальнейшем усиливается, при отрицательном результате агглютинация отсутствует. По истечении 3 - 4 минут в реагирующую смесь добавляют 1 - 2 капли физиологического раствора для снятия возможной неспецифической агрегации эритроцитов и продолжают наблюдение до истечения 5 минут, после чего регистрируют результат (см. рис.).
Положительный результат. Отрицательный результат.
Внимание! Во избежание ошибок рекомендуется использовать осадок эритроцитов, максимально освобожденный от взвешивающей среды. Срок годности сывороток - четыре месяца.
_____________
14 1 мл сыворотки анти-К расходуется на 15 - 20 исследований.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по иммунизация доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Выбор доноров для иммунизации
К иммунизации антигенами системы резус могут привлекаться доноры - мужчины от 18 до 50 лет и женщины от 45 до 50 лет или моложе, если у них уже наступила менопауза.
Реиммунизация может производиться лицам, ранее сенсибилизированным к антигену резус вследствие резус-конфликтных беременностей или введения им крови.
Иммунизацию и реиммунизацию проводят только после ознакомления с сущностью данной процедуры привлекаемых для этого лиц с их согласия, данного в письменной форме.
Перед иммунизацией и реиммунизацией доноры и сенсибилизираванные лица, привлеченные к донорству, проходят врачебное освидетельствование согласно "Инструкции по медицинскому освидетельствованию доноров крови, плазмы, клеток крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации 29 мая 1995 года.
Медицинское освидетельствование повторяется перед каждым курсом иммунизации и реиммунизации. Наличие в анамнезе у женщин выкидышей, мертворождений, гемолитической болезни у их новорожденных и другой патологии, связанной с резус - конфликтом, не является противопоказанием к иммунизации, реиммунизации и последующему взятию крови и плазмы (плазмаферез). У этого контингента лиц допускается также содержание гемоглобина не менее 120 г/л, количества эритроцитов - не менее 3,7х1012 /л, лейкоцитов до 10х109 /л, палочкоядерных нейтрофилов до 10 %, лимфоцитов до 45 %.
У лиц, давших согласие на иммунизацию и реиммунизацию, проводят исследования на антиген гепатита В, антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и на содержание аланинаминотрансферазы. Эти исследования повторяют перед каждым курсом иммунизации и реиммунизации.
К иммунизации допускаются лица, не содержащие в крови антигена гепатита В, антител к гепатиту С, вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и с содержанием аланинаминотрансферазы в пределах нормы.
Эритроциты лиц, отобранных для иммунизации, и доноров, кровь которых будет использована в качестве антигена, титруют по антигенам системы резус: D, С, Е, с, е и по возможности других систем (Келл, Даффи и т.д.).
До иммунизации сыворотку крови этих лиц проверяют на наличие различных форм резус - антител, а эритроциты - прямой пробой Кумбса. Положительный результат прямой пробы Кумбса является противопоказанием для иммунизации и реиммунизации, так же как и вообще для зачисления в доноры. При наличии резус-антител устанавливают специфичность и титр. Если эти показатели не дают возможности изготовления из этой крови стандартной сыворотки или иммуноглобулина антирезус, то для повышения активности антител такому лицу можно проводить реиммунизацию.
После иммунизации и реиммунизации донору должна быть выдана справка о том, какую кровь следует подбирать ему в случае необходимости гемотрансфузии.
Справка должна быть напечатана на картоне или плотной бумаге, отвечающей условиям длительного хранения, и помещена в прозрачный влагоустойчивый конверт. В справке должны быть указаны следующие сведения:
- город и название учреждения, производившего иммунизацию и выдавшего справку,
- фамилия, имя, отчество донора,
- группа крови по системе АВО;
- резус-принадлежность (фенотип);
- чем иммунизировали (резус-антиген);
- при необходимости гемотрансфузий обязателен индивидуальный подбор совместимой крови только от резус ............. лиц.
Справка должна быть подписана руководителем учреждения с указанием даты и скреплена печатью.
2. Подготовка донора, кровь которого используется в качестве антигена
Антигеном для резус-иммунизации служат эритроциты консервированной крови активных доноров группы О(I) или одноименной с кровью иммунизируемого лица.
Помимо полного обследования, предусмотренного для доноров, дающих кровь для переливания больным, донор антигена должен быть обследован два раза в год у врача-инфекциониста с целью исключения латентно протекающего заболевания печени.
Для иммунизации применяется кровь, содержащая антиген, против которого предполагается получить антитела. Этот антиген должен отсутствовать у лица, которое иммунизируется этой кровью. Рекомендуется для каждой группы лиц (в количестве до десяти человек) использовать для иммунизации эритроциты одного и того же донора.
Кровь, используемая в качестве антигена, заготавливается стерильно в мелкой расфасовке на любом консервирующем растворе и годна к употреблению семь дней. После вскрытия флакона путем прокола пробки кровь должна быть использована сразу для иммунизации одного или нескольких доноров. Оставлять кровь после вскрытия флакона до прихода следующей группы доноров воспрещается. Для иммунизации могут быть использованы также криоконсервированные размороженные эритроциты со сроком хранения, предусмотренным для этой среды.
Для иммунизации рекомендуется отбирать эритроциты с высокой активностью соответствующих резус-антигенов. О ней судят по быстроте наступления и характеру агглютинации эритроцитов с антисывороткой соответствующей специфичности.
При иммунизации антигенами С и Е в течение курса рекомендуется для каждого иммунизируемого лица применять эритроциты одного и того же донора, преимущественно свежеконсервированные.
3. Условия иммунизации и реиммунизации
Инъекции антигена проводят в условиях соблюдения асептики, в специально отведенном помещении, в котором не производится работа с сыворотками. Помещение должно быть оборудовано бактерицидными лампами и проточной холодной и горячей водой. Перед иммунизацией проводят влажную обработку помещения с применением антисептиков. Для иммунизации применяют шприцы одноразового пользования, а при отсутствии - обычные шприцы, которые должны быть автоклавированы.
Перед началом и на 8 - 30 день после окончания каждого курса иммунизации у донора необходимо взять кровь для исследования на наличие, специфичность и активность антител.
Ниже приводятся схемы иммунизации и реиммунизации доноров антигенами системы резус. Однако при необходимости в этих схемах могут быть допущены некоторые отклонения в сроках введения антигена - до пяти дней между инъекциями и до полутора месяцев между курсами, и в дозах - в пределах +-5 мл.
При всех схемах иммунизации и реиммунизации кровь, используемая в качестве какого-либо антигена резус, должна быть отрицательной по фактору Келл.
4. Иммунизация доноров для получения антител анти-D
Для получения антител анти-D рекомендуется иммунизировать лиц фенотипа ссdddее, используя в качестве антигена эритроциты фенотипа ссDее. Однако следует иметь в виду, что в процессе такой иммунизации иногда, кроме антител анти-D, образуются антитела анти-С. Для избежания этого можно привлекать к иммунизации лиц фенотипа Ссddее, применяя в качестве антигена кровь фенотипа ссDее, а также фенотипа СсDее.
Иммунизация лиц гомозиготных по антигену С, т.е. фенотипа ССddее кровью вышеуказанных генотипов не разрешается ввиду возможности образования у них антител анти-с.
Схема иммунизации
Первый курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора-антигена в количестве: первая - 10 мл крови, последующие две инъекции - по 5 мл с интервалами между ними три - четыре дня. Через четыре месяца проводят второй курс иммунизации.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора-антигена по 5 мл на каждую с интервалами по три - четыре дня.
Третий и четвертый курсы: донорам, у которых за два курса не выработалось антител, через шесть месяцев после второго курса следует провести третий и четвертый курсы иммунизации, аналогичные второму курсу.
Если после четвертого курса у донора не выработается антител, через четыре месяца, и в дальнейшем с теми же интервалами следует провести сокрашенные курсы по типу реиммунизации.
Если и после такой длительной иммунизации антитела не образуются, донора от иммунизации отстраняют.
После выработки у донора активных антител, для сохранения и дальнейшего повышения их титра, им необходимо периодически проводить инъекции антигена - реиммунизацию.
5. Реиммунизания доноров для получения антител анти-D
Реиммунизация проводится лицам, у которых выработались антитела - D вследствие проведенной иммунизации, бывших ранее беременностей или переливания крови. Реиммунизация дает возможность сохранить титр антител в крови иммунизируемых лиц или добиться его повышения. Подбор крови-антигена для реиммунизации проводится так же, как и для иммунизации.
Реиммунизация проводится через четыре месяца после окончания иммунизации и появления антител и затем повторяется каждые четыре месяца. У лиц, иммунизированных беременностями или трансфузиями крови, реиммунизацию можно начать также не ранее, чем через четыре месяца, но только вне периода беременности и лактации.
Курс реиммунизации состоит из двух - трехкратного внутривенного или внутримышечного введения крови донора по 2 - 3 мл с интервалом два - три дня. Такие курсы повторяются каждые четыре месяца.
6. Время появления антител
Время появления неполных резус-антител анти-D колеблется от четырех месяцев до года и более лет от начала иммунизации. Титр антител может быть от 1:2 до 1:1024 и выше. Стойкие высокие титры анти-D у ранее не сенсибилизированных лиц обычно устанавливаются не ранее, чем через полтора года.
Приведенные схемы иммунизации и реиммунизации обеспечивают выработку неполных антител анти-D с титром не ниже 1:64 не менее чем у 70 % иммунизируемых лиц.
7. Иммунизация доноров для получения антител анти-С и анти-Е
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются следующие сочетания фенотипа крови иммунизируемого лица и эритроцитов, применяемых для иммунизации:
|
Планируемые антитела |
Фенотип крови иммунизируемого лица |
Фенотип эритроцитов, применяемых для иммунизации |
|
анти-С |
ccddee |
Ссddее CCddee |
|
ccDee ccDEe |
Ссddее CCddee СсDее ССDее СсDЕе ССDЕе |
|
|
анти-Е |
ссddее Ссddее |
сcddEe |
|
СсDее |
ссddЕе ссDЕЕ ссDЕе СсDЕЕ СсDЕе |
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуется две схемы иммунизации, из которых первая дает более благоприятный результат.
Первая схема иммунизации
Первый курс состоит из десяти внутривенных введений крови донора антигена с перерывом по два дня. Первые пять инъекций - по 2 мл и последующие пять - по 1 мл. Затем следует перерыв в четыре месяца.
Второй курс состоит из десяти внутривенных или внутримышечных введений крови с интервалами по два дня. Первые пять инъекций - по 1 мл и последующие пять - по 0,5 мл.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца проводят третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный второму, и так повторяют каждые четыре месяца.
Вторая схема иммунизации
Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных инъекций крови с интервалами по два - три дня. Первая инъекция - 10 мл и последующие пять - по 5 мл. Через восемь - десять месяцев проводится второй курс.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови по 5 мл с интервалами по три - четыре дня.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца проводится третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный второму, и так повторяется каждые четыре месяца.
8. Время появления антител анти-С и анти-Е
Антитела анти-С и анти-Е появляются в сроки от 6 месяцев (полные) до 2,5 - 3 лет (неполные) после начала иммунизации. Антитела появляются у 10 - 15 % иммунизируемых лиц с титром 1:1 - 1:8 для неполных антител и 1:2 - 1:32 - для полных антител.
9. Заключение
Иммунизация и реиммунизация не оказывают отрицательного влияния на состояние здоровья доноров.
В процессе иммунизации, а также после выработки антител при взятии крови и плазмы (плазмаферез) у доноров могут наблюдаться преходящие изменения периферической крови, например, увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов до 10 %, монотипов до 12 %, лимфоцитов до 45 %, повышение содержания общего количества лейкоцитов до 10х109 /л, общего биллирубина до 20,5 мкмоль/л, активности аланинаминотрансферазы до 1,36 мкмолей, пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37 °С. Эти сдвиги не являются противопоказаниями для продолжения иммунизации и реиммунизации и взятия у доноров крови и плазмы (плазмаферез).
Определение антител в сыворотке крови иммунизированных лиц, обработка сывороток и их испытание производится согласно действующей "Инструкции по изготовлению сывороток антирезус".
Оплата изоиммунным донорам за каждую иммунизацию производится по отдельному расчету согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.
Оплата изоиммунным донорам за дачу крови и плазмы (плазмаферез) производится в двукратном размере по отношению к неимунным донорам крови, плазмы согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.
С целью увеличения количества изоимунных доноров крови, плазмы разрешается дополнительная оплата изоимунным донорам за дачу крови или плазмы на усмотрение органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.
Изоимунные доноры имеют право на внеочередное обслуживание в лечебных учреждениях.
Методические рекомендации "Иммунизация доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года № 10-11/38 считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
1. Каждое учреждение службы крови, а также лаборатории в других лечебно - профилактических учреждениях, где производится определение резус-принадлежности и изготовление сывороток антирезус и других антисывороток должны иметь постоянных доноров, у которых берется кровь для приготовления стандартных эритроцитов.
Стандартные эритроциты применяют в обязательном порядке при определении группы крови АВО, резус-принадлежности, выявлении антиэритроцитарных антител, а также как контроль при изготовлении стандартных сывороток, предназначенных для определения группы крови АВО, сывороток антирезус, различных тест-сывороток для выявления антигенов эритроцитов.
1.1. при определении группы крови необходимо иметь контрольные эритроциты трех групп: О, А (подгруппа А1) и В,
1.2. при приготовлении стандартных изогемагглютинирующих сывороток следует использовать кровь доноров, указанных в пункте 1.1, и дополнительно иметь доноров подгруппы А2, А3, Ах, А2В, АВ2.
1.3. при определении резус-принадлежности необходимы контрольные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты.
1.4. при изготовлении стандартных сывороток антирезус и при выявлении резус - антител необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в пункте в, и дополнительно подобрать доноров групп О, А, В, АВ так, чтобы среди образцов крови было по одному резус-положительному и одному резус-отрицательному образцу. Эти доноры должны быть исследованы дополнительно и, в зависимости от наличия у них различных антигенов резус, число доноров должно быть пополнено за счет доноров группы О(I) так, чтобы в эритроцитах доноров этой группы обязательно имелись антигены резус D, С, Е, с, е, Сw порознь или в различных сочетаниях, а также антигены систем К - k, Fуa - Fуb и других систем эритроцитов.
1.5. при изготовлении тест-сывороток различной специфичности необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в пунктах 1.3 и 1.4 и типированных по антигенам различных эритроцитарных систем: гомозиготные, гетерозиготные и отрицательные по различным антигенам.
2. Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут у доноров из пальца или из вены не чаще трех раз в неделю в зависимости от потребности.
3. Каждый донор, у которого берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, должен находиться на учете отделения донорских кадров, где на него должен быть заведен донорский журнал. Если лаборатория, для которой донор дает кровь малыми дозами, не входит в состав учреждения службы крови, донор находится на учете непосредственно в этой лаборатории.
При зачислении в доноры (в дальнейшем каждые четыре месяца) донор должен быть осмотрен врачом-терапевтом, у него проверяется содержание гемоглобина и число эритроцитов. Взятие крови допускается при условии содержания гемоглобина не ниже 12 г % (120 г/л) для женщин и 13 г % (130 г/л) - для мужчин.
4. В лабораториях, где у доноров берут кровь для приготовления стандартных эритроцитов, должна быть заведена книга учета взятия крови по следующей форме:
|
Фамилия ___________________ имя ___________________ отчество ____________ Группа крови ___________________________, фенотип по различным системам эритроцитов ___________________________ |
||||
|
1. Дата взятия крови |
1. Количество взятой крови |
1. Расписка донора, давшего кровь |
1. Расписка лица, взявшего кровь |
1. Расписка лица, использовавшего кровь для работы |
|
2. |
2. |
2. |
2. |
2. |
|
|
|
|
|
|
5. Взятие крови количественно подытоживается за 1,5 - 2 месяца. Итог подписывается руководителем лаборатории или отдела, для нужд которого бралась кровь.
6. Руководитель лаборатории или отдела на основании записи в книге учета взятия крови дает донору справку, в которой должен указать количество взятой крови и за какой период времени взята кровь. Справку подписывает руководитель лаборатории или отдела.
7. Принимая во внимание многократность и характер процедуры взятия крови у доноров, компенсацию за взятую у них кровь устанавливают в тройном размере по сравнению с суммой компенсации, установленной для доноров, дающих кровь для переливания больным.
8. На доноров, у которых берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, распространяются все льготы, как для доноров, дающих кровь для переливания больным, согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Федерации. Выходной день предоставляется донору за суммарное взятие крови в количестве не менее 100 мл.
"Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 14 октября 1976 года № 06-14/1, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по определению иммунных антител групповой системы АВО
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
I. Введение
Антитела системы АВО - альфа и бета являются нормальными (естественными) у человека. Они относятся к полным антителам - агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются при комнатной температуре и хуже при температуре 37 °С. Добавление в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител, непрямой пробой Кумбса их не выявляют.
Нормальные антитела альфа и бета легко абсорбируются из сыворотки при добавлении групповой субстанции Витебского. Они чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при 70 °С в течение десяти минут достаточно, чтобы эти антитела полностью потеряли активность.
Кроме нормальных (естественных) антител альфа и бета у человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы, которые в отличие от нормальных были обозначены символами анти-А и анти-В.
Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном поступлении в организм несовместимого в групповом отношении антигена, при иногрупной беременности, при ошибочном переливании крови, несовместимой по системе АВО, а также при проведении некоторых прививок и иммунизации.
При иногрупной беременности, послужившей причиной гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А или анти-В почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения больного ребенка. При этом, им обычно сопутствует высокий титр нормальных антител альфа и бета.
При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные антитела анти-А или анти-В появляются обычно на пятый - седьмой день, достигая максимума к пятнадцатому - двадцать пятому дню с последующим падением их титра.
В крови у таких больных одновременно повышается титр нормальных антител альфа и бета на 3 - 8 ступеней также с последующим снижением после 25 - 30 дня.
Иммунные антитела анти-А и анти-В могут быть как в полной так и неполной форме. Они активны при 37 °С, могут иметь несколько более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по сравнению с солевой и выявляться в непрямой пробе Кумбса. Иммунные антитела не абсорбируются при добавлении групповоспецифической субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействию и сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут при температуре 70 °С, т.е. при условиях, при которых нормальные антитела альфа и бета полностью инактивируются. Выявление изоиммунных антител может служить ценным диагностическим признаком, в частности, при решении вопроса о причинах гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антител альфа и бета от иммунных антител анти-А и анти - В является их поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и основано применение разных методов для выявления нормальных антител альфа и бета и изоиммунных антител анти-А и анти-В (см. разделы II - V). Активность иммунных антител проявляется в виде способности вызывать агтлютинацию эритроцитов при проведении реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой пробе Кумбса.
Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же причинами, могут одновременно образоваться гемолизины, которым свойственна также групповая специфичность (Методы определения групповых гемолизинов см. в разделах II, VI).
II. Оснащение
При определении антител альфа, бета и иммунных антител анти-А, анти-В необходимо следующее оснащение:
- стандартные эритроциты группы А(II) и В(III) или смесь эритроцитов от 5 - 6 доноров отдельно каждой группы;
- стандартная сыворотка для пробы Кумбса;
- изотонический раствор NаСl;
- пробирки центрифужные;
- пробирки маленькие, высотой 2 - 2,5 см с внутренним диаметром 5 - 6 мм и с гладким дном округлой формы;
- пробирки высотой 4 - 10 см для пробы Кумбса;
- белые пластинки со смачиваемой поверхностью;
- штативы;
- термостат 37 °С;
- центрифуга;
- водяная баня 70 °С.
III. Определение полных иммунных антител системы АВО реакцией солевой агглютинации
1. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и B(III) дважды отмывают изотоническим раствором NаСl путем центрифугирования, после чего на дне пробирки остается эритроцитная масса, из которой приготавливают 2 - 3 % взвеси и отдельно каждой группы.
Исследуемую сыворотку в количестве 0,5 - 1 мл разводят в четыре раза изотоническим раствором NаCl во избежание коагуляции при нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из которых прогревают в течение 10 минут при 70 °С, точно соблюдая температуру и время. Таким образом, получится две порции сыворотки - нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4.
Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой пробой Кумбса.
2. Техника реакции
При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании сыворотки группы О(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверствия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и у каждой пробирки - степень разведения помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 1:8000).
Во все пробирки каждого ряда, начиная со второй, накапывают по две капли изотонического раствора NаСl. Затем в первую и во вторую пробирки (каждого ряда) накапывают по две капли приготовленной непрогретой сыворотки, разведенной в четыре раза.
Во второй пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с изотоническим раствором NаСl и две капли этой смеси переносят в третью пробирку, из третьей, также после перемешивания - в четвертую и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до 1:8000.
В другом штативе также приготавливают разведения предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно достаточно поместить по шесть пробирок - разведение сыворотки от 1:4 до 1:128).
После приготовления разведений сыворотки во все пробирки добавляют по одной капле 2 - 3 % взвеси стандартных эритроцитов противоположной группы: при исследовании сыворотки группы В(III) - эритроциты группы А(II), при исследовании сыворотки группы А(II) - эритроциты группы В(III) и при исследовании сыворотки группы O(I) в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы А(II), в другой ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой при комнатной температуре, с прогретой - при 37 °С.
3. Трактовка результатов
Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне пробирки, просматривая его через лупу с 6 - 8-кратным увеличением над источником света.
При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных антител, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре.
Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к агглютининам альфа (или бета), титр антител в прогретой сыворотке - к иммунным антителам анти-А (или анти-В). В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицатьный результат во всех пробирках с прогретой сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы.
IV. Определение неполных изоиммунных антител системы АВО непрямой пробой Кумбса
1. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NаСl, после чего на дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для исследования.
2. Техника реакции
При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы О(I) - два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой пробирки ее номер и все другие сведения, как сказано выше для реакции солевой агглютинации.
Во все пробирки, начиная с № 2, накапывают по три капли изотонического раствора NаСl, а затем в пробирки № 1 и № 2 - по три капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода солевой агглютинации, но в объеме трех капель.
Во все пробирки пастеровской пипеткой добавляют по одной маленькой капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы, смешивают сыворотку с эритроцитами и штатив помешают для инкубации в термостат на 45 минут при 37 °С. За это время иммунные антитела, если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки доливают изотонический раствор NаСl, перемешивают их содержимое и центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание повторяют три раза.
После отмывания в каждую пробирку добавляют 3 - 5 капель изотонического раствора NаСl для получения приблизительно 5 % взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью, пронумеровав предварительно места на пластинке соответственно номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по одной капле сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой. Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом покачивании пластинки.
Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации, видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) с указанием времени ее появления в секундах и минутах. Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных антител анти-А или анти-В неполной формы, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре15.
В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции исследуемой сыворотки.
_____________
15 Контроль в отношении возможного ложно-положительного результата за счет активных полных антител не требуется, т. к, в данном случае непрямая проба Кумбса ставится как дополнение только при отрицательном результате в солевой среде.
3. Трактовка результатов
В ходе вышеописанного исследования определяются три вида антител:
- нормальные полные антитела - агглютинины альфа и бета (термолабильные);
- иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные),
- иммунные неполные антитела анти-А и анти-В (термостабильные).
Общее заключение делается на основании сопоставления результатов всех исследований:
а) наличие иммунных (термостабильных) антител полной или неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в организм человека антигена, несовместных полных (термолабильных) антител альфа и бета и редко превышает такие показатели, как 1:8 - для иммунных полных антител и 1:32 - для иммунных неполных антител;
б) высокий титр нормальных полных антител - агглютининов альфа и бета (альфа выше, чем 1:256 и бета выше, чем 1:128 при данном методе исследования) даже при отсутствии иммунных термостабильных антител в момент исследования, отражает состояние повышенной сенсибилизации организма и позволяет сделать предположение о бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого по системе АВО.
в) отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В при титре нормальных антител альфа не выше, чем 1:256 и бета не выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы АВО к моменту данного исследования.
V. Определение гемолизинов системы АВО
1. Оснащение
- стандартные эритроциты группы О(I), А (II) и В(III)
- изотонический раствор NаСl
- пробирки вместимостью 8 - 10 мл
- маленькие пробирки высотой 4 - 5 см, диаметром 0,8 - 1,0 см
- штативы
- термостат 37 °С
- центрифуга
2. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III), а также эритроциты исследуемого лица дважды отмывают изотоничеcким раствором NаСl путем центрифугирования и готовят из них 5 % взвесь в изотоническом растворе NаСl.
Сыворотку для исследования используют со сроком хранения не более 48 часов при температуре 4 - 8 °С.
В предварительно пронумерованных пяти пробирках вместимостью 8 - 10 мл готовят разведения исследуемой сыворотки в изотоническом растворе NаСl, начиная от 1:2 до 1:32 в объемах 2 - 3 мл.
3. Техника реакции
В штатив устанавливают по пять маленьких пробирок: три ряда при исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) или четыре ряда - при исследовании сыворотки группы О(I). Пробирки нумеруют одинаково во всех рядах соответственно нумерации пробирок с исходными разведениями сыворотки.
Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).
Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят соответственно номерам по пять капель в маленькие пробирки так, чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4 и т. д. до 1:32.
Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).
Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят соответственно номерам по 5 капель в маленькие пробирки так, чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4 и т.д. до 1:32.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле 5 % взвеси эритроцитов: в первый (контрольный) ряд пробирок вводят эритроциты лица, сыворотка которого исследуется: во второй (также контрольный) ряд - эритроциты группы О(I); в третий ряд вводят эритроциты противоположной группы, т.е. группы В(III), если исследуется сыворотка группы А(II) или группы А(II), если исследуется сыворотка группы В(III). При исследовании сыворотки группы О(I) в третий ряд вводят эритроциты группы А(II), а в четвертый ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и штатив помещают на 45 минут при температуре 37 °С, затем пробирки вынимают из термостата и рассматривают результат невооруженным глазом в проходящем свете.
4.Трактовка результатов определения групповых гемолизинов
В ходе исследования определяется наличие или отсутствие групповых гемолизинов анти-А и анти-В.
Результаты оценивают по соотношению количества сохранившихся эритроцитов в осадке и степени гемолиза, т.е. интенсивности окрашивания надосадочной жидкости:
- если эритроциты полностью сохранились в осадке, а надосадочная жидкость прозрачна и бесцветна, это значит, групповые гемолизины отсутствуют, что обозначают знаком минус (-),
- если осадок эритроцитов частично сохранился, а надосадочкая жидкость прозрачна и окрашена в красный цвет разной интенсивности (иногда только небольшим слоем над осадком эритроцитов) - это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины различной степени активности (обозначают знаками от одного плюса (+) до трех плюсов (+++),
- если осадок эритроцитов отсутствует, а вся жидкость окрашена в ярко-красный цвет и прозрачна, это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины, что оценивается на четыре плюса (++++), ...
Методические рекомендации "Определение иммунных антител групповой системы АВО", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года № 10-11/135, считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |
Инструкция по изготовлению консервированных стандартных эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. № 2)
Стандартные эритроциты, содержащие определенные сочетания аллоантигенов, предназначены для выявления антиэритроцитарных антител в сыворотке исследуемой крови, при определении групп крови АВО перекрестным способом, при определении резус - принадлежности крови, а также для проведения контроля специфичности и активности стандартных изогемагглютинирующих сывороток АВО, сывороток антирезус; тест-сывороток и реактивов, предназначенных для определения антигенов различных систем эритроцитов крови человека. Стандартные эритроциты группы О(I) должны содержать в эритроцитах клинически значимые антигены: D, С, Сw, с, Е, е, К, k, Fу, Jk, М, N, S, s, Le.
С целью увеличения срока годности стандартных эритроцитов можно производить их консервирование специально изготовленными консервирующими растворами.
I. Требования, предъявляемые к стандартным эритроцитам
Стандартные эритроциты для исследований по системе АВО должны давать четкую, хорошо видимую агглютинацию при взаимодействии со стандартными сыворотками соответствующей специфичности и не давать агглютинации с сыворотками, не содержащими антител против данного антигена эритроцитов.
Стандартные эритроциты группы А(II), предназначенные для выявления агглютинина анти-А, должны иметь титр не ниже 1:64, эритроциты группы В(III), предназначенные для выявления агглютинина анти-В, также должны иметь титр не ниже 1:64.
Титр антигенов А и В устанавливается с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток группы А-бета(II) (анти-В) и В-альфа(III) (анти-А), или соответствующих моноклональных антител, удовлетворяющих требованиям действующих инструкций.
Время наступления агглютинации эритроцитов А1 и В со стандартными изогемагглютинирующими реактивами должно составлять не более десяти секунд; эритроцитов подгруппы А3, В2 - не более двух минут.
Стандартные эритроциты группы крови О(I) не должны давать агглютинации со стандартными сыворотками групп крови О-альфа бета(I), А-бета(II), В-aльфа(III) в течение двадцати минут.
Стандартные резус-положительные эритроциты группы крови O(I), содержащие антиген D, а также антигены С, Сw, с и Е, е в различных сочетаниях, предназначенные для выявления антител системы резус, должны давать соответственно со стандартными сыворотками анти-D, анти-С, анти-Сw, анти-с, анти-Е и анти-е четкую агглютинацию при определении методом конглютинации с желатином, экспресс-методом в пробирках или на плоскости без подогрева или непрямой пробе Кумбса в зависимости от того, для какого метода исследования предназначена данная стандартная сыворотка антирезус.
Стандартные резус-отрицательные эритроциты О(I) фенотипа ссddее не должны давать агглютинации с реактивами антирезус, содержащими антитела анти-D, анти-С, анти-Е во всех методах исследования, для использования в которых предназначены указанные реактивы антирезус.
Время наблюдения за отрицательной реакцией должно соответствовать времени, установленному для каждой из этих реакций.
II. Приготовление консервированных стандартных эритроцитов
Приготовление стандартных эритроцитов производится в условиях строгого соблюдения асептики и состоит из изготовления консервирующего раствора, получения взвеси эритроцитов в консервирующем растворе, розлива эритроцитов, маркировки продукции и контрольных исследований.
1. Изготовление консервирующего раствора для стандартных эритроцитов
Консервирующей средой для приготовления стандартных эритроцитов могут служить растворы следующего состава:
|
Консервант № 1 |
|
|
сорбит |
40,0 г |
|
глюкоза |
6,0 г |
|
Nа2НРО4х12Н2О |
2,0 г |
|
КН2РО4 |
0,9 г |
|
левомицетин |
0,06 г |
|
этиловый спирт 96 |
100 мл |
|
вода бидистиллированная |
до 1000 мл |
|
рН раствора |
6,8 -6,9 |
В случае необходимости доведения рН до требуемой величины добавляется несколько кристаллов аскорбиновой кислоты или Na2НРО4х12Н2О.
|
Консервант № 2: |
|
|
аденин |
0,03 г |
|
инозин |
0,06 г |
|
лимонная кислота |
1,5 г |
|
глюкоза |
3,0 г |
|
Na3РО4 |
0,4 г |
|
NаОН 1н |
20 мл |
|
вода дистиллированная |
до 100 мл |
|
рН раствора |
6,3 -6,4 |
Консервирующие растворы (консерванты) представляют собой прозрачную бесцветную жидкость без запаха. Стерилизания консервантов производится путем фильтрования их через соответствующие стерилизующие фильтры. Розлив производят в стерильные флаконы емкостью 250 мл или 500 мл, которые немедленно закрывают резиновыми пробками и завальцовывают металлическими колпачками. Срок годности консервантов - шесть месяцев. В случае помутнения консервирующего раствора или появления желтого окрашивания применение его для работы недопустимо.
2. Получение взвеси эритроцитов в консерванте
Источником получения стандартных эритроцитов является эритроцитная масса, получаемая после удаления плазмы из консервированной крови доноров. Кровь берут от доноров, фенотип эритроцитов которых заранее определен. Для получения стандартных эритроцитов, содержащих антигены системы АВО, в качестве исходного материала должна быть использована эритроцитная масса от одного специально отобранного донора.
А для получения стандартных эритроцитов других систем можно испольэовать смесь эритроцитов группы О(I) от нескольких (2 - 4) доноров различного фенотипа таким образом, чтобы каждый из редких антигенов: К, Сw, Е присутствовали в эритроцитах не менее чем у двух доноров.
Используется эритроцитная масса, полученная не позднее 2 - 3 суток от момента заготовки крови.
В боксе через стерильную систему путем прокола переливают эритроцитную массу во флакон с заготовленным консервантом так, чтобы соотношение эритромассы и консерванта было 1:4. Содержимое флакона осторожно перемешивают и разливают той же системой в стерильные флаконы по 5, 10 или 25 мл. Используют обычную систему для взятия.
Флаконы (по 5, 10 или 25 мл) закрывают резиновыми пробками, завальцовывают металлическими колпачками, немедленно маркируют (см. п. 3) и помещают в рефрижератор при температуре +4 °С.
3. Маркировка
На флаконы со стандартными эритроцитами наклеивают этикетки с указанием: учреждения, изготовившего эритроциты, группы крови по системе АВО, антигенного состава эритроцитов, срока годности. Наставление по применению стандартных эритроцитов прилагается при выдаче (см. п. IV).
4. Контроль
Контроль специфичности и активности стандартных эритроцитов производится после их расфасовки и маркировки в изоиммунологической лаборатории станции переливания крови.
5. Хранение и сроки годности
Стандартные консервированные эритроциты хранят при +4 °С. Срок годности консервированных стандартных эритроцитов - два месяца. При использовании в качестве стандартных эритроцитов цельной консервированной крови, а также эритроцитной массы в комбинации с другими гемоконсервантами, срок хранения стандартов 1 - 4 недели.
III. Транспортировка стандартных эритроцитов
Транспортировка стандартных эритроцитов производится аналогично транспортировке консервированной крови в изотермической таре.
IV. Наставление по применению консервированных стандартных эритроцитов (прилагается при выдаче)
Консервированные стандартные эритроциты используют в постановках реакций в различных методиках в соответствии с действующими инструкциями по изосерологии.
1. Стандартные эритроциты группы О(I) с содержанием в эритроцитах клинически значимых антигенов D, С, Сw, с, Е, е, K, k, Fу, Jk, М, N, S, s, Lе предназначены для выявления соответствующих изоимунных противоэритроцитарных антител в сыворотке крови доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в желатине, непрямой пробе Кумбса, реакции агглютинации и солевой среде в пробирках или на плоскости.
Для желатинового метода используют осадок стандартных эритроцитов или 10 % их взвесь в желатине, для чего к одной части осадка эритроцитов добавляют девять частей 10 % раствора желатина, стандартизованного для серологических исследований. В реакции используют по две капли (0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных эритроцитов в желатине используют в течение рабочего дня, на следующий день готовят новую порцию. В непрямой пробе Кумбса и реакции агглютинации в солевой среде используют стандартные эритроциты, отмытые не менее двух раз физиологическим раствором хлористого натрия.
2. Стандартные эритроциты группы О(I), А1(II), А2(II), В(III) предназначены для выявления изогемагглютининов альфа и бета в сыворотке или плазме крови при определении групповой принадлежности крови перекреcтным методом, а также для выявления неполных изоимунных альфа и бета антител в сыворотке крови доноров, больных и беременных с помощью реакции конглютинации в желатине и непрямой пробе Кумбса. Для перекрестного метода и реакции конглютинации в желатине применяют неотмытые стандартные эритроциты, взятые непосредственно из осадка со дна флакона. Для желатинового метода используют осадок стандартных эритроцитов или 10 % их взвесь в желатине, для чего к одной части осадка эритроцитов добавляют девять частей 10 % раствора желатина, стандартизованного для серологических исследований. В реакции используют по две капли (0,1 мл) взвеси. Взвесь стандартных эритроцитов в желатине используют в течение рабочего дня, на следующий день готовят новую порцию. В непрямой пробе Кумбса и реакции агглютинации в солевой среде используют стандартные эритроциты, отмытые не менее двух раз физиологическим раствором хлористого натрия.
3. Срок годности консервированных стандартных эритроцитов - два месяца.
Стандартные эритроциты из разгерметизированного флакона пригодны для использования в течение недели.
|
Начальник
Управления организации |
А.И. Вялков |