Методические указания по лабораторной диагностике
пастереллезов животных и птиц

(утв. Главным управлением ветеринарии от 20 августа 1992 г. № 22-7/82)

1. Общие положения

1.1. Пастереллезы - различные по локализации и характеру течения инфекционные болезни сельскохозяйственных, домашних и диких животных, птиц и человека, вызываемые бактериями рода Pasteriolla который включает в себя шесть видов: P.multocida, P.haemolytica, P.ureae, P.pneumotropica, P.aerogenes, P.gallinarum.

1.2. Ведущее этиологическое значение в инфекционной патологии животных и птиц принадлежит двум видам: P.muluocide, P.haemolytice.

P.muluocida является возбудителем геморрагической септицемии животных, холеры птиц, а также легочных пастереллезов, осложняющих респираторные инфекции вирусной и микоплазменной этиологии.

P.haemoytica вызывает у крупного рогатого скота и овец всех возрастов пневмонии, а также септицемию новорожденных ягнят.

Кроме перечисленных заболеваний эти два вида могут выделяться у коров и свиноматок при абортах, у овец и коров - при маститах, у телят и ягнят - при артритах и других локальных патологических процессах.

1.3. Краткие сведения о других видах пастерелл.

P.pneumotropica является возбудителем энзоотического заболевания мышей, кроликов и других лабораторных грызунов, которое проявляется поражением органов дыхания и образованием абсцессов.

P.ureae часто выделяют от человека при хроническом атрофическом насморке.

P.gallinarum встречается как комменсал верхних дыхательных путей птиц и иногда крупного и мелкого рогатого скота; имеет низкую вирулентность и чаще ассоциирует с хроническими респираторными инфекциями птиц.

P.aerogenes является постоянным обитателем кишечного тракта свиней.

1.4. Диагноз на пастереллезы устанавливают на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторного исследования.

1.5. Лабораторная диагностика пастереллезов включает микроскопию мазков и отпечатков, выделение культур пастерелл и их идентификацию и при необходимости постановку биопроб.

1.6. Для исследования в лабораторию направляют 2 - 3 трупа мелких животных, от крупных животных - сердце с перевязанными сосудами, части селезенки, печени, почек, экссудат из грудной полости и трубчатую кость. При поражении легких берут также их кусочки (5×5 см) на границе нормального и измененного участков, миндалины, бронхиальные, средостенные и заглоточные лимфатические узлы.

Патологический материал берут от павших (не позднее 3 - 5 ч после гибели) или убитых животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами.

Для диагностики пастереллеза у птиц в лабораторию направляют, кроме свежих трупов, 5 - 6 живых птиц с явными признаками болезни. Больную птицу убивают в лаборатории и делают высевы из костного мозга, сердца, печени и селезенки.

1.7. Взятие и доставку материала осуществляют в соответствии с действующими Правилами взятия патологического материала, крови, кормов, и пересылки их для лабораторного исследования.

2. Выделение и идентификация культур

2.1. посевы из патологического материала, перечисленного в п. 1.6, делают в МПБ и на МПА или бульон и агар Хоттингера рН 7,2 - 7,4 с добавлением 10 % нормальной сыворотки крови лошади (см. приложение пп. 1 - 4) или 5 - 10 % аминопептида-2.

2.1.1. Посев в пробирки с жидкими и твердыми питательными средами проводят пастеровской пипеткой. Пробирки с посевами инкубируют при 37 - 38° в течение 20 - 48 часов.

2.1.2. Одновременно с посевами из каждого органа делают мазки-отпечатки, фиксируют 10 - 15 мин смесью равных объемов этилового спирта и эфира, окрашивают по Леффлеру или Романовскому-Гимза и микроскопируют. В мазках из патологического материала пастереллы выглядят овоиды или короткие палочки с закругленными концами и заметной биполярностью, вокруг которых может быть видна прозрачная капсула.

2.2. В жидких питательных средах рост пастерелл сопровождается сначала слабым помутнением, затем через 24 - 36 часов возможно просветление среды и выпадение на дно пробирки осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички.

На сывороточном агаре или агаре с аминопептидом-2 пастереллы растут в виде прозрачных, средней (диаметром до 3 мм), округлых с ровными краями колоний слизистой консистенции, серого цвета.

На простых питательных средах без добавления сыворотки крови пастереллы растут не всегда удовлетворительно.

У выделенных культур изучают культуральные, тинкториальные и морфологические свойства. В мазках из культур при окраске по Граму пастереллы имеют вид грамотрицательных овоидов или коккобактерий, расположенных одиночно и попарно.

Идентификацию выделенных культур проводят по ферментативным свойствам и подвижности.

2.3.1. Суточную агаровую культуру высеевают в среды Гисса с глюкозой, маннитам, сахарозой, маннозой, в ПМА, молоко, желатин, на кровяной сывороточной МПА или агар Хоттингера (см. приложение п. 5), в МПБ с 1 % нитрата калия, в среду с мочевиной (см. приложение п. 6).

2.3.2. Для определения редукции нитратов исследуемые культуры засевают в МПБ с 1 % нитрата калия и выращиванием в течение 48 - 72 ч.

Затем в пробирку добавляют 1 см³ 2 %-ного водного раствора крахмала, 1 см³ 1 %-ного раствора йодистого калия и 1 - 2 капли 5 %-ного водного раствора серной кислоты и взбалтывают.

При положительной реакции среда приобретает окраску от темно-синего до коричневого цвета; при отрицательной - цвет среды желтый или слабо синий.

2.3.3. Индол выявляют с помощью индикаторных бумажек или по методу Легаль-Вейла. Индикаторные бумажки готовят из полосок фильтровальной бумаги длиной 10 - 12 см, пропитывая их горячей щавелевой кислотой, высушивают в термостате и хранят в банке с притертой пробкой.

С целью выявления индола в пробирку с МПБ после засева культуры под ватную пробку помещают полоску индикаторной бумажки с таким расчетом, чтобы нижний ее конец не касался среды, и инкубируют при 37 °С 24 - 72 ч. При выделении индола нижняя часть бумажки приобретает розовую окраску.

Метод Легаль-Вейла. В пробирку с суточной бульонной культурой пастерелл вносят 4 - 5 капель 5 %-ного водного раствора нитропруссида натрия, перемешивают и добавляют вначале такой же объем 40 %-ного водного раствора N₂OH, а спустя 1 - 2 мин 4 - 5 капель ледяной уксусной кислоты. При наличие индола бульонная культура приобретает сине-зеленую окраску.

2.3.4. Для определения уреазы в пробирку, содержащую среду с мочевиной, закапывают 2 - 3 капли 24-часовой изучаемой бульонной культуры. Посевы культивируют 20 - 24 ч. при 37 °С. При наличии фермента уреазы происходит покраснение среды.

2.3.5. Все виды пастерелл неподвижны, не свертывают молоко, не разжижают желатин, редуцируют нитраты, ферментируют с образованием кислоты без выделения глаза глюкозу, маннозу, сахарозу.

P.agrogenes в отличие от других видов ферментирует углеводы с выделением газа.

На кровяном сывороточном МПА или агаре Хоттингера P.haemolytica образует колонии с отчетливой зоной гемолиза, которая лучше просматривается после снятия колонии со среды. Остальные виды пастерелл гемолиза не вызывает.

2.3.6. Основные дифференцирующие признаки видов рода пастерелла представлены в таблице.

Условные обозначения:

«+» - результат положительный

«-» - результат отрицательный

2.4. Дифференциация серовариантов Р.

2.4.1. Изучаемую 18-часовую бульонную культуру бактериологической петлей высевают на чашку Петри со свежеприготовленным 1,5 %-ным агаром Хоттингера. Посев проводят, не отрывая петли от поверхности агара, параллельными штрихами на расстоянии 7 - 10 мм один от другого.

Затем бактериологической петлей одним штрихом по диаметру чашки, перпендикулярно нанесенным штрихам, высевают суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus (культура должна обладать хорошей гемолитической активностью, что определяют высевом ее на кровяной сывороточный МПА).

Чашки с посевами инкубируют при 37 °С и через 18 - 24 час учитывают результаты.

Штаммы, образующие вблизи (до 5 мм) от линии роста стафилококка более мелкие колонии, чем на удалении от этой линии, относятся к сероварианту А. Кроме того колонии P.multocida сероварианта А, растущие вблизи стафилококка, при просмотре в проходящем свете имеют окраску в отличие от остальных флуоресцирующих колоний. Размер колоний серовариантов В и Д в данном тесте не изменяются.

2.4.2. Исследуемую бульонную культуру (5 - 6 см³) центрифугируют при 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспензируют в оставшейся в пробирке надосадочной жидкости до получения гомогенной суспензии. К полученной суспензии приливают 0,5 см³ водного свежеприготовленного раствора акрифлавина 1:1000 и тщательно перемешивают.

Штаммы, относящиеся к сероварианту Д, в течении 10 - 15 мин после добавления раствора акрифлавина образуют крупнохлопчатый неразбивающийся при встряхивании флоккулят. Кроме штаммов P.multocida сероварианта Д, флоккулят могут образовывать диссоциированные культуры других серовариантов, но в этом случае флоккулят мелкохлопчатый и легко разбивается при встряхивании.

Сероварианты Ф и В дают отрицательную реакцию флоккуляции.

2.4.3. Штаммы P.multocida, не обладающие указанными выше свойствами, относятся к сероварианту В.

3. Биологическое исследование

3.1. Биологическое исследование проводят для определения патогенности выделенной культуры пастерелл и при необходимости с целью обнаружения возбудителя в патологическом материале.

3.2. Патогенность культур определяют на белых мышах массой 16 - 18 °С этой целью двум белым мышам вводят подкожно по 0,2 см³ 18 - 24 - часовой бульонной культуры.

Вирулентные штаммы P. multocida, относящиеся в основном к сероварианту В и являющиеся возбудителями геморрагической септицемии, вызывают гибель зараженных белых мышей в течении 24 - 72 час; слабовирулентные штаммы серовариантов А и Д, участвующие в развитии пневмоний - через более продолжительный срок (до 7 сут.).

P.haemolytica может вызвать гибель белых мышей только при внутрибрюшинном заражении. Остальные виды пастерелл, как правило, для лабораторных животных непатогенны.

3.3. Патогенность культур, выделенных от птиц, проверяют на белых мышах или цыплятах. Суточную бульонную культуру вводят двум белым мышам внутрибрюшинно по 0,2 см³ или двум цыплятам 90 - 120 - дневного возраста внутримышечно по 1,0 см³.

3.4. Для обнаружения возбудителя пастереллеза в патологическом материале суспензий из органов (см. п. 1.6) заражают двух белых мышей подкожно в дозе 0,2 см³. При этом надо учитывать, что не все виды пастерелл, играющие роль в патологии сельскохозяйственных животных, вызывают гибель зараженных белых мышей.

3.5. Культуру считают патогенной, а биопробу положительной при гибели через 24 - 72 ч хотя бы одного из зараженных животных и выделении от него культуры пастерелл.

3.6. Срок наблюдения за зараженными животными - 7 сут.

4. Диагноз считают установленным в случае:

- выделение из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя пастереллеза, и установления ее патогенности на лабораторных животных;

- гибели хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных исходным материалом и выделения из его органов культуры со свойствами, характерными для возбудителя пастереллеза, если даже в посевах из исходного материала культуры возбудителя не выделено.

С утверждением настоящих методических указаний утрачивают силу Наставления по лабораторной диагностике пастереллеза птиц, рекомендованные Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 20.05.75 г.

Приложение

К Методическим указаниям по
Лабораторной диагностике
Пастереллезов животных и птиц.

Рецепты приготовления питательных сред

1. Сывороточный мясо-пептонный бульон.

В качестве основы используют мясо-пептонный бульон рН 7,2 - 7,4, к которому, соблюдая правила асептики, добавляют 10 % стерильной без консерванта сыворотки крови лошади.

2. Сывороточный мясо-пептонный агар.

В качестве основы используют 2,0 - 2,5 %-ный мясо-пептонный агар, рН 7,2 - 7,4 расплавленный и охлажденный до 45 - 50 °С, к которому, соблюдая правила асептики, 10 % стерильной сыворотки крови лошади без консерванта. Смесь тщательно перемешивают, следя за тем, чтобы не образовывалась пена, и разливают в чашки Петри.

3. Сывороточный бульон Хоттингера.

Для приготовления бульона основой перевар Хоттингера разводят дистиллированной водой до содержания в нем 180 - 200 мг % аминного азота, добавляют 0,5 % хлорида натрия, 0,1 % двузамещенного фосфата калия (K₂НРО₄), устанавливают рН 7,2 - 7,4 и кипятят 15 - 20 мин.

Приготовленный таким образом бульон фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 120 °С в течение 20 - 30 мин. Перед употреблением к бульону Хоттингера добавляют 10 % неинактивированной стерильной сыворотки крови лошади.

4. Сывороточный агар Хоттингера.

К бульону Хоттингера добавляют 2,0 - 2,5 % мелконарезанного агар-агара, после его набухания ставят на огонь и кипятят до полного растворения агара, постоянно помешивая во избежания пригорания.

По окончании кипячения следует восстановить объем среды добавлением горячей дистиллированной воды. После установления нужного рН агар кипятят дают отстоятся в теплом месте, чего фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Осадок на фильтр не выливают. Разливают во флаконы и стерилизуют 30 мин при 1 атм.

Перед употреблением к расплавленному и охлажденному до 40 - 45 °С агару добавляют 10 % стерильной сыворотки крови лошади и разливают в чашки Петри.

5. Кровяные сывороточные МПА и агар Хоттингера.

Разливают определенное количество МПА и агара Хоттингера, охлаждают до 45 °С и прибавляют 5 % стерильной сыворотки крови лошади. После тщательного перемешивания добавляют 5 - 7 % дефибринированной стерильно взятой крови барана. Готовую среду разливают в чашки Петри и дают ей застыть. Слой питательной среды должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

6. Среда с мочевиной.

В 100 см³ дистиллированной воды растворяют: 1 г пептона, 5 гр хлорида натрия, 1 гр глюкозы, 2 гр однозамещенного фосфорнокислого калия (KНРО), 20 гр мочевины, добавляют 6 см³ 0,2 %-ного водного раствора фенолового красного и устанавливают рН 6,8 - 6,9. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин.

К 900 см³ дистиллированной воды добавляют 15 гр агар-агара и стерилизуют при 120 °С 30 мин. Охлаждают до 40 - 45 °С и смешивают со 100 см³ раствора упомянутого выше. Разливают в стерильные пробирки и скашивают. Цвет готовой среды желтовато-зеленый.

7. Среда для определения редукции нитратов.

В 1000 мл свежеприготовленного МПБ растворяют 2 гр нитрата калия (KNО₃), разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 1 атм. (120 °С) 15 мин. Готовая среда имеет желтоватый цвет.

СОДЕРЖАНИЕ