Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение
концентрации Trichoderma asperellum
OPF-19 в воздухе рабочей зоны

Методические указания
МУК 4.2.3437-17

Москва 2017

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации
Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе рабочей зоны

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м³ воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Trichoderma
asperellum OPF-19 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны

Мицелиальный гриб Trichoderma asperellum OPF-19 является действующей субстанцией фунгицида «Оргамика Ф, Ж» (титр не менее 1×10⁸ КОЕ/мл).

Источником выделения штамма является поверхность корней томатов, выращенных в условиях открытого грунта в Высокогорском районе Республики Татарстан.

Штамм отличается наличием широкого спектра антагонистической активности по отношению к фитопатогенным грибам, является быстрорастущим как в условиях in vitro, так и в естественной среде. Штамм проявляет способность эффективно колонизировать поверхность корней растений.

Систематическое положение микроорганизма

Культурально-морфологические признаки. Растет на агаризованных средах (Мальц-агар, среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар, глюкозо-картофельный агар, среда Сабуро) при температуре 29 - 34 °С в течение 7 суток, pH 3,5 - 5,0.

После 72 часов роста на глюкозо-картофельном агаре при температуре 30 °С колония штамма Т. asperellum OPF-19 имеет максимальный диаметр 55 - 65 мм. Колонии образуют несколько концентрических колец, на поверхности которых заметно интенсивное спороношение.

В центральной части колония более темная, она раньше, чем периферия приобретает зеленую окраску. По мере удаления от центра формируется воздушный мицелий. При культивировании при температуре 25 °С в отсутствии света, конидии формируются через 35 - 45 часов. Диффузии пигмента в агар не происходит, у старых колоний присутствует слабый специфический запах.

При росте на агаризованной среде Сабуро в течение 5 суток при температуре 25 °С конидиальная зона сформирована конидиеносцами, сгруппированными в коремии и спородохии, имеющими вид многочисленных компактных подушечек диаметром до 2 мм, изначально белого цвета, с возрастом - зеленого. Подушечки образуются по всей поверхности колонии, обильно.

Конидиеносцы чаще формируются в подушечках и редко на воздушном мицелии, конидиеносцы симметричные, завершаются четырьмя фиалидами. Парные ответвления формируются ниже верхушки конидиеносца и располагаются под углом около 90° по отношению к основной оси. Первичные ветки по мере удаления от верхушки удлиняются, парные ответвления имеют одинаковую длину, на боковых ветвях первого порядка формируются неветвящиеся боковые ветви второго порядка. Ширина конидиеносца - 2,1 - 5,0 мкм.

Фиалиды образуются на концах ветвей первого и второго порядка, образуются скопления из 2 - 4 фиалид. Фиалиды прямые, колбовидные, немного расширенные в середине, длина - 5 - 10 мкм, ширина - 2,2 - 5,7 мкм. Интеркалярные фиалиды не формируются. Конидии имеют темно-зеленый цвет, форма - немного яйцевидная, часто ближе к шаровидной, диаметр - 3,5 - 4 мкм.

Штамм Trichoderma asperellum OPF-19 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным для теплокровных животных микроорганизмов.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны 50000 кл/м³.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Методы измерений

Метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений бактерий на среду Сабуро и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322-08.

6.2. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80 %.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления агаризованной среды Сабуро 62 г препарата размешивают в 1 дм³ воды, кипятят до полного растворения препарата и фильтруют через ватно-марлевый тампон. Стерилизуют среду в течение 15 мин при температуре (121 ± 1) °С. Для подавления роста посторонней микрофлоры в готовую и охлажденную до температуре (48 ± 2) °С среду добавляют по 100 мг бензилпенициллина и тетрациклина, после чего разливают в чашки Петри.

Среду хранят в герметично закрытой упаковке в помещении с относительной влажностью не более 60 % и температурой от 5 до 25 °С.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением № 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. «ГСП. Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96 %-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенки прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха стерильную среду Сабуро расплавляют, остужают до температуры (48 ± 2) °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостах при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 - 8) °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (27 ± 2) °С. Через 1 - 2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Trichoderma asperellum OPF-19 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток производят по формуле:

K - концентрация Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе, кл/м³;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.