Инструкция Минздрава СССР
«Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов,
организация и проведение профилактических и
противоэпидемических мероприятий»

(утв. Главным эпидемиологическим управлением Минздрава СССР
30 октября 1990 г. № 15-6/42)

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

В основу методических материалов и рекомендаций данной инструкции положены результаты исследований, проведенных в течение многих лет в ЦНИИЭ, Ленинградском НИИЭМ им. Пастера и НИИЭМ СО АМН СССР - Всесоюзном центре по иерсиниозам и другими практическими и научными учреждениями, работающими по данной проблеме. Обращается внимание эпидемиологов на усиление профилактических и противоэпидемических мер, направленных на предотвращение загрязнения иерсиниями пищеблоков, особенно организованных коллективов, в которых и формируется эпидемически неблагополучная ситуация. Указывается на повсеместный рост спорадической заболеваемости.

Предлагаются мероприятия, направленные на предупреждение загрязнения овощехранилищ.

Описывается лабораторная диагностика с использованием новых сред, испытанных в практике. Особое внимание уделено серологической диагностике.

Инструкция включает современные методы идентификации иерсиний, в том числе определение их вирулентных свойств. В связи с тем, что не все практические лаборатории располагают возможностями более тонких методов идентификации, предполагается выполнение их в республиканских или союзных центрах.

Инструкция призвана способствовать унифицированию методов исследования и идентификации возбудителя, а также улучшению диагностики иерсиниозов.

2. Эпидемиология

2.1. Источники инфекции

Роль животных, носителей возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза как источников инфекции для человека, неравноценна. При иерсиниозе таковыми могут быть больные сельскохозяйственные животные (свиньи, коровы, овцы, козы). При псевдотуберкулезе эти животные в качестве источника инфекции практического значения не имеют.

От грызунов, обитающих в дикой природе, также как и в антропогенных очагах, люди указанными иерсиниозами непосредственно практически не заражаются. Грызуны (больные или носители) выделяют возбудителей в окружающую среду и могут при этом инфицировать пищевые продукты. Обсеменение иерсиниями пищевых продуктов, преимущественно овощей, происходит при их хранении, транспортировке или технологической обработке в результате попадания на них частиц инфицированной иерсиниями почвы, в которой при определенных условиях (состав почвы, ее pH, влажность и т.д.) бактерии псевдотуберкулеза и иерсиниоза после выделения их животными способны размножаться и длительно сохраняться.

Человек при псевдотуберкулезе источником инфекции не является, при иерсиниозе больной или носитель при определенных условиях может заразить окружающих.

2.2. Пути передачи

Основным путем передачи возбудителей псевдотуберкулеза и иерсиниоза является пищевой. С ним в большинстве случаев связаны спорадические и групповые заболевания. При иерсиниозе имеет место бытовой путь передачи от больных животных при уходе за ними и редко от человека - больного или носителя при тесном общении (мать - ребенок) или в условиях стационара.

В связи с известными фактами инфицирования иерсиниями воды в открытых водоемах нельзя исключить возможность водного пути передачи, но для его реализации, видимо, требуются особые условия.

2.3. Факторы передачи

В большинстве случаев непосредственной причиной заболевания является попадание иерсиний в восприимчивый организм с продуктами питания. Инфицирование пищевых продуктов возможно в местах их хранения и производства непосредственно или опосредованно (через загрязненную почву) от грызунов (псевдотуберкулез) или сельскохозяйственных животных (иерсиниоз). Обсемененность овощей не исключена в местах их выращивания в зоне природных очагов. Длительное содержание инфицированных овощей в хранилищах сопровождается накоплением на них иерсиний. Обсемененность овощей иерсиниями, особенно псевдотуберкулеза, возрастает в зимне-весеннее время. В этот период иерсинии выявляются на различных предметах окружающей среды и, в первую очередь, в контейнерах и таре для овощей. Однако и в весенне-летний период на овощах нового урожая, преимущественно капусте, а также огурцах, помидорах, луке зеленом и других летних овощах, в частности, выращенных в теплицах, поступивших в инфицированное хранилище, иерсинии также накапливаются. Условия для обсеменения овощей и окружающей среды создаются не только в крупных овощехранилищах, но и в небольших складах при пищеблоках, а также в теплицах. Иерсинии выделяют с фруктов, в том числе цитрусовых, капусты квашеной, соленых огурцов, моркови.

Имеет место обсемененность иерсиниями (чаще энтероколитика) мяса рогатого скота и свиней, тушек кур, поверхности яиц и тары для них, а также молока на всем пути его производства. В отдельных случаях могут быть обсеменены как возбудителем псевдотуберкулеза, так и иерсиниоза хлебобулочные и кондитерские изделия (сухари, печенье и т.д.), которые нередко загрязняются выделениями грызунов.

Обсемененность различных продуктов иерсиниями определяет их значение как потенциальных факторов передачи. Наиболее значимы, особенно при псевдотуберкулезе, овощи. Занос возбудителей псевдотуберкулеза и иерсиниоза с овощами (зимними и летними) в пищеблоки при нарушении санитарно-гигиенического или технологического режимов его работы сопровождается быстрым инфицированием инвентаря и оборудования, которое используется для первичной обработки овощей, загрязняется также кухонная (терки, разделочные доски, ножи, емкости) и столовая (тарелки, чашки, столовые приборы) посуда; это приводит к обсеменению различных готовых блюд, в первую очередь овощных, в которых при относительно длительном хранении происходит накопление не только возбудителей, но и продуктов их метаболизма.

На практике в качестве факторов передачи при псевдотуберкулезе с наибольшей частотой отмечены салаты, содержащие капусту, морковь, репчатый лук, яблоки. При иерсиниозе - мясо, молоко и молочные продукты.

2.4. Характеристика заболеваемости

Заболевания людей псевдотуберкулезом и иерсиниозом регистрируются на всей территории Советского Союза. В районах с умеренным климатом эти инфекции выявляются в настоящее время значительно чаще, чем в сухих и жарких местах. Псевдотуберкулез и иерсиниоз проявляются в виде спорадической и групповой заболеваемости.

Спорадическая заболеваемость формируется за счет случаев, возникающих в семье или предприятиях общественного питания. В последние годы спорадическая заболеваемость той и другой инфекциями с постоянством регистрируется на всех территориях. Групповая заболеваемость характерна для псевдотуберкулеза. Она возникает на фоне спорадической и на отдельных территориях нередко преобладает над ней.

Вспышки могут быть распространенными, когда заболевания регистрируются в нескольких коллективах одного населенного пункта, и локальными, при которых заболевания отмечаются только в одном коллективе или в нескольких, но объединенных общим питанием.

По продолжительности вспышки могут быть разделены на кратковременные и длительные. Первые возникают внезапно, взрывообразно, быстро охватывают значительную часть коллектива (до 30 % и более). По своей структуре они могут иметь различия в зависимости от сроков и кратности употребления инфицированного продукта.

При однократном инфицировании людей через блюда из сырых овощей и быстром устранении фактора передачи заболеваемость характеризуется резким подъемом и спадом в течение 5 - 8 дней. При повторном употреблении инфицированного продукта в течение 2 - 3 и более дней наблюдается несколько волн подъема заболеваемости. В том и другом случаях возможно появление поздних заболеваний за счет рецидивов и осложнений у людей с инапарантным течением заболевания в начале вспышки. Кратковременные вспышки чаще возникают в закрытых или полузакрытых коллективах (школы-интернаты, общеобразовательные школы, пионерские лагеря, детские сады и т.д.) с единым пищеблоком и общим фактором передачи. Вспышки «длительные» продолжаются иногда до 3-х месяцев с небольшими подъемами и спадами числа заболеваний и охватывают незначительную часть питающихся в одной или нескольких столовых. Они чаще возникают на предприятиях, в высших и средних учебных заведениях, где в столовых имеется более или менее разнообразный ассортимент блюд и несколько точек питания.

Заболеваемость псевдотуберкулезом и иерсиниозом распространена больше в городах и поселках городского типа. В значительно меньшей степени болеет сельское население.

Однако централизация питания в сельской местности сопровождается ростом заболеваемости псевдотуберкулезом и здесь.

Псевдотуберкулезом в основном болеют люди в возрасте от 2 до 50 лет. При этом уровень детской заболеваемости, как правило, выше, чем у взрослых. В отличие от псевдотуберкулезной инфекции при иерсиниозе дети до 2-х лет чаще вовлекаются в эпидемический процесс. При этом нередко в этой возрастной группе отмечается самый высокий показатель заболеваемости. Каких-либо особенностей в распределении заболеваний псевдотуберкулезом и иерсиниозом по полу нет. Имеющие место колебания показателей заболеваемости псевдотуберкулезом у лиц различных профессий в отдельные годы не обусловлены профессиональной принадлежностью, а являются следствием ситуации, складывающейся в системе снабжения продуктами в предприятиях общественного питания. В отличие от этого при иерсиниозе имеет место профессиональная заболеваемость животноводов.

Для псевдотуберкулеза характерны два подъема заболеваемости в феврале-апреле и в июне-июле.

При иерсиниозе увеличение числа случаев наблюдается в октябре-ноябре и весной. Сезонные подъемы заболеваемости псевдотуберкулезом обусловлены употреблением овощей зимнего хранения, а в весеннее и летнее время тепличных культур и ранней капусты. Факторы, обуславливающие сезонность иерсиниоза, пока не ясны.

3. Организация и проведение профилактических и противоэпидемических
мероприятий

3.1. Профилактические мероприятия

Органы Государственного санитарного надзора совместно с организациями, осуществляющими производство, хранение и реализацию продуктов питания, составляют планы по профилактике псевдотуберкулеза и иерсиниоза для каждой территории, которые являются разделами комплексных планов по профилактике острых кишечных инфекций, утверждаемых Исполкомом Советов народных депутатов и включаемых в план социально-экономического развития района, города, области, республики.

Предупредительный санитарный надзор осуществляется в полном объеме, предусмотренном санитарным законодательством. При этом акцентируется внимание на выполнение санитарно-гигиенических условий технологических процессов приготовления, хранения и реализации пищевых продуктов с разделением потоков сырья и готовых продуктов на всех этапах, а также обеспечением грызунонепроницаемости помещений.

Текущий санитарный надзор включает системы мероприятий, направленных на предупреждение контаминации иерсиниями пищевых продуктов как в процессе их централизованного хранения и производства, так и на всех этапах реализации населению, а также на предотвращение попадания и накопления микроорганизмов в готовые пищевые продукты на пищеблоках организованных коллективов и предприятий общественного питания.

3.1.1. Мероприятия, направленные на предупреждение контаминации иерсиниями картофеля, овощей и фруктов в местах их хранения и реализации.

Текущий санитарный надзор за плодоовощными базами, складами и хранилищами включает:

- контроль за подготовкой типовых и приспособленных овоще- и фруктохранилищ к приему на хранение нового урожая.

После освобождения овощехранилищ от зимних овощей они должны быть тщательно очищены от гниющих остатков и мусора. Особое внимание обращается на ликвидацию их грызунопроницаемости. Съемные части оборудования, стеллажи, инвентарь, тару следует просушить на открытом воздухе. За 3 - 4 недели до загрузки стены, пол овощехранилища и все находящееся в нем оборудование обрабатывают осветленным 3 % раствором хлорной извести из расчета 500 мл на 1 кв. м поверхности с последующим (через сутки) проветриванием и побелкой помещений;

- контроль за обработкой и дезинфекцией тары плодоовощными базами перед отправкой ее поставщикам;

- контроль за санитарным состоянием плодоовощных баз и овощехранилищ, за своевременным освобождением их и прилегающих территорий от остатков овощей и производственного мусора;

- контроль за содержанием в удовлетворительном санитарно-техническом состоянием автомобильного и другого вида транспорта, предназначенного для перевозки картофеля, овощей и фруктов;

- наблюдение за численностью диких и синантропных грызунов и контроль за регулярным проведением дератизационных мероприятий проводится согласно «Методическим указаниям по борьбе с грызунами в населенных пунктах», утвержденным МЗ СССР 6.10.1981 г. за № 165-5, а также приказа МЗ СССР № 60 от 17.01.1979 г. «О мерах по дальнейшему укреплению и развитию дезинфекционного дела» и «Временным методическим указаниям по борьбе с обыкновенными полевками на овощебазах», утвержденным МЗ СССР в 1984 г.

В ходе текущего надзора следует учитывать результаты работы Государственной инспекции по качеству сельхозпродуктов, осуществляющей:

- контроль за соблюдением температурно-влажностных режимов хранения, рекомендованных для овощей и фруктов;

- контроль за качеством проведения переборки овощей, зачистки кочанов капусты перед выдачей потребителям. Особое внимание обращается на качество продуктов, направляемых в детские дошкольные учреждения, школы, интернаты, в лечебно-профилактические учреждения, пищеблоки организованных коллективов и предприятия общественного питания;

- контроль за проведением тщательной очистки и промывки овощей перед засолкой и квашением, использованием для этих целей специально выделенных помещений, инвентаря и тары.

Исследования на обсемененность возбудителем псевдотуберкулеза картофеля, овощей, фруктов, солений, квашений, инвентаря, тары и оборудования хранилищ проводится СЭС, исходя из эпидситуации, но не реже 1 раза в квартал.

Плановый контроль за инфицированностью иерсиниями грызунов на объектах, связанных с хранением овощей, путем отлова их и бактериологического исследования проводится 1 раз в квартал отделами особо опасных инфекций СЭС и учреждениями противочумной службы. В случае обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза у грызунов, добытых на плодоовощной базе, проводится внеплановая дератизация. Возможность поставки хранящихся здесь овощей на пищеблоки организованных коллективов и предприятий общественного питания и употребления их в сыром виде (при соответствующей обработке) решается эпидемиологом в зависимости от конкретной ситуации.

В целях предупреждения заболеваемости псевдотуберкулезом и иерсиниозом, связанной с реализацией ранних овощей, следует осуществлять:

- раздельное хранение зимних и ранних овощей, для чего до поступления первых партий ранних овощей подготавливается отдельное складское помещение для кратковременного их размещения (очистка, дератизация, дезинфекция, побелка, просушка). Не допускается использование освободившихся секций овощехранилища без соответствующей подготовки;

- периодическое 1 раз в месяц полное освобождение хранилища от ранних овощей и проведение в нем дезинфекции 3 % осветленным раствором хлорной извести. Обработанное таким образом помещение вновь используют для хранения ранних овощей;

- надзор за своевременной и полной реализацией ранних овощей;

- технологическую обработку теплиц, включая почву после сбора урожая, бактериологический контроль за обсемененностью иерсиниями овощей и оборудования в период сбора урожая.

В особо неблагополучных районах следует вводить раздельную реализацию торговой сетью ранних овощей и овощей зимнего хранения (картофель, репчатый лук и др.). При отсутствии таковой возможности организуется лотковая продажа летних овощей.

3.1.2. Мероприятия по предупреждению контаминации иерсиниями пищеблоков и готовых блюд.

Наиболее важным профилактическим мероприятием является постоянное слежение за общим санитарным состоянием стационарных и организуемых на период летнего отдыха пищеблоков. Эти мероприятия предусматривают:

- строгий контроль за санитарным состоянием и содержанием помещений и оборудования, предназначенных для разделки овощей, за обеспечением ежедневной обработки моющими средствами оборудования, инвентаря, применяемых для первичной обработки овощей;

- постоянный контроль за санитарным состоянием складских помещений, кладовых, овощехранилищ при пищеблоках, очистку и текущую дезинфекцию 1 % раствором хлорамина данных помещений перед каждым завозом новой партии овощей;

- постоянный контроль за работой пищеблока, выполнением правил обработки столовой посуды, маркировкой инвентаря;

- борьбу с грызунами на всех пищевых объектах;

- тщательную переборку овощей, предназначенных для приготовления салатов;

- исключение использования для салатов свежей капусты, моркови и других овощей (очистка, мытье, повторное мытье перед использованием), запрещение хранения очищенных овощей в холодной воде;

- обязательное мытье фруктов, в т.ч. цитрусовых;

- соблюдение регламентированных сроков хранения готовых блюд.

3.2. Противоэпидемические мероприятия

При возникновении вспышки псевдотуберкулеза и иерсиниоза или при подозрении на данные заболевания среди членов коллектива (семьи) проводятся следующие противоэпидемические мероприятия:

- запрещение употребления всех видов овощей и фруктов без термической обработки до расшифровки и ликвидации групповых заболеваний;

- активное выявление больных и переболевших в коллективе и среди обслуживающего персонала с применением лабораторных методов обследования и учетом клинических проявлений;

- бактериологическое и серологическое обследование работников пищеблока для выявления больных и бактерионосителей;

- забор проб пищевых продуктов и смывов с различных объектов пищеблока;

- заключительная дезинфекция во всех помещениях пищеблока с обработкой инвентаря и оборудования 1 % раствором хлорамина;

- бактериологическое исследование взятых на пищеблоке подозреваемых продуктов и готовых холодных блюд, а также смывов с инвентаря, оборудования, посуды пищеблоков и складских помещений, емкостей для отходов на иерсинии и другие бактерии семейства кишечных;

- тщательное мытье посуды моющими средствами в течение всего периода расшифровки и ликвидации вспышки;

- бактериологическое исследование смывов с овощей, инвентаря, оборудования плодоовощных баз и мест централизованного хранения овощей и фруктов, обеспечивающих район или коллектив, где возникла вспышка, с целью обнаружения циркуляции возбудителя и проведения санитарных мероприятий;

- обследование на наличие грызунов на пищеблоках и овощебазах, отлов и бактериологическое исследование грызунов;

- проведение внеплановых дератизационных мероприятий в случае обнаружения грызунов.

На территориях неблагополучных по заболеваемости псевдотуберкулезом и иерсиниозом, в детских организованных коллективах на период повышенной заболеваемости населения допускается запрещение употребления свежих овощей без термической обработки в виде салатов, винегретов и других блюд. Качественные ранние овощи (помидоры, огурцы, редис) могут быть тщательно вымыты и даны детям в целом виде.

Медицинское наблюдение за членами коллектива и обслуживающим персоналом проводится в течение 2-х недель с момента появления первых случаев заболевания (медицинский осмотр, термометрия). При наличии жалоб и клинических симптомов, характерных для иерсиниозов или других ОКЗ, больного изолируют и проводят лабораторное обследование. Дальнейшая тактика определяется результатами исследования и тяжестью клинического течения.

О сборе материала для лабораторного исследования и доставки его в лабораторию см. раздел 4.2.2. настоящей инструкции.

3.3. Организация и проведение эпидемиологического обследования

В квартирных очагах эпидемиологическое обследование проводится при одновременном появлении нескольких случаев заболеваний, а также независимо от числа заболевших в период роста заболеваемости, когда не установлены пути и факторы передачи для постановки эпидемиологического диагноза. В остальных случаях необходимость обследования квартирных очагов определяется эпидемиологом с учетом эпидемической ситуации и данных ретроспективного анализа заболеваемости.

В организованных коллективах, имеющих отдельные пищеблоки, и на предприятиях общественного питания при появлении первых случаев псевдотуберкулеза или иерсиниоза вопрос о необходимости обследования решается эпидемиологом, за исключением детских коллективов, где обследование обязательно. При появлении повторных заболеваний или при возникновении групповой заболеваемости обследование проводится с участием специалистов соответствующего санитарно-гигиенического профиля.

В процессе эпидемиологического обследования:

- оценивается эпидемиологическая обстановка в очаге за 2 недели до возникновения заболеваний. Анализируется заболеваемость по датам, диагнозам, группам (классам, цехам и др.), посещаемости детей в учреждении. Учитываются такие диагнозы, как ОРЗ, краснуха, скарлатина, вирусный гепатит, ОКЗ, аллергические заболевания, узловатая эритема, лимфаденит, острый аппендицит;

- проводится подробный анализ характера питания за 2 недели до возникновения заболеваний псевдотуберкулезом или иерсиниозом для выяснения фактора передачи возбудителя инфекции. Изучают меню, меню-раскладку, бракеражные журналы, обращая внимание на овощи и овощные блюда, употребляемые в пищу без термической обработки, различные овощные добавки к салатам, закускам (лук зеленый, репчатый, соления, квашения и пр.), а при иерсиниозе также на молоко, молочные продукты, мясо, особенно свинину. Сопоставив сроки употребления продуктов, длительность инкубационного периода и посещаемость заболевшими соответствующего учреждения, можно предположить возможные сроки заражения и факторы передачи возбудителя;

- оценивается санитарно-гигиеническое состояние объекта. Дается характеристика пищеблока и его соответствие санитарным нормам, заселенность грызунами, наличие аварий водопроводной и канализационной систем. Устанавливают, откуда, когда, в каком количестве получены продукты, их качество, условия хранения на пищеблоке;

- оценивается технология приготовления пищи, особенно овощей, предназначенных в пищу сырыми (сроки хранения очищенных овощей, замачивание их в холодной воде, повторное промывание, ошпаривание кипятком непосредственно перед приготовлением), место хранения блюд и сроки хранения от приготовления до реализации, наличие необходимого набора помещений, оборудования, инвентаря, их маркировка;

- анализируется значение выявленных нарушений санитарно-гигиенического режима и технологии приготовления продуктов в возникновении заболеваний для возможной вторичной контаминации иерсиниями готовых блюд, компотов, хлебобулочных, кондитерских изделий и других продуктов.

3.4. Госпитализация больных и порядок выписки из стационара

Больные госпитализируются с учетом тяжести течения болезни.

При возникновении вспышек псевдотуберкулеза или иерсиниоза в закрытом учреждении (пионерский лагерь, детский дом, школа-интернат и др.) допускаются для больных легкими формами заболевания развертывание стационара на месте при условии обеспечения больных квалифицированной медицинской помощью, лабораторным обследованием и соблюдения противоэпидемического режима. Бактерионосители подвергаются лечению в амбулаторных условиях без освобождения от работы.

Больных выписывают из стационара или после лечения на дому при клиническом выздоровлении.

3.5. Порядок допуска переболевших на работу и в детские организованные
коллективы

Работники пищевых объектов и лица, к ним приравненные, дети, посещающие детские учреждения, допускаются на работу и к посещению этих учреждений после выписки из стационара или лечения на дому на основании справки о выздоровлении. Дополнительных бактериологических обследований не проводится.

Бактерионосителей - работников пищевых предприятий на период амбулаторного лечения переводят на работу, не связанную с процессом приготовления пищи.

Дети, посещающие дошкольные учреждения, детские дома, школы, школы-интернаты, переболевшие псевдотуберкулезом или иерсиниозом, подлежат клиническому наблюдению с контролем температуры тела в течение 3-х недель.

Остальным категориям переболевших диспансерное наблюдение назначается по рекомендации врача стационара или поликлиники.

Дети-реконвалесценты освобождаются от профилактических прививок на 3 месяца. Срок освобождения от физкультуры определяется врачом в ходе наблюдения.

4. Лабораторная диагностика

Для успешного проведения лабораторного исследования необходимо знание биологических свойств возбудителей. Учитывая затруднения, нередко возникающие при дифференциации иерсиний с другими энтеробактериями, разделу идентификации выделяемых культур предпосланы некоторые современные данные о биологической характеристике иерсиний - возбудителей псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) и иерсиниоза (Yersinia enterocolitica).

4.1. Биологические свойства иерсиний

4.1.1. Морфологические свойства. Грамотрицательные палочки. При культивировании в жидких средах или при выделении из организма могут окрашиваться биполярно. Спор и капсул не образуют. У Y. pseudotuberculosis имеется 3 - 5, у Y. enterocolitica - множество жгутиков, расположены они перитрихиально. В мазках из бульонных культур клетки могут располагаться короткими цепочками.

4.1.2. Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. Оптимальная температура - 28 - 29 °С, могут размножаться при температуре от 2 до 40 °С. Подвижны при температуре 22 - 28 °С и неподвижны при 37 °С; у Y. enterocolitica подвижность более выражена. В условиях пониженной температуры (4 - 8 °С) культуры растут в гладкой форме, но накопление происходит медленно.

При температуре выше 28 °С Y. pseudotuberculosis диссоциирует в шероховатую (R) форму, при которой имеет место полиморфизм колоний по размеру, форме и цвету. Диссоциация Y. enterocolitica в этих условиях выражена слабо. Как правило, при выделении из организма больного или от животных иерсинии обоих видов находятся в S-форме. Однако, иногда встречаются свежевыделенные культуры Y. pseudotuberculosis, находящиеся в R или переходной (SR или RS) формах. При культивировании Y. pseudotuberculosis на питательных средах, особенно при температуре выше 28 °С, подобные формы встречаются часто. Они растут на обычном агаре в виде более крупных неправильной формы, иногда суковатых колоний с неровными краями, а в бульоне образуют помутнение и осадок либо осадок и поверхностную рыхлую пленку с прозрачной надосадочной жидкостью. Образование шероховатых форм обычно сопровождается изменением или даже потерей S-антигена. Такие культуры часто дают неспецифическую, спонтанную агглютинацию.

Иерсинии хорошо растут на дезоксихолатном агаре, средах: Мак-Конки, Эндо, Серова и с бромтимоловым синим (БТС).

Среда Плоскирева, висмут-сульфит агар обладают ингибирующим действием на оба вида иерсиний, в связи с чем рост их колоний требует большего времени инкубации (не менее 5 суток).

Оба возбудителя способны расти на голодных средах (голодно-кислый агар, фосфатнобуферный раствор и др.). В жидких средах (МПБ, бульон Хоттингера, среда БКД) образуют равномерное помутнение. На плотных средах (МПА, агары Хоттингера, Эндо) через 24 - 48 ч образуют круглые полупрозрачные гладкие колонии размером от 0,1 до 1,0 мм (37 °С).

На плотной дифференциально-диагностической среде Серова Y. pseudotuberculosis растут в виде матовых колоний с неровными краями и выпуклым центром, размером от 0,2 до 2,0 мм. При взятии петлей они сдвигаются по поверхности агара. Сходную морфологию на этой среде имеют колонии Y. enterocolitica серовара 03. Колонии иерсиний других сероваров, как правило, полиморфны и отличаются по размеру, форме и консистенции.

На среде БТС через 24 - 48 ч иерсинии образуют круглые гладкие колонии голубого цвета, размером 0,1 - 0,2 мм через 24 ч и до 2,0 мм через 48 ч, с фестончатым краем и выпуклым центром на темно-голубом фоне среды. Иногда, особенно у Y. pseudotuberculosis, виден светлый голубой ободок. При взятии петлей колонии сдвигаются по агару.

4.1.3. Биохимические свойства. На среде Хью-Лейфсона ферментируют и окисляют глюкозу, не обладают цитохромоксидазой, не образуют сероводород (на железосодержащих средах), не разжижают желатин, не имеют фенилаланиндезаминазы, лизиндекарбоксилазы и аргинингидролазы, цитрат Симонса не утилизируют.

Y. pseudotuberculosis ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, галактозу, L-арабинозу, левулезу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, трегалозу, маннит, салицин; редуцирует нитраты, метиленовый синий; реакции на каталазу, уреазу и с метиловым красным положительны, Фогес-Проскауэра - отрицательна (при 26 - 28 °С и 37 °С); не ферментирует лактозу, сахарозу, рафинозу, целлобиозу, дульцит, инозит, сорбит, инулин, Д-арабинозу.

Y. enterocolitica ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу, сорбит, трегалозу; обладает уреазой и орнитиндекарбоксилазой; реакция с метиловым красным положительна, Фогес-Проскауэра положительна при 26 - 28 °С и отрицательна при 37 °С; не ферментирует: лактозу, рамнозу, рафинозу (есть лактозо- и рафинозоположительные варианты, чаще сероваров 05 и 07, 8).

По биохимическим свойствам - ферментации ксилозы, салицина или эскулина, трегалозы, образованию индола различают 5 биоваров Y. enterocolitica (Табл. 1). Близкородственными являются виды: Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii (Bergey's Manual, 1984).

4.1.4. Антигенное строение и серологическая характеристика.

Y. pseudotuberculosis имеет жгутиковый (Н), 2 соматических (О) антигена - S и R, антигены вирулентности - V, W и другие, расположенные в наружной мембране и цитоплазме клетки, многие из них выражены только при 37 °С и в условиях ин виво. Н-антиген термолабилен, диагностического значения не имеет.

По S-антигену различают 8 сероваров Y. pseudotuberculosis. Большинство штаммов, выделенных от людей, животных и из внешней среды, принадлежит к I серовару (60 - 90 ), часть - к III (8 - 32 %), единичные - ко II, IV, V (2 - 8 %). О циркуляции в СССР иерсиний VI - VIII сероваров сведений нет.

О-антигены неоднородны по строению и состоят из нескольких компонентов, определяющих антигенные связи как между штаммами разных сероваров внутри вида, так и с другими энтеробактериями. R-антиген общий с R-антигеном чумного микроба. Общие антигены обнаружены с сальмонеллами групп В, Д и шигеллами.

Таблица 1

Примечание: п - патогенные иерсинии; ± - преобладает положительная реакция; + - преобладает отрицательная реакция; в - вариабельный признак; (1) - положителен у Р. rettgeri; (2) - положителен при 26 - 28 °С.

Антигенные связи Y. pseudotuberculosis и большинства сероваров Y. enterocolitica слабые и выявляются лишь иммунодиффузионными методами. Более значительные антигенные связи имеют место у Y. pseudotuberculosis серовара I с культурами Y. enterocolitica сероваров 08, 018, 021.

Y. enterocolitica имеют жгутиковый (Н) и соматический (О) антигены. Обнаружены у них и антигены вирулентности, родственные антигенам Y. pseudotuberculosis, что обусловлено содержанием в клетках обоих возбудителей плазмиды вирулентности с мол. массой 40 - 48 мегадальтон.

Н-антигены вариабельны по строению, разрушаются при кипячении, активны в реакции агглютинации при температуре культивирования клеток 26 - 28 °С.

По О-антигену различают серовары: 01,2а, 3; 02а,2в,3; 03; 04,32; 04, 33; 05; 05,27; 06,30; 06,31; 07,8; 08; 09; 010; 013,7; 014; 015; 018; 019,8; 020; 021; 022.

Большинство штаммов, изолированных от людей, животных и из объектов внешней среды, выделенных на разных территориях, принадлежит к серовару 03 (30 - 60 %), часть - к 05,27 (10 - 15 %), 07,8 (5 - 10 %) и 09 (1 - 30 %), единичные - к другим 17 сероварам, циркулирующим повсеместно. Встречаются нетипируемые штаммы.

В составе О- и Н-антигенов содержатся специфические и перекрестно-реагирующие антигены, определяющие внутривидовые и общие для энтеробактерий антигенные связи. Они выражены внутри вида и выявляются в РА у всех сероваров в титрах до 1:100 и выше. Наиболее выражены антигенные связи у иерсиний серовара 09 и бруцелл. Y. enterocolitica сероваров 08, 014, 018, 021 имеют общие антигены с сальмонеллами О-серогрупп: 27; 43_1,2; 55 и 66. Антигенные связи имеют место с шигеллами, холерным вибрионом, протеями, гафниями.

4.1.5. Вирулентность для лабораторных животных.

К важнейшим патогенным свойствам Y. pseudotuberculosis относят: адгезивность и колонизацию; инвазивность и внутриклеточное размножение (в эпителиальных клетках, макрофагах), цитотоксичность и способность вызывать генерализованный инфекционный процесс. Основной моделью для определения вирулентности является энтеральное заражение морских свинок. В широкой практике с этой целью используют конъюнктивальное заражение морских свинок (т.н. кератоконъюнктивальная проба).

К важнейшим патогенным свойствам Y. enterocolitica относят: адгезивность и способность к колонизации на поверхности эпителиальных клеток, энтеротоксигенность, выраженную у большинства штаммов, а также инвазивность, установленную у штаммов патогенных сероваров. Основными моделями для определения вирулентности этих иерсиний являются: заражение культуры клеток Нер-2, тест на мышах-сосунках и энтеральное заражение морских свинок.

4.1.6. Патогенность для человека. Y. pseudotuberculosis I - V сероваров вызывают псевдотуберкулез. Возбудителем иерсиниоза на территории СССР являются Y. enterocolitica сероваров: 03 (биовар IV), 09 (биовар II), 05,27 (биовар III). Y. enterocolitica других сероваров и биоваров широко распространены в природе (особенно представители I биовара) и, как правило, не связаны с заболеваниями человека.

4.2. Методы обнаружения возбудителей

С учетом биологии возбудителей псевдотуберкулеза и иерсиниоза бактериологическое исследование материала от больных, животных и объектов окружающей среды проводят с использованием одних и тех же сред накопления и плотных сред для их выращивания.

4.2.1. Среды, используемые для выделения иерсиний.

Жидкие среды накопления: фосфатно-буферный раствор - ФБР (приложение 1), буферно-казеиново-дрожжевая среда - БКД (приложение 2).

Плотные питательные среды: дифференциально-диагностическая среда Серова (приложение 3), Эндо, среда с бромтимоловым синим - БТС (приложение 4). Комбинированные среды для первичной идентификации: Олькеницкого, Универсальный скошенный столбик - УСС (приложение 5).

4.2.2. Материал для исследования и его обработка.

Для исследования используют различный материал от больных людей, животных и различных объектов внешней среды (Табл. 2).

Таблица 2

Материал для бактериологического исследования, способы его забора и обработки

________

^* Смывы и суспензирование материала проводить с использованием сред накопления.

4.2.3. Порядок бактериологического исследования.

Несмотря на невысокую эффективность прямого посева исследуемого материала на плотные питательные среды, его следует проводить при групповых заболеваниях. Для этих целей лучше применять среду Серова или БТС (на среде Эндо вырастает много посторонней микрофлоры).

Целесообразно использовать следующую схему.

Посев в среду накопления проводят после предварительной подготовки исследуемого материала. Внесенный в пробирки с 5 мл БКД или ФБР материал ставят в холодильник и выдерживают в нем при 4 - 8 °С 7 - 15 дней или до положительного высева.

Высевы на чашечные среды проводят на 2 - 3, 5 и 7-е сутки, а с ФБР - дополнительно на 10 - 15-е сутки. Высевы производят петлей (или стеклянной палочкой) из верхней трети слоя среды (но не с поверхности). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают.

При использовании среды Эндо исследуемый материал можно предварительно подвергнуть щелочной обработке.

Методика щелочной обработки основана на относительной резистентности к щелочи иерсиний и чувствительности к ней других энтеробактерий. В лунки полистироловых планшетов для иммунологических реакций наливают по 0,2 мл свежеприготовленного щелочного раствора (Приложение 6) и бактериологической петлей диаметром 4 - 5 мм (или стеклянной палочкой) вносят материал из пробирок. Экспозиция (с момента внесения материала до посева) - не более 1 - 2 мин. Далее из каждой лунки делают высев на сектор чашки со средой Эндо. Инкубирование посевов при температуре 37 °С (или 26 - 28 °С) - 2 суток.

При посеве материала на среду Серова или БТС обработка щелочным раствором не требуется; высев делают на поверхность всей чашки; инкубирование при температуре 37 °С - 2 суток.

Просмотр посевов. На среде Серова просмотр проводят визуально или с помощью лупы. Возможен рост 2 типов колоний Y. pseudotuberculosis. Чаще встречаются мелкие, размером 0,2 - 2,0 мм, круглые с выпуклым центром колонии. Реже - относительно крупные (до 3 мм) неправильной формы с выпуклым центром. Колонии обоих типов имеют суховатую матовую поверхность. При снятии они сдвигаются по агару. Колонии Y. enterocolitica матовые с неровным краем, до 5 мм, с более плотной поверхностью и выпуклым центром. Колонии других видов кишечных бактерий на этой среде блестящие, большие, с неровным краем, обычно легко снимаются.

На среде Эндо просмотр колоний также производят визуально или с помощью лупы, через сутки - двое после посева.

Через 24 ч иерсинии обоих видов вырастают в виде мелких (0,3 - 0,5 мм), выпуклых, гладких, лактозонегативных колоний; к 36 - 40 часам они увеличиваются в размере, приобретая розовый оттенок.

Аналогичным образом просматривают посевы на среде БТС. Описание характерных колоний иерсиний на этой среде помещено в разд. 4.1.2.

Отсев. Характерные для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica колонии отсевают на среду Олькеницкого или УСС (приложение 5). Одновременно с отсевом на полиуглеводную среду материал той же колонии высевают в пробирку со скошенным агаром или на чашку со слабощелочным питательным агаром.

4.2.4. Идентификация иерсиний. Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают по комплексу типичных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств.

Для дальнейшей биохимической идентификации отбирают бактериальные культуры, обладающие на среде Олькеницкого уреазной активностью (малиновое окрашивание), на УСС - окрашивающие среду в желтый или малиновый цвет (Табл. 3).

Таблица 3

Основные признаки иерсиний и некоторых других бактерий
на дифференциальных средах

С чашек или «косяков» производят засев биохимического ряда. Инкубирование пробирок биохимического ряда проводят при 37 или 26 - 28 °С (при температуре 26 - 28 °С отмечается более стабильное выражение некоторых признаков). Пробирки с полужидким агаром (подвижность) и средой Кларка (реакция Фогес-Проскауэра) инкубируют при 37 и 26 °С.

В таблице 1 приведен минимальный набор биохимических тестов, позволяющий дифференцировать Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica 5 биоваров, другие виды иерсиний, а также микроорганизмы, имеющие сходство с иерсиниями.

Для идентификации Y. pseudotuberculosis и дифференциации их от других энтеробактерий можно применять поливалентный псевдотуберкулезный бактериофаг. Пробу ставят на плотной питательной среде при температуре 20 - 22 °С, нанося цельный или разведенный фаг каплями или дорожкой на сплошной посев «газоном». Серологической идентификации подлежат культуры, отнесенные по биохимическим свойствам к видам Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Ее проводят с помощью реакции агглютинации на стекле (методика общепринятая) с диагностическими сыворотками к Y. pseudotuberculosis (поливалентная к I - V сероварам и моновалентные к I и III сероварам) и к Y. enterocolitica наиболее распространенных сероваров (03; 09; 05,27; 08; 07,8; 04,32; 05; 013,7).

4.3. Определение вирулентности

4.3.1. Определение вирулентности Y. pseudotuberculosis^*. Методика постановки кератоконъюнктивальной пробы

________

^* Рекомендуется для Центра по иерсиниозам и его филиалов, а также специализированных лабораторий.

Для постановки кератоконъюнктивальной пробы используют морских свинок массой 200 - 300 г. Заражение проводят суточной культурой свежевыделенных штаммов иерсиний псевдотуберкулеза, выращенных на агаре Хоттингера. В конъюнктивальную полость бактериологической петлей диаметром 2 - 5 мм вводят бактерии в дозе 1×10⁹ - 1×10¹⁰. Для каждого штамма используют не менее двух животных, заражая у них один глаз (второй служит контролем). Для этого левой рукой морскую свинку фиксируют на поверхности стола, а правой с помощью петли вводят культуру под приподнятое верхнее веко и осторожными движениями петли распределяют культуру по своду конъюнктивы. После этого извлекают петлю из конъюнктивальной полости, веки зараженного глаза смыкают на 1 мин., а петлю стерилизуют в пламени спиртовки. Животных содержат в индивидуальных банках или клетках. Ежедневно в течение недели, начиная со второго дня, оценивают изменения слизистой оболочки глаза.

Можно ограничиться внимательным осмотром состояния конъюнктивы (век, склеры, свода) и роговицы, освещая глаза настольной лампой. Удобнее использовать две лупы (с увеличением в 2 - 4 раза), фиксируя одной из них свет от настольной лампы на глаза животного, а через вторую поочередно рассматривать контрольный и зараженный глаз при раздвигании век. На каждую пробу заполняют протокол, регистрирующий выраженность признаков конъюнктивита (сужение глазной щели, гиперемия конъюнктивы, отек век, наличие и характер отделяемого конъюнктива) и состояние роговицы, оцениваемых крестами (Табл. 4).

Таблица 4

Критерии оценки степени выраженности конъюнктивита и кератита

Незначительная выраженность конъюнктивита через 2 - 3 суток после заражения и отсутствие его прогрессирования или даже затухание через 5 - 7 дней, отсутствие или слабая выраженность кератита через 2 - 3 суток, без прогрессирования или даже с исчезновением помутнения роговицы через 5 - 7 дней, характеризуют слабую вирулентность штамма. Более выраженный и прогрессирующий к 5 - 7 суткам конъюнктивит при незначительном непрогрессирующем помутнении роговицы расценивается как умеренная вирулентность штаммов. Прогрессирующие конъюнктивит и кератит, характеризующиеся обычно склеиванием изъязвленных век, обильным гнойным или гнойно-творожистым эксудатом, интенсивным помутнением роговицы, свидетельствуют о высокой вирулентности штаммов. Примеры оценки приведены в таблице 5.

Таблица 5

Оценка вирулентности штаммов иерсиний по степени выраженности изменений
конъюнктивы и роговицы морских свинок

Свежевыделенные штаммы Y. pseudotuberculosis закономерно вызывают кератоконъюнктивит различной выраженности, коррелирующий с изменениями во внутренних органах, что отражает степень их вирулентности.

4.3.2. Определение маркеров вирулентности иерсиний

Вирулентные иерсинии содержат в клетках специфические молекулы плазмидной ДНК (плазмиды вирулентности), гены которых кодируют синтез дополнительных белков, обусловливающих взаимодействие бактерий с чувствительными клетками хозяина, резистентность к бактерицидному действию сыворотки крови, а также ряд культурально-морфологических и других особенностей: зависимость роста от Cа⁺⁺, способность к аутоагглютинации, зависимость морфологии колоний от температуры, поверхностная гидрофобность клеток. Эти признаки являются маркерами вирулентных (П⁺) плазмидосодержащих иерсиний.

Методика определения способности к аутоагглютинации

Для посева используют свежевыделенные чистые культуры иерсиний (со скошенного агара, полиуглеводной среды) или изолированные колонии. В две пробирки со средой Кларка (приложение 7) засевают 10⁶ - 10⁸ клеток. Одну пробирку инкубируют при температуре 37 °С, другую - при 26 - 28 °С в течение 24 - 48 ч.

Положительный результат заключается в образовании рыхлого хлопьевидного осадка и прозрачной среды в пробирке, инкубированной при температуре 37 °С, при равномерном помутнении и небольшом компактном осадке во второй пробирке, инкубированной при температуре 26 - 28 °С. У псевдотуберкулезного микроба возможно образование хлопьев в обеих пробирках. При отрицательном результате в обеих пробирках отмечается равномерное помутнение среды, хлопья отсутствуют.

При нечетком положительном результате проводят выделение плазмидосодержащих клонов, которое возможно, например, в ходе определения кальцийзависимости роста.

Методика определения кальцийзависимости роста

Свойство кальцийзависимости проявляется в ограничении роста (бактериостаз), наступающем в условиях дефицита ионов в среде при температуре 37 °С.

Для посева используют культуру, выросшую при температуре 22 - 28 °С (например, на среде Кларка), которую в одинаковой дозе (100 - 500 м.к.) равномерно распределяют по поверхности кальцийдефицитной среды (приложение 8) в двух чашках, одну из которых инкубируют при температуре 37 °С, другую - при 26 - 28 °С в течение 48 ч.

При положительном результате колонии, выросшие при температуре 37 °С, значительно мельче, чем при 26 - 28 °С, или отсутствуют совсем (чаще у возбудителя псевдотуберкулеза). Если такую чашку дополнительно инкубировать при температуре 26 - 28 °С в течение 24 - 48 ч, на среде вырастут обычного размера колонии П⁺ - иерсиний. Иногда после инкубирования при температуре 37 °С наряду с мелкими вырастают крупные колонии (до 30 - 50 %), образованные клетками иерсиний, утративших плазмиду. При температуре 26 - 28 °С на кальцийдефицитной среде размеры колоний такие же, как на обычном питательном агаре.

У бесплазмидных иерсиний (отрицательный результат) рост при двух температурах такой же, как на обычных средах.

Методика определения температурозависимой морфологии колоний

Вирулентные иерсинии при определенных условиях образуют на обычном питательном агаре характерные колонии.

В качестве плотной среды для теста температурозависимой морфологии колоний используют агар АГВ. Посев производится так же, как при определении кальцийзависимости; учет результатов - через 24 - 48 ч визуально или с помощью лупы. Диаметр колоний измеряют с помощью окуляр-микрометра.

При температуре 37 °С П⁺ - иерсинии образуют более мелкие (в 1,5 - 3,0 раза), чем при 26 - 28 °С, колонии, менее прозрачные, желтоватые, зернистые, выпуклые; у П^- - иерсиний колонии крупнее, чем при 26 - 28 °С, или такие же, прозрачные, более плоские, голубоватые, маслянистые. При высокой достоверности различий средних диаметров колонии (t не менее 4), полученных при двух температурах, диаметр колонии П⁺ - иерсиний при 37 °С, как правило, не превышает 1,0 мм.

Методика определения Т⁺ и Т^- колоний

Чистую культуру испытуемого штамма иерсиний выращивают при 37 °С на питательном агаре в чашке в виде изолированных колоний. Посев микроскопируют в открытой чашке при малом увеличении микроскопа (объектив 8, окуляр 5× и 7×), лучше без конденсора, в проходящем искусственном свете от точечного источника.

Культуры иерсиний, содержащие плазмиду вирулентности, формируют на питательном агаре мелкие выпуклые колонии с ровным или слабо бахромчатым краем, непрозрачные, почти черные (Т⁺ колонии). Микробные клетки, не содержащие плазмиды вирулентности, образуют при этих же условиях более крупные, прозрачные, плоские, неструктурные колонии с ровным или волнистым краем (Т-колонии).

Методика постановки теста хлопьеобразования

Для определения хлопьеобразования используют культуры, выращенные при 37 °С и при комнатной температуре на питательном агаре. Микробную массу эмульгируют в капле 0,85 % раствора хлорида натрия на предметном стекле. При положительном результате культура, выращенная при 37 °С, остается в виде глыбок или в первоначально гомогенной суспензии в течение 1 - 2 мин. появляются хлопья по типу агглютината. Культура, выращенная при комнатной температуре, образует равномерное помутнение.

Штаммы иерсиний, не содержащие плазмиду вирулентности, хорошо эмульгируются в капле 0,85 % раствора хлорида натрия с сохранением равномерного помутнения независимо от температуры культивирования (отрицательный результат). В случае обнаружения хлопьев в культурах, выращенных при 37 °С и при комнатной температуре, тест хлопьеобразования также считается отрицательным.

Результат в тесте хлопьеобразования в значительной мере зависит от процентного содержания в исследуемой культуре иерсиний бесплазмидных клеток. При наличии в популяции 25 % бесплазмидных клеток оценка теста хлопьеобразования может вызвать затруднение, а при 50 % тест становится отрицательным.

Для повышения достоверности получаемых результатов при дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов иерсиний необходимо параллельное изучение контрольных культур иерсиний.

При определении маркеров вирулентности рекомендуется использовать референтные плазмидосодержащие штаммы Y. enterocolitica серовара 03 (№ 188 в коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Москва, Сивцев Вражек, 41) и 09 (№ КМ-33/201 в коллекции ВНИПЧИ «Микроб», Саратов, Университетская, 46), а также бесплазмидные штаммы серовара 03 (№ 189 в ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и 09 (№ 207 там же). Кроме того, в качестве плазмидосодержащего можно использовать свежевыделенный штамм Y. pseudotuberculosis, формирующий типичные мелкие колонии на средах Серова и Эндо, а в качестве бесплазмидного - Y. enterocolitica биовара I, выделенные из объектов внешней среды.

При решении вопроса о принадлежности культуры к возбудителям иерсиниоза учитывают ее биохимические (биовар), антигенные (серовар) свойства и наличие маркеров вирулентности.

4.4. Обнаружение антител

Антитела к иерсиниям появляются в крови в конце первой - начале второй недели болезни. Обязательным условием является определение специфических антител в динамике болезни в парных сыворотках (не менее чем в двух), взятых от больных в первую неделю болезни и в конце второй - начале третьей.

Кровь берут из вены в стерильную пробирку в количестве 3 мл. Можно брать кровь из пальца. В этом случае взятую мерной пипеткой кровь смешивают с 0,85 % раствором хлорида натрия в таком соотношении, чтобы после центрифугирования получить сыворотку, разведенную 1:3. Примеры: 0,1 мл крови и 0,2 мл раствора; 0,2 мл крови и 0,4 мл раствора и т.д.

Для серодиагностики применяют реакцию непрямой гемагглютинации с эритроцитарными антигенными диагностикумами производства Ленинградского НИИ вакцин и сывороток, а также реакцию агглютинации.

4.4.1. Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА).

Постановка РИГА при наличии коммерческих ингредиентов методически проста, она позволяет выявить антитела в более ранние сроки.

Методика постановки и учета РИГА приведена в наставлении по ее применению, дополнительно рекомендуется при каждой постановке реакции включать в опыт прилагаемую гипериммунную сыворотку с известным титром в качестве контроля активности препарата.

Если диагностикум выявляет в сыворотке антитела в концентрации на 3 разведения ниже, чем указано, то такой препарат непригоден для дальнейшего использования.

4.4.2. Реакция агглютинации (РА).

Для постановки реакции агглютинации необходимо иметь культуры Y. pseudotuberculosis I, II, III, IV, V сероваров и Y. enterocolitica наиболее распространенных сероваров (03; 09; 05,27; 08) и другие, выделенные от больных на данной территории, обладающие типичными для указанных видов биологическими свойствами. Эталонные культуры можно получить в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва, Сивцев Вражек, д. 41) или его филиале (г. Саратов, ул. Университетская, д. 46). В качестве антигена используют живые культуры в S-форме или приготовленные из них формалинизированные препараты. Учитывая нестандартность используемых антигенов, каждый опыт необходимо сопровождать контролем с заведомо положительной сывороткой с известным титром.

Антиген из живых культур представляет собой взвесь иерсиний, полученную путем смыва 2-суточной культуры, выращенной на агаре Хоттингера или МПА при температуре 24 - 26 °С.

Перед каждым приготовлением антигена для РА проверяют морфологические и культуральные свойства иерсиний. Для этого засевают микробные клетки в бульон (Хоттингера, мясопептонный) или 1 % пептонную воду и инкубируют в течение суток при температуре 24 - 26 °С. Полученную бульонную культуру пересевают на чашки с агаром, инкубируют при той же температуре 48 часов, просматривают под микроскопом и отбирают колонии в S-форме (круглые, с ровными краями, блестящие, с ярким голубоватым свечением). При наличии однородных гладких колоний их используют для приготовления антигенов.

Шероховатые колонии (R-форма) восстанавливают в S-форму пересевами, чередуя питательный бульон и агар до получения однородной популяции.

Далее из взвеси иерсиний, смытых с агара 0,85 % раствором хлорида натрия, готовят взвесь, содержащую 1 млрд. м.к. в 1 мл, что соответствует стандарту 10 ед. по ССО мутности бактериальных взвесей ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Антиген из живой культуры для РА используют однократно.

Возможно также применение в РА формализированного антигена. Для его получения приготовленную взвесь, содержащую 1 млрд. м.к. в 0,85 % растворе хлорида натрия с 5 % формалином, выдерживают 2 суток при температуре 24 - 26 °С. Затем ее отмывают от формалина 0,85 % раствором хлорида натрия в соотношении 1 часть взвеси и 10 частей раствора с помощью центрифугирования при 3000 об./мин., 40 мин. 3-кратно. Полученный антиген хранят при температуре 5 - 8 °С и перед постановкой РА стандартизируют до 1 млрд. м.к. Формализированный антиген может быть использован в течение месяца.

При постановке РА сыворотку разводят 0,85 % раствором хлорида натрия 1:10, затем последовательно двукратно до разведения не менее 1:320 в объеме 0,5 мл. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл антигена (живая культура или формализированная), содержащего 1 млрд. м.к. 1 мл. Одновременно проводят контрольные реакции: 1) 0,5 мл антигена вносят в 0,5 мл 0,85 % раствора хлорида натрия (контроль антигена); 2) 0,5 мл исследуемой сыворотки, разведенной 1:10, вносят в 0,5 мл 0,85 % раствора хлорида натрия (контроль сыворотки). Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, выдерживают 3 часа при температуре 37 °С, а затем 16 - 18 часов - при температуре 24 - 26 °С.

Учет результатов производят по 4-крестовой системе с использованием вогнутого зеркала или агглютиноскопа.

++++ - Полная агглютинация, жидкость прозрачная, осадок на дне пробирки, рыхлый.

+++ - Полная агглютинация, жидкость прозрачная, осадок на дне, мелкие хлопья.

++ - Агглютинация неполная, жидкость прозрачная неполностью, на дне осадок.

+ - Частичная агглютинация, жидкость мутная, осадок небольшой в виде пуговки, косичкой смывается при встряхивании.

Реакция оценивается как положительная при титре не ниже чем 1:160. Агглютинация на 2 и 1 крест не учитывается как положительная.

4.5. Обнаружение антигенов

В последнее десятилетие в диагностическую практику широко внедряются иммунологические методы исследования, обладающие высокой чувствительностью и строгой специфичностью. К наиболее перспективным относят реакции: коагглютинации (РКА), иммуноферментный анализ (ИФА), непрямая иммунофлуоресценция (РНИФ).

Они выявляют антиген (возбудитель) в слюне, моче, копрофильтратах, крови больных, органах мелких млекопитающих и сельскохозяйственных животных, в смывах из объектов внешней среды в очагах псевдотуберкулеза. Из перечисленных методов в настоящее время внедряются в практику ИФА для выявления Y. pseudotuberculosis и РНИФ для обнаружения Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

4.5.1. Иммуноферментный анализ (ИФА).

ИФА предназначен для обнаружения псевдотуберкулезного антигена в биологических субстратах (в испражнениях больных, органах мелких млекопитающих, смывах с объектов внешней среды).

Выявление антигенов проводится с помощью специфических антител, меченных пероксидазой в «сэндвич» варианте иммуноферментного анализа. Методика постановки и учета результатов ИФА приведена в наставлении по применению тест-системы.

4.5.2. Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

РНИФ может быть применена как в клинической, так и в противоэпидемической практике (табл. 6) для обнаружения Y. pseudotuberculosis I - V сероваров и Y. enterocolitica наиболее распространенных сероваров.

Таблица 6

Применение реакции непрямой иммунофлуоресценции

Оборудование и ингредиенты

Люминесцентный микроскоп (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Д, ЛЮМАМ)

Термостат с температурой 37 °С

Холодильник

Предметные стекла

Чашки Петри

Батарейные стаканы для промывания мазков

Дистиллированная вода 0,85 % раствор хлорида натрия

Сыворотки к Y. pseudotuberculosis: поливалентная (объединяет 5 сероваров) и моновалентная (к I и III сероварам) содержат специфические антитела в рабочем разведении 1:160.

Сыворотки Y. enterocolitica: моновалентные к наиболее распространенным сероварам (03; 04,32; 05; 05,27; 07,8; 08; 09; 013,7) содержат специфические антитела в рабочем разведении 1:160. Для удобства применения их соединяют в следующей последовательности: сыворотки 03; 04,32; 09 - I группа и сыворотки 05; 05,27; 07,8; 013,7 - II группа.

Сухой бычий альбумин, меченный родамином

Ацетон для фиксации мазков

Фосфатно-буферный раствор (pH 7,2 - 7,4) для промывания препаратов

Нефлуоресцирующее иммерсионное масло или диметилфталат

ФБР для обогащения исследуемого материала.

Подготовка ингредиентов и материала для РНИФ

В ампулы, содержащие сухие сыворотки, добавляют дистиллированную воду в объеме 1 мл. Регидратируют 3 мин. Затем их разводят 1:5 или 1:10 (в соответствие с титром, указанным на этикетке) 0,85 % раствором хлорида натрия. Регидратированные препараты хранят при температуре 5 - 8 °С в течение 1 месяца.

Постановка и учет РНИФ

На хорошо вымытые и обезжиренные смесью Никифорова предметные стекла наносят мазки или мазки-отпечатки ровным, тонким слоем. Из жидких материалов (взвеси, суспензии, эмульсии) их делают, нанося пипеткой или петлей каплю жидкости, которую расширяют до 7 - 8 мм в диаметре. На каждое предметное стекло со шлифованным краем наносят материал из 4 - 6 проб. Мазки хорошо высушивают на воздухе и фиксируют ацетоном в течение 20 мин. Приготовленные мазки хранят до использования при температуре 5 - 8 °С. Препараты необходимо беречь от увлажнения. Такие мазки пригодны для работы в течение месяца.

На мазки с испытуемым материалом наносят рабочее разведение поливалентной сыворотки к Y. pseudotuberculosis I - V сероваров и групповые к Y. enterocolitica и выдерживают 45 мин. во влажной камере при температуре 37 °С. Затем препараты следует промыть фосфатно-буферным раствором (pH 7,2 - 7,4) в течение 10 мин. и высушить на воздухе.

После высушивания на мазки наносят антивидовой люминесцирующий гамма-глобулин к иммуноглобулинам кролика в смеси с родамином в рабочем разведении (рабочее разведение указано на этикетке каждой ампулы). Мазки выдерживают во влажной камере при температуре 37 °С в течение 30 мин. Далее препараты следует промыть в двух порциях буфера в течение 10 мин. и высушить на воздухе. Высушенные мазки просматривают в люминесцентном микроскопе по общепринятой методике. В случае обнаружения единичных клеток флуоресцирующих иерсиний со специфическим свечением на +++ или ++++ креста готовят новые мазки и обрабатывают по указанной выше методике, используя моновалентные сыворотки к Y. pseudotuberculosis I и III сероваров и моновалентные к Y. enterocolitica для идентификации серологического варианта. Для контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную пробы; контроль - положительный - специфический антиген; контроль отрицательный - гетерологичный антиген.

Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе типа МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Д, ЛЮМАМ (объектив 90×1,3; окуляр 8×). Первичные светофильтры для МЛ-2 - ФС 1-4; СЗК = 7-2; ВС8 = 2; окулярный или запирающий = 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС 21-2; ФС - 1-6; окулярный зеленый, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатами изотиоцианата флуоресцина.

Просматривают не менее 20 полей зрения. Оценку результатов исследования проб осуществляют на основании морфологии и яркости флуоресценции иерсиний. Для этого используют условную систему обозначения крестами (таблица 7).

Таблица 7

Оценка результатов исследования проб

Таким образом, оценку результатов реакции непрямой иммунофлуоресценции для выявления и идентификации иерсиний осуществляют дважды: 1) первое исследование испытуемого материала проводят после нанесения на мазок поливалентной (I - V сероваров) псевдотуберкулезной сыворотки и групповых I и II к Y. enterocolitica; 2) второе - при наличии специфической флуоресценции (не менее чем на ++) с поливалентной к Y. pseudotuberculosis и групповыми (I и II), к Y. enterocolitica проводят с помощью моновалентных псевдотуберкулезных сывороток (I и III серовары) и к Y. enterocolitica сероваров 03; 04,32; 05; 05,27; 07,8; 08; 09; 013,7.

4.6. Приложения

Приложение 1

Фосфатно-буферный раствор (ФБР)

Раствор A - KH₂PO₄ - 9,08 г в 1,0 л дистиллированной воды.

Раствор Б - NaH₂POA₄×2H₂ - 11 87 г в 1 л дистиллированной воды pH 7,6 - 7,8.

Приготовление:

150 мл раствора А соединить с 850 мл раствора Б. Разлить по 5 мл в пробирки, стерилизовать при 1 атм. в течение 1 часа.

Приложение 2

Буферно-казеиново-дрожжевая среда (БКД)

Состав: гидролизат казеина средней степени расщепления - 2,0 г (Дагестанский НИИ питательных сред) экстракт пекарских дрожжей - 5,0 мл фосфатно-буферный раствор pH 7,6 - 7,8 - до общего объема 1 л.

Приготовление:

Экстракт пекарских дрожжей: к 500 г дрожжей, предварительно размельченных до гомогенной массы в фарфоровой ступке в малом объеме дистиллированной воды, добавить до 1 л дистиллята. Взвесь слить в колбу и кипятить в течение 60 мин. на медленном огне при помешивании. Взвесь охладить при 5 °С в течение 16 - 18 час. Затем надосадочную жидкость слить и профильтровать через широкопористый бумажный фильтр. Приготовленный дрожжевой экстракт разлить во флаконы, простерилизовать под давлением 0,5 атм. 30 мин.; хранить при температуре 5 - 8 °С в течение 12 месяцев.

К 0,5 л фосфатно-буферного раствора добавить 2,0 г гидролизата казеина (предварительно подготовленного согласно наставлению, указанному на этикетке) и 5,0 мл экстракта дрожжей. Смешать встряхиванием, добавить фосфатно-буферный раствор до общего объема 1 л и проверить pH готовой среды (должен быть 7,6 - 7,8). Далее смесь разлить в пробирки по 5,0 мл и автоклавировать под давлением 0,5 атм. в течение 20 минут. Среду можно использовать в течение 7 - 10 суток при хранении в условиях холодильника.

Приложение 3

Дифференциально-диагностическая среда Серова

Состав:

Глюкоза 0,5 г

Мочевина 0,25 г

Молибденовокислый аммоний 0,1 г

Сода безводная 0,1 г

30 % водный раствор сухой желчи 2,0 мл

1,6 % водный раствор конго-рот 0,8 мл

1 % водный раствор генцианвиолета 0,1 мл

Сухой агар 3,5 г

Дистиллированная вода 100,0 мл

Приготовление:

Конго-рот и генцианвиолет растворить в горячей дистиллированной воде. Раствор сухой желчи готовить в стерильной воде.

Указанные ингредиенты вносить в дистиллированную воду, нагревать и кипятить 5 мин. при помешивании, разлить в чашки Петри. Цвет среды темно-вишневый, pH - 7,2 - 7,4. Среду можно хранить в течение недели в холодильнике.

Приложение 4

Среда с индикатором бромтимоловым синим (БТС)

Состав:

Желчь медицинская 20 мл

Раствор NaOH 4 % 10 - 12 капель

Сухой питательный агар 35 г

Глюкоза 10 г

Мочевина 5 г

1,6 % спиртовой раствор с индикатором бромтимоловым синим 8 мл

Дистиллированная вода 1 л.

Приготовление:

К 1 л воды добавить сухой питательный агар, медицинскую желчь и автоклавировать 20 мин. при 0,5 атм. После охлаждения до 80 °С добавить глюкозу, мочевину, индикатор бромтимоловый синий, смешать и сразу разлить в стерильные чашки Петри. pH - 7,8. Хранить среду при температуре 5 - 8 °С в течение недели.

Приложение 5

Универсальный скошенный столбик

Состав:

Агар сухой питательный 3,5 г

Лактоза 0,4 г

Глюкоза 0,08 г

Крахмал растворимый 0,05 г

Сахароза 1,5 г

Мочевина 0,25 г

Уксуснокислый свинец 0,03 - 0,04 г

Тиосульфат натрия 0,03 г

Цистин 0,003 г

1 % феноловокрасный водорастворимый 2,5 мл

Дистиллированная вода 100 мл.

Приготовление:

Ингредиенты вносить в любом порядке. Количество питательного агара, вносимого в среду, зависит от его серии. Если на этикетке указано, что на 100 мл воды его надо брать 5 г, то в среду добавляют 3,5 г, если на этикетке имеется рекомендация 3,5 г на 100 мл, то добавляют 2,5 г. Среду кипятить в течение 10 - 15 минут, разливать в стерильные пробирки по 5 мл, автоклавировать при 0,5 атм. 15 мин., после чего скашивать. Цвет среды абрикосовый.

Приложение 6

Щелочной раствор

Состав:

раствор А -

Калия гидроокись 400 г

Вода дистиллированная до 1 л

раствор В -

Натрия хлорид 5,0 г

Вода дистиллированная до 1 л.

Приготовление:

Оба раствора приготовить отдельно и хранить в условиях холодильника. Перед началом работы готовить рабочий раствор: смешивая 9,7 мл раствора В и 0,13 мл раствора А.

Щелочной раствор должен быть прозрачным.

Приложение 7

Среда Кларка для аутоагглютинации

Состав:

Двузамещенный фосфат калия 5,0 г

Пептон 7,0 г

Глюкоза 5,0 г

Вода до 1 л.

Приготовление:

Пептон и фосфат калия растворить в воде и кипятить 2 - 5 мин. После удаления осадка среду стерилизовать при 120 °С в течение 20 мин., асептично добавить стерильный раствор глюкозы и разлить по 3 - 4 мл в пробирки.

Приложение 8

Среда для определения кальцийзависимости
(кальцийдефицитный агар)

Состав:

Агар АГВ Дагестанского НИИ питательных сред - 100 мл

Щавелевокислый натрий 8 мл

Хлорид магния 4 мл.

Приготовление:

На 100 мл расплавленной (около 50 °С) среды АГВ внести - 8 мл 0,25 М стерильного раствора щавелевокислого натрия, тщательно перемешать; 4 мл 0,5 М стерильного раствора хлорида магния (указанная последовательность внесения солей обязательна). После перемешивания готовую среду разлить по 16 - 20 мл в чашки Петри, которые использовать после застывания и подсушивания агара. Хранить чашки можно в течение 1 - 2 недель в холодильнике.

Приложение 9

Среда для определения морфологии колоний при различной температуре

Использовать агар АГВ Дагестанского НИИ питательных сред, который готовить согласно прилагаемой инструкции, стерилизовать автоклавированием; по 20 мл разлить в стандартные чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, использовать после застывания и подсушивания агара.