1.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКОЙ
ОЦЕНКИ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
С ПОМОЩЬЮ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО
ТЕСТА (С ПРИМЕНЕНИЕМ ИЗМЕРИТЕЛЬНОГО
ПРИБОРА-ЛЮМИНОМЕТРА ТИПА «БИОТОКС-10»)

Методические рекомендации
МР 1.1.0120-18

Москва, 2018

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» Роспотребнадзора.

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 13.02.2018.

3. МР 1.1.0120-18 введены взамен МР 1.1.0119-17 «Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора-люминометра типа «Биотокс-10»), утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22.12.2017.

СОДЕРЖАНИЕ

 

1.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКОЙ
ОЦЕНКИ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ С
ПОМОЩЬЮ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ТЕСТА
(С ПРИМЕНЕНИЕМ ИЗМЕРИТЕЛЬНОГО ПРИБОРА-ЛЮМИНОМЕТРА
ТИПА «БИОТОКС-Ю»)

Методические рекомендации
МР 1.1.0120-18

I. Общие положения

1.1. Методические рекомендации содержат описание метода токсикологического тестирования парфюмерно-косметической (далее - ПК) продукции с применением в качестве тест-объекта (биосенсора) реактива люминесцентных бактерий «Эколюм» или иных препаратов бактериальной люциферазы и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК продукции (далее - методические рекомендации, метод):

продукция косметическая гигиеническая моющая;

жиросодержащие косметические средства;

продукция косметическая жидкая, не содержащая спирт;

гели косметические;

продукция декоративной косметики на эмульсионной основе;

продукция косметическая для окрашивания, осветления, химической завивки и выпрямления волос;

продукция косметическая на носителях;

пилинги, скрабы, эксфолианты;

интимная косметика;

парфюмерная и косметическая спиртосодержащая продукция;

дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке и не в аэрозольной упаковке;

продукция декоративной косметики порошкообразная и компактная, тальк, присыпки, зубные порошки;

кремы косметические для ухода за кожей лица, тела, волосами, ногтями, губами, кожей вокруг глаз;

продукция декоративной косметики на жировосковой основе;

средства для маникюра и ухода за ногтями;

мыло туалетное твердое;

соли для ванн, сухие средства для ванн;

зубные пасты;

средства гигиены полости рта жидкие;

средства для домашнего отбеливания зубов;

косметическая продукция индивидуальной защиты кожи от воздействия вредных производственных факторов.

1.2. Методические рекомендации предназначены для оценки общетоксического действия вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК продукции.

Метод может быть применен для скрининговой оценки ПК продукции в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

1.3. Методические рекомендации предназначены для учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК продукции, контроль ее качества и оценки соответствия, а также для органов и организаций, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический надзор.

II. Описание метода

2.1. В качестве тест-объекта используются препараты «Эколюм» лиофилизированных люминесцентных бактерий или иных препараты бактериальной люциферазы. Метод основан на определении изменения интенсивности бактериальной биолюминесценции при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

2.2. Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора типа «Биотоке-10» интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК продукции по сравнению с раствором, не содержащей токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

При изучении токсикологических свойств ПК продукции и ее химических ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на высших животных.

Токсическое действие исследуемой пробы определяется по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30 мин (в экспрессном варианте - 5 мин) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности «Т».

2.3. Индекс токсичности «Т», равный отношению Т = 100×(I_о - I)/10, где I_o и I соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с бактериальным препаратом.

Метод допускает три пороговых уровня индекса токсичности:

1 уровень - допустимая степень токсичности образца индекс токсичности Т меньше 20;

2 уровень - образец токсичен индекс Т равен или больше 20 и меньше 50;

3 уровень - образец сильно токсичен индекс токсичности Т равен или более 50.

Основанием для выбора эталонных разведений различных видов ПКП с учетом допустимого интервала индекса токсичности послужила сравнительная оценка результатов исследования общей токсичности настоящим методом и кожно-раздражающего действия различных видов ПКП в эксперименте на лабораторных животных.

III. Оборудование, химическая посуда и реактивы

3.1. Измерительный прибор - люминометр типа «Биотоке-10» с набором кювет на 1,5 мл.

3.2. Лиофилизированная культура микроорганизмов «Эколюм» или иных препаратов бактериальной люциферазы.

3.3. Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1-2011, высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

3.4. pH-метр любой марки с набором электродов.

3.5. Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474.

3.6. Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от -18 до 4 °С.

3.7. Пробирки с притертыми пробками объемом 3 - 5 мл, ГОСТ 1770-74.

3.8. Дозаторы лабораторные по ГОСТ 28311. Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ 1770.

3.9. Воронки делительные на 100 мл, типа ВД-1-100.

3.10. Фильтры бумажные «синяя лента» или обеззоленные типа ФОБ, ТУ 6-09-1678.

3.11. Стаканчики для взвешивания диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148.

3.12. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

3.13. Кислота соляная, ГОСТ 3118.

3.14. Натрия гидроокись, ГОСТ 4328.

3.15. Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174.

3.16. Спирт этиловый, химически чистые, ТУ 6-091710.

3.17. Кислота серная, ГОСТ 4204.

3.18. Термометр, предметное стекло (технические характеристики). Допускается применение аналогичного оборудования и материалов с техническими и метрологическими характеристиками, а также реактивов по качеству не ниже указанных в пункте 3 методических рекомендаций.

При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.

IV. Проведение испытаний

4.1. Условия выполнения токсикологических испытаний.

При проведении испытаний в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

температура воздуха от +18 до 25 °С;

относительная влажность воздуха не более 80 %;

атмосферное давление (84 - 106) кПа [(630 - 800 мм рт. ст.)];

частота переменного тока 50 ± 1 Гц;

напряжение сети 220 ± 10 В.

4.2. Отбор проб проводится по ГОСТ 29188.0-2014.

4.3. Приготовление экстрактов из образцов ПК продукции:

4.3.1. Из поступивших на испытания образцов одного наименования (не менее двух единиц) составляют объединенную пробу. Опытные образцы готовят путем разбавления испытуемых образцов в модельной среде (дистиллированная вода).

В сосуд помещают необходимое количество пробы ПК продукции, заливают определенным объемом дистиллированной воды и выдерживают (настаивают) в термостате при температуре 37 °С определенное время (продолжительность экстракции).

Соотношение массы (объема) испытуемой продукции и объема модельной среды, а также продолжительность экстракции приведены в таблице 1.

После окончания экстракции полученные экстракты охлаждают до комнатной температуры и отделяют водную фазу фильтрацией или с помощью делительной воронки.

Испытуемые образцы продукции на носителях предварительно измельчают ножницами.

Испытуемые образцы ПК продукции, представляющей собой жиросодержащие средства, порошкообразные и компактные, эмульсии и суспензии, продукцию на носителях, требуют периодического перемешивания в течение времени экстракции.

Для продукции, применение которой согласно аннотации подразумевает смешивание перед применением нескольких компонентов (для окрашивания, осветления, мелирования волос, для химической завивки или распрямления волос, сухие косметические маски и другая аналогичная продукция), готовят испытуемые образцы в зависимости от полученной консистенции готовой композиции.

Средства для ухода за ногтями требуют предварительной подготовки. На предметное стекло (2 см × 2 см) ровным слоем наносят исследуемую навеску (1 г) образца и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания. Высушенную пробу переносят в сосуд с дистиллированной водой и готовят экстракт в соответствии с 4.3.1.

Таблица 1

Условия приготовления водных экстрактов
в зависимости от вида продукции

Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.

4.4. Подготовка прибора «Биотоке-10» и тест-объекта «Эколюм»:

4.4.1. Подготовка прибора «Биотоке-10».

Подготовку прибора «Биотоке-10» проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

4.4.2. Регидратация биосенсора «Эколюм».

4.4.2.1. Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом «Эколюм».

4.4.2.2. Добавить 10 мл дистиллированной воды, комнатной температуры для получения суспензии бактериального препарата. Рекомендуется использовать стерилизованную дистиллированную воду, а также несколько раз встряхнуть флакон с суспензией препарата.

Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

4.4.2.3. Выдержать суспензию в течение 30 мин.

4.4.3. Определение рабочей концентрации биосенсора «Эколюм».

4.4.3.1. Измерить фоновое значение прибора «Биотоке-10» (по инструкции к прибору, при счете 10 сек без кюветы) и записать это значение.

4.5. Проведение измерений:

4.5.1. Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (комнатная температура).

4.5.2. Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции. Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающим фоновое значение прибора в 25 - 250 раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

Если биосенсер стал меньше растворяться холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.

4.5.3. В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл дистиллированной воды. При приготовлении опытных образцов к 0,1 мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы ПК продукции различного разведения в соответствии с таблицей 1 методических рекомендаций. Температура дистиллированной воды и образцов должна быть одинаковой. Указать значение температуры.

Измерение токсикологических параметров проводят с помощью прибора «Биотоке-10» в стандартном варианте через 30 мин экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 мин.

4.5.4. Контроль погрешности метода токсикологического анализа.

Контроль качества оценки токсичности объектов окружающей среды проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному «эталонному» токсиканту цинку сернокислому 7-водного (ZnSO₄7H₂O). Расчет проводится по содержанию ионов цинка. Диапазон концентраций модельного токсиканта, при действии которого в течение 30 мин интенсивность биолюминесценции ингибируется на 50 %, составляет 0,6 - 1,5 мг/л.

Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.

Процедура определения диапазона реагирования тест-системы «Эколюм» на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего 4,4 мг/л цинка сернокислого при времени инкубации 30 мин с биосенсором. Должно происходить не менее чем 50 % ингибирование интенсивности

биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов.

4.6. Математическая обработка результатов измерений:

4.6.1. Результат токсикологического анализа в документах - индекс токсичности, предусматривающих его использование, представляется в виде:

где  - среднее арифметическое определений, s - среднеквадратичное отклонение, Р - уровень вероятности.

За результат анализа () принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс Токсичности Т вычисляется по формуле Т = 100×(I_контр - I_опыт)/I_контр, где I_контр и I_опыт соответственно интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.

Среднее квадратичное отклонение (σ) результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности вычисляется по формуле:

где x_i - i-й результат определений, n - число параллельных определений.

Среднее арифметическое  результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:

Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором «Биотоке-10» автоматически по команде оператора.

V. Оценка результатов испытаний

Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности «Т».

В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.

4.6.3. По величине индекса токсичности анализируемой пробы классифицируются на три группы в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2

Классификация токсичности проб

Если при оценке токсичности продукции по величине индекса токсичности получено значение индекса токсичности более 20, то вывод о токсикологической безопасности продукции должен быть сделан после испытаний продукции аналогичными альтернативными методами или методами in vivo.