4.1. Методы контроля. Химические факторы

Методические рекомендации
по экспресс-определению микотоксинов в зерновых культурах,
кормах и орехах с помощью тест-систем "RIDASCREEN FAST",
производства фирмы R-Biopharm AG, Германия

(утв. Министерством здравоохранения РФ 30 ноября 2004 г. № 17фц/3737)

Вводится впервые

Настоящие методические рекомендации устанавливают методику экспресс-определения содержания следующих микотоксинов: зеараленона, Т-2-токсина, суммы афлатоксинов B₁, B₂, G₁, G₂ в зерновых культурах, комбикормах и орехах методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Диапазоны определяемых концентраций микотоксинов приведены в таблице:

____________

^* - диапазон определяемых концентраций при навеске образца 5 г.

1. Общие положения

Микотоксинами называют группу высокотоксичных канцерогенных веществ, образующихся в результате жизнедеятельности плесневых грибов Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus и Fusarium. Так, например афлатоксин B₁, а также афлатоксины B₂, G₁, G₂ часто могут быть обнаружены в зерновых культурах, кукурузе, хлопковом семени и орехах. Продовольственное сырье довольно часто бывает загрязнено Т-2 токсином, однако распространенность продуцентов Т-2 токсина и уровень загрязнения сильно зависит от региональной специфики. Т-2 токсин обладает цитотоксичными и иммунодепрессивными свойствами и является серьезным фактором риска для здоровья сельскохозяйственных животных и человека. Зеараленон, будучи "растительным гормоном", обладающим эстрогенными свойствами, вызывает нарушения репродуктивной функции животных, в том числе - свиней, лошадей, крупного и мелкого рогатого скота, с клиническими признаками гиперэстрогенизма, наиболее выраженного у свиней. С продуктами растительного происхождения зеараленон может попадать также и в организм человека.

В Российской Федерации СанПиН 2.3.2.1078-02 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" устанавливает предельно допустимые концентрации зеараленона и Т-2 токсина - 0,1 - 1,0 мг/кг в зерновых культурах и кормах. Сумма афлатоксинов B₁, B₂, G₁, G₂ в Российской Федерации не нормируется.

В последнее время в целях скрининга зарубежом в рутинной лабораторной практике широко применяется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Наборы RIDASCREEN FAST представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускаются серийно и предназначены для экспресс-определения микотоксинов в зерновых культурах, комбикормах и орехах.

2. Метод измерений

Принцип работы тест-систем RIDASCREEN FAST основан на методе прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован антителами "захвата", специфичными к антителам к микотоксинам.

Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые и стандартные образцы, препарат, содержащий антитела к микотоксинам и препарат, содержащий коньюгат микотоксинов с ферментом последовательно дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы микотоксинов и молекулы коньюгата, конкурируя между собой, связываются антителами к микотоксинам. В то же самое время, при инкубации, происходит иммуносорбция этих антител на поверхность лунок планшета за счет их взаимодействия с антителами "захвата" на поверхности.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы коньюгата. После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген. В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития данной цветной реакции, в результате которой хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации микотоксинов в исследуемых образцах.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений массовой концентрации микотоксинов применяются следующие средства измерения, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

3.1. Средства измерений

3.2. Реактивы

Тест-система RIDASCREEN FAST для иммуноферментного анализа в стандартной комплектации, включая:

Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный антителами "захвата";

Комплект стандартных растворов микотоксинов в водном растворе метанола, объемом 1,3 см³, со следующими концентрациями:

Антитела к микотоксинам (черная крышка), объемом 3 см³;

Коньюгат микотоксинов с пероксидазой (красная крышка), объемом 3 см³;

Субстрат/хромоген (белая крышка) подкрашенный раствор объемом 6 см³;

Стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 N раствор серной к-ты, объемом 6 см³;

Инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках;

Логарифмическую бумагу;

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Мельница для размола сыпучих продуктов

Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 50 (100) см³ типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91

Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками

Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336

Фильтровальная бумага "красная лента"

Наконечники для автоматических пипеток;

Ванночки для реагентов;

Листовая фильтровальная бумага;

Разовые резиновые перчатки;

Тара для лабораторных отходов.

Замечания по использованию и хранению тест-систем RIDASCREEN FAST:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии.

Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2 - 8 °С. Не замораживайте набор.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания розового раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.3. Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные микотоксины. При работе используйте разовые резиновые перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.

4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5 % растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5 % по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной микотоксинами, рекомендуется использовать 10 % раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до рН 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистилированной водой.

4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

4.6. Метанол относится к легковоспламеняющимся растворителям. Емкость с метанолом должна быть всегда плотно закрыта. Храните емкость с метанолом вдали от источников тепла, искр и открытого пламени. Не курите во время работы. Метанол токсичен при попадании внутрь! Пары метанола токсичны! Не вдыхайте пары метанола! Избегайте контакта метанола с кожей.

5. Требования к квалификации персонала

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

6. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

7. Подготовка к проведению анализа

7.1. Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.

7.2. Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 - 25 °С). Это займет около 1 часа.

Стандартные растворы. Стандартные растворы микотоксинов поставляются готовыми для использования. Величина концентрации микотоксинов, нанесенная на флаконы с растворами дана с учетом фактора разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения может быть получен непосредственно по калибровочной кривой.

Приготовление 70 %-ного раствора метанола. В мерную колбу на 100 см³ помещают 70 см³ метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8 °С.

7.3. Пробоподготовка

7.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы для размола сыпучих продуктов.

7.2. Взвешивают 5 г размолотой пробы, переносят в колбу с притертой пробкой, приливают 25 см³ 70 %-го водного раствора метанола.

7.3. Тщательно встряхивают колбу в течение трех минут (рекомендуется использовать аппарат для встряхивания).

7.4. Фильтруют раствор через фильтровальную бумагу типа "красная лента".

7.5. Смешивают в пробирке 1 см³ фильтрата и 1 см³ дистиллированной воды.

7.6. Для анализа используют 50 мкл раствора.

8. Выполнение измерений

8.1. Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCRIN FAST:

- Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8 °С, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;

- Иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;

- В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;

- Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;

- На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется ставить планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

8.2. Проведение измерений

8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок - по одной лунке на каждую пробу. Поместите лунки в рамку.

8.2.2. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °С.

8.2.3. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу как это показано на рисунке (Ст. - стандарты, Пр. - пробы):

8.2.4. Пометьте лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.

8.2.5. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

8.2.6. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

8.2.7. Добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие лунки. При каждом дозировании используйте новый наконечник дозатора.

8.2.8. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл препарата коньюгата в каждую лунку, согласно рисунку на разграфленной бумаге (см. п. 8.2.3).

8.2.9. Таким же образом добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител.

8.2.10. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию в темном месте при комнатной температуре в течение 10 мин (-1 мин). Не встряхивайте планшет во время инкубации!

8.2.11. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующей добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.12. При помощи многоканальной пипетки или специальной промывалки, наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

8.2.13. Как можно быстрее добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата (белая крышка) в каждую лунку (лучше использовать многоканальную пипетку).

8.2.14. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 5 минут (+0,5 мин) в темноте. Не встряхивайте планшет во время инкубации!

8.2.15. Быстро добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента (желтая крышка) и хорошо перемешайте (лучше также использовать многоканальную пипетку).

8.2.16. В течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

9. Обработка результатов измерений

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

Но величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации микотоксинов в мкг/кг (ppb) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат:

(Для Т-2 токсина и зеараленона)

(Для суммы афлатоксинов)

Концентрация микотоксинов в исследуемых растворах в мкг/кг (ppb) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Положительные результаты количественного определения концентрации микотоксинов следует подтверждать с помощью хроматографических методов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, РИДА^® Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.

СОДЕРЖАНИЕ