Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование
Российской Федерации
Федеральная
служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
хлорантранилипрола в зеленой массе растений,
семенах сои и подсолнечника, в зерне кукурузы
и гороха и в растительных маслах методом
капиллярной газожидкостной хроматографии
Методические указания
МУК 4.1.3417-17
Москва 2017
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, О.И. Рыбакова, П.В. Рязанцев, Е.Н. Тестова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 февраля 2017 г.
4. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ Руководитель
Федеральной службы _______________________ А.Ю. Попова 14 февраля 2017 г. |
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
хлорантранилипрола в зеленой массе растений,
семенах сои и подсолнечника, в зерне кукурузы и
гороха и в растительных маслах методом
капиллярной газожидкостной хроматографии
Методические указания
МУК 4.1.3417-17
Свидетельство о метрологической аттестации МВИ № РОСС RU.0001.310430/0253.12.02.2016 от 12.02.2016 г.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств хлорантранилипрола в зеленой массе растений, семенах сои и подсолнечника, зерне кукурузы и гороха и в растительных маслах в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.
Методические указания носят рекомендательный характер.
Хлорантранилипрол
Название по ИЮПАК: 3-бром-4’-хлор-1-(3-хлор-2-пиридил)-2’-метил-6’-(метилкарбамоил) пиразол-5-карбоксанилид.
Эмпирическая формула: C18H14BrC2N5O2.
Молекулярная масса: 483,15.
Агрегатное состояние: мелкий порошок.
Цвет, запах: белого цвета без запаха.
Структурная формула:
Давление насыщенного пара 6,3×10-9 МПа при 25 °С.
Коэффициент распределения в системе октанол/вода при pH 7 и 20 °С: logP Kow = 2,76.
Растворимость в воде (мг/дм3): при pH 4 - 0,972; при pH 7 - 0,88; при pH 9 - 0,971.
Растворимость в органических растворителях (мг/дм3): в ацетоне - 3446, в метаноле - 1714, в этилацетате - 1144, в ацетонитриле - 710.
Хлорантранилипрол быстро разлагается на свету. Полураспад при фотолизе в стерильном буфере pH 7 составляет 0,37 дней при постоянном освещении. При естественном освещении фотолиз хлорантранилипрола медленнее, ДТ50 33 дня.
Вещество долго сохраняется в почве с ДТ50 в лаборатории 200 дней, в поле от 3 до 12 месяцев. Под покровом культур разрушается быстрее.
Стабилен при хранении в течение 2 лет.
Краткая токсикологическая характеристика. Ципросульфамид относится к мало опасным по острой оральной (ЛД50 для крыс более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД50 для крыс более 5000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 часа) более 5100 мг/дм3).
Область применения. Хлорантранилипрол - инсектицид кишечного действия, нарушающий баланс кальция в миофибриллах мускулов насекомых. Высокоэффективен против широкого спектра чешуекрылых, жесткокрылых, двукрылых вредителей (плодожорки, моли, листовертки, колорадский жук, калифорнийская щитовка, хлопковая совка, кукурузный стеблевой мотылек и др.).
Применяется для защиты кукурузы, сои и подсолнечника от вредителей с нормой расхода 0,02 - 0,03 кг д.в./га, с максимальной кратностью обработок 2. Применяется для борьбы с грызущими насекомыми с нормой расхода 0,01 - 0,06 кг д.в./га в зависимости от культуры в посадках картофеля, винограда, яблоневых садах.
В России установлены следующие гигиенические нормативы:
ДСД - 2,0 мг/кг массы тела человека;
ОДК в почве - 0,2 мг/кг;
ПДК в воде водоемов - 0,2 мг/дм3;
ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 1,5 мг/м3;
ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,007 мг/м3;
ВМДУ в продукции (мг/кг): зерно хлебных злаков - 0,02.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические параметры для хлорантранилипрола
Анализируемый объект |
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг |
Показатель точности (граница относительной погрешности), ±δ, %, Р = 0,95 |
Стандартное отклонение повторяемости, σr, % |
Предел повторяемости, r, % |
Предел воспроизводимости, R, % |
Зеленая масса растений (зеленая масса кукурузы) |
0,01 - 0,1 вкл. |
50 |
3 |
8 |
12 |
Зерно кукурузы |
0,01 - 0,1 вкл. |
50 |
5 |
13 |
19 |
Зерно гороха |
0,01 - 0,1 вкл. |
50 |
5 |
13 |
19 |
Семена сои |
0,01 - 0,1 вкл. |
50 |
5 |
14 |
20 |
Семена подсолнечника |
0,01 - 0,1 вкл. |
50 |
3 |
9 |
12 |
Растительные масла (масло кукурузы) |
0,01 - 0,1 вкл. |
50 |
6 |
16 |
22 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение,
доверительный
интервал среднего результата для хлорантранилипрола
Анализируемый объект |
Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 |
||||
предел обнаружения, мг/кг |
диапазон определяемых концентраций, мг/кг |
среднее значение определения, % |
стандартное отклонение, S,% |
доверительный интервал среднего результата, ±, % |
|
Зеленая масса растений (зеленая масса кукурузы) |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
80,36 |
3,52 |
1,33 |
Зерно кукурузы |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
79,81 |
4,63 |
1,73 |
Зерно гороха |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
75,15 |
3,72 |
1,31 |
Семена сои |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
75,63 |
4,82 |
1,71 |
Семена подсолнечника |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
79,89 |
4,68 |
1,75 |
Растительные масла (масло кукурузы) |
0,01 |
0,01 - 0,1 |
79,88 |
3,62 |
1,35 |
Метод основан на определении хлорантранилипрола методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием детектора по захвату электронов после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта путем перераспределения между двумя несмешивающимися фазами на колонках с окисью алюминия и концентрирующих патронах № 1, с последующим превращением хлорантранилипрола в его основной метаболит путем дериватизации.
Идентификация проводится по времени удерживания метаболита. Количественное определение - методом абсолютной калибровки, в пересчете на хлорантранилипрол.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.
Весы аналитические класса точности - специальный (I) с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г |
|
Весы лабораторные общего назначения класса точности - средний (III) с наибольшим пределом взвешивания до 400 г и пределом допустимой погрешности ±0,5 г |
|
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 см3 |
|
Микрошприц объемом 10 мм3 со шкалой деления 0,1 мм3 и погрешностью измерения вытесняемого объема ±1 % |
|
Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 |
|
рН-метр/милливольтметр с диапазоном измерения 0 - 14 pH; ±1999 мВ |
|
Хроматографическая система, включающая: |
|
- хроматограф газовый с детектором по захвату электронов (ЭЗД), снабженный приспособлениями для капиллярной колонки и с возможностью использования автосамплера на 16 проб с дополнительным лотком на 150 виал, с микрошприцем дня газовой хроматографии объемом до 10 мм3 для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему; |
|
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ |
|
Цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100 и 500 см3 |
Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
Хлорантранилипрол, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 98,0 % |
СAS 500008-45-7 |
Азот, осч |
|
Алюминий окись для хроматографии, ч |
ТУ 6-09-3916-75 |
Аммиак водный, 25 %, чда |
|
Ацетон, осч |
ТУ 6-09-3513-86 |
Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм |
ТУ 6-09-2167-84 |
Вода дистиллированная и (или) бидистиллированная (вода дистиллированная, перегнанная повторно в стеклянной емкости) |
|
Гелий, очищенный |
ТУ-51-940-80 |
n-Гексан, хч |
ТУ 6-09-3818-89 |
Кислота серная, концентрированная, хч |
|
Калий марганцовокислый, чда |
|
Кальций хлористый, ч |
ТУ 6-09-4711-81 |
Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции с гидрофобным сорбентом с размером частиц 63 - 200 мкм с привитыми гексадецильными (С16) группами (объем - 1 см3, масса сорбента - 0,6 г) (патрон № 1) |
ТУ 4215-002-05451931-94 |
Метилен хлористый, хч |
ТУ 6-09-2662-77 |
Натрий сернокислый, безводный, хч |
|
Натрий углекислый, кислый, хч |
|
Этилацетат, чда |
Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.
Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами |
|
Аппарат для встряхивания проб с возвратно-поступательным направлением колебаний, с максимальной загрузкой 10 кг, с амплитудой колебаний 30 мм и скоростью от 10 до 300 колебаний в минуту |
|
Банки полипропиленовые с крышками для экстракции вместимостью 250 см3 |
|
Блок нагревательный для виал или песчаная баня |
|
Ванна ультразвуковая с потребляемой мощностью 140 Вт, рабочей частотой 50 Гц, рабочим объемом 4,5 дм3 |
|
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная |
|
Виалы объемом 2 см3, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, прокалываемой микрошприцем для автоматического дозатора проб |
|
Виалы (пузырьки) с тефлоновыми прокладками емкостью 40 см3 |
|
Воронки делительные на 250 см3 |
|
Воронки лабораторные, стеклянные |
|
Испаритель ротационный вакуумный с ручным подъемником, с диагональным конденсором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об./мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом 5 дм3 и с диапазоном температур от 20 до 100 °С |
|
Колбы конические плоскодонные на 100, 250 и 1000 см3 |
|
Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 см3 и 4000 см3 ТС |
ТУ 92-891.029-91 |
Колонка хроматографическая капиллярная из кварцевого стекла, с внутренний диаметром 0,32 мм, длиной 30 м, с неподвижной фазой, содержащей 5 % фенилсилоксана и 95 % метилсилоксана, толщина пленки 0,25 мкм |
|
Колонки хроматографические, стеклянные или пластиковые, длиной 150 - 250 мм и диаметром 15 мм |
|
Насос диафрагменный, химически стойкий на 100 %, с мощностью электропривода 245 Вт, предельным вакуумом 100 мбар/абс, с избыточным давлением 1 бар и скоростью откачки 34 дм3/мин |
|
Стаканы стеклянные, термостойкие объемом 100 - 500 см3 |
|
Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3 |
|
Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие, диаметром 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г |
ТУ 6-09-1678-86 |
Центрифуга лабораторная, настольная с максимальным рабочим числом оборотов 4000 об./мин, с рабочим объемом ротора 200 см3 × 4 ячейки, выбираемый временной диапазон работы от 0 до 100 минут и с набором полипропиленовых банок емкостью 200 см3 |
|
Шприц инъекционный многократного применения объемом 10 см3 |
Примечание. Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТу 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТу 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТу 12.0.004.
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на газовом хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;
- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия для очистки экстракта, подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и концентрирующих патронах № 1, установление градуировочной характеристики.
7.1.1. Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.
7.1.2. Очистка хлористого метилена
Хлористый метилен промывают равным объемом 5 %-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 часов. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °С, отбрасывают.
7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.
7.1.4. Очистка ацетона
Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3.
Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С отбрасывают.
7.2.1. Приготовление рабочих растворов
7.2.1.1. Приготовление 1,0 %-го водного раствора аммиака для дериватизации. Мерной пипеткой отбирают 1 см3 25 %-го раствора аммиака и переносят в мерную колбу на 25 см3, куда предварительно наливают около 10 см3 бидистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и доводят объем в колбе до метки бидистиллированной водой (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой). Полученный раствор хранят под тягой в течение одного месяца.
7.2.1.2. Приготовление 4 н раствора серной кислоты. Мерным цилиндром отбирают 112 см3 концентрированной серной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 1000 см3, куда предварительно наливают около 300 см3 дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).
7.2.2. Приготовление градуировочных растворов
7.2.2.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией хлорантранлипрола 1,0 мг/см3. Взвешивают 50 мг хлорантранилипрола в мерной колбе объемом 50 см3. Навеску растворяют в ацетоне, помещая колбу в ультразвуковую ванну, и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится в холодильнике не более 4 месяцев.
7.2.2.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией хлорантранилипрола 10,0 мкг/см3. Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.
7.2.2.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией хлорантранилипрола 1,0 мкг/см3. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 3 используется для внесения в контрольные образцы и для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики после его дериватизации. Стандартный раствор № 4 хранится в холодильнике не более 10 суток.
7.2.2.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией хлорантранилипрола 0,5 мкг/см3. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 4 используется для внесения в контрольные образцы и для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики после его дериватизации. Стандартный раствор № 4 хранится в холодильнике не более 10 суток.
7.2.2.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией хлорантранилипрола 0,2 мкг/см3. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 2 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 5 используется для внесения в контрольные образцы и для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики после его дериватизации. Стандартный раствор № 5 хранится в холодильнике не более 10 суток.
7.2.2.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией хлорантранилипрола 0,1 мкг/см3. Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор № 6 используется для внесения в контрольные образцы и для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики после его дериватизации. Стандартный раствор № 6 хранится в холодильнике не более 10 суток.
7.3.1. Дериватизации стандартных растворов
В четыре виалы объемом 40 см3 помещают по 2 см3 каждого стандартного раствора хлорантранилипрола в ацетоне (№ 3, 4, 5 и 6 соответственно), удаляют растворитель током теплого воздуха.
К сухому остатку в виале добавляют 0,8 см3 ацетона и растворяют, помещая виалу в ультразвуковую ванну на 2 минуты. В виалу добавляют 2 см3 1,0 %-го водного раствора аммиака и помещают виалу в ультразвуковую ванну еще на 2 минуты. Плотно (!) закрывают виалу крышкой и помещают в нагревательный блок для виал на 2 часа при 75 °С. Далее виалу охлаждают до комнатной температуры, добавляют в нее 10 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают смесь. После полного разделения фаз из верхнего этилацетатного слоя аликвоту 5 см3, переносят в концентратор и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С.
Сухой остаток растворяют в 10 см3 ацетона и 1 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Получают 4 раствора для установления градуировочной характеристики с концентрациями: 0,1; 0,05; 0,02; 0,01 мкг/см3, в пересчете на хлорантранилипрол.
К сухому остатку в виале добавляют 0,8 см3 ацетона и растворяют, помещая виалу в ультразвуковую ванну на 2 минуты. В виалу добавляют 2 см3 1,0 %-го водного раствора аммиака и помещают виалу в ультразвуковую ванну еще на 2 минуты. Плотно (!) закрывают виалу крышкой и помещают в нагревательный блок для виал на 2 часа при 75 °С. Далее виалу охлаждают до комнатной температуры, добавляют в нее 10 см3 этилацетата и интенсивно встряхивают смесь. После полного разделения фаз из верхнего этилацетатного слоя аликвоту 5 см3, переносят в концентратор и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С.
Сухой остаток растворяют в 5 см3 ацетона и 1 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации хлорантранилипрола в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05 и 0,10 мкг/см3.
В испаритель хроматографа вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
7.5.1. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см3 ацетонитрила.
7.5.2.
Проверка хроматографического поведения
хлорантранилипрола на колонке с окисью алюминия
В концентратор объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора хлорантранилипрола в ацетоне с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 10 см3 ацетонитрила, помещая виалу в ультразвуковую ванну на 30 с, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см3 и упаривают досуха при температуре не выше 35 °С.
Исходную колбу обмывают тремя порциями ацетонитрила объемом 10 см3 каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентратор объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.
Сухой остаток каждой фракции переносят тремя порциями ацетона по 2 см3 каждая в виалы объемом 40 см3, удаляют растворитель током теплого воздуха и проводят дериватизацию, как указано в п. 7.3.1.
Определяют фракции, содержащие хлорантранилипрола, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.
Изучение поведения хлорантранилипрола на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.
7.6.1.
Подготовка концентрирующего патрона № 1
для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 20 см3 воды. Элюаты отбрасывают.
7.6.2.
Проверка хроматографического поведения хлорантранилипрола
на концентрирующем патроне № 1
В концентратор объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора хлорантранилипрола в ацетоне с концентрацией 1,0 мкг/см3 и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см3 ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, добавляют 8 см3 воды, перемешивают и наносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 см3 и выпаривают досуха при температуре не выше 35 °С.
Исходный концентратор обмывают 20 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, элюат собирают в концентратор объемом 100 см3 и выпаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Концентрирующий патрон высушивают под вакуумом в течение двух минут. Исходный концентратор последовательно обмывают четырьмя порциями объемом 10 см3 каждая смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:3. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.
Сухой остаток каждой фракции переносят тремя порциями ацетона по 2 см3 каждая в виалы объемом 40 см3, удаляют растворитель током теплого воздуха и проводят дериватизацию, как указано в п. 7.3.1.
Определяют фракции, содержащие хлорантранилипрол, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения хлорантранилипрола на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТом 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТом 6201-68 «Горох шлифованный. ТУ», ГОСТ Р ИСО 6497-11 «Корма для животных. Отбор проб», ГОСТом 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТом 17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках», ГОСТом 31760-12 «Масло соевое. ТУ», ГОСТом 22391-89 «Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках», ГОСТом 1129-13 «Масло подсолнечное, ТУ», ГОСТом 8808-2000 «Масло кукурузное, ТУ», ГОСТом 31760-12 «Масло соевое. ТУ», ГОСТом 32190-13 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».
Пробы зеленой массы растений хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °С до 2 лет.
Отобранные пробы зерна кукурузы и гороха, а также семян сои и подсолнечника подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы растительных масел хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 10 суток.
Образец измельченной зеленой массы растений массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3. Хлорантранилипрол экстрагируют 80 см3 этилацетата, помещая пробы в ультразвуковую ванну на 5 минут. Экстракты фильтруют через фильтр низкой плотности в концентратор объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 см3 этилацетата и помещая на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракты фильтруют, объединяют в концентратор объемом 250 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.
9.1.2. Очистка экстракта перераспределением
в системе несмешивающихся растворителей
К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 см3 ацетона, 50 см3 воды, перемешивают, тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят в делительную воронку объемом 250 см3. Водную фазу подкисляют 4 н серной кислотой до pH 2. Добавляют 50 см3 хлористого метилена, перемешивают, дегазируют (обязательно!!!) и интенсивно встряхивают в течение 2 минут. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 см3 хлористого метилена и встряхивая воронку в течение 2 минут. Хлористый метилен объединяют в концентраторе объемом 250 см3 и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С.
9.1.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия
Сухой остаток в концентраторе, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 10 см3 ацетонитрила, помещают на 30 секунд в ультразвуковую ванну, перемешивают и наносят на заранее подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор объемом 100 см3. Исходную колбу обмывают 20 см3 ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С.
9.1.4. Дериватизация
Сухой остаток, полученный в п. 9.1.3, растворяют в 2 см3 ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, переносят в виалу. Процедуру повторят еще два раза, используя по 2 см3 ацетона, удаляют растворитель током теплого воздуха и проводят дериватизацию как указано в п. 7.3.2.
После дериватизации из верхнего слоя (этилацетата) отбирают аликвоту 5 см3, переносят в концентратор объемом 100 см3 и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 см3 ацетона и 1 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Образец измельченных семян подсолнечника (сои, зерна кукурузы или гороха) массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 см3, прибавляют 80 см3 ацетона и помещают сначала на 10 минут в ультразвуковую ванну, а затем на аппарат для встряхивания проб на 10 минут. Затем пробу центрифугируют в течение 3 минут при скорости 4000 оборотов в минуту. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 см3 через фильтр низкой плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 см3 ацетона в тех же условиях. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.
9.2.2.
Очистка экстракта перераспределением
в системе несмешивающихся растворителей
К масляному остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 50 см3 гексана, перемешивают, тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят в делительную воронку объемом 250 см3. Хлорантранилипрол экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 см3, каждый раз интенсивно встряхивая воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (ацетонитрил) объединяют в конической колбе объемом 250 см3. Гексан отбрасывают.
Ацетонитрильный экстракт переносят в чистую делительную воронку объемом 250 см3 и промывают двумя порциями гексана по 30 см3, каждый раз интенсивно встряхивая воронку 2 минуты. Ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.
Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей» и по п. 9.1.3 «Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия».
9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1
Сухой остаток, полученный после очистки экстракта на колонках с окисью алюминия, растворяют в 2 см3 ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, перемешивают, прибавляют 8 см3 воды, перемешивают и вносят на заранее подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 20 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4 и вносят на патрон, элюат отбрасывают. Концентрирующий патрон высушивают под вакуумом в течение 2 минут.
Хлорантранилипрол элюируют с патрона 30 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:3. Элюат собирают в концентраторе объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.
Далее проводят дериватизацию как указано в п. 7.3.2.
После дериватизации из верхнего слоя (этилацетата) отбирают аликвоту 5 см3, переносят в концентратор объемом 100 см3 и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 см3 ацетона и 1 мм3 пробы вводят в хроматограф.
9.3.1. Экстракция и очистка полученного экстракта
в системе несмешивающихся растворителей
Из пробы растительного масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 см3 двумя порциями гексана объемом по 25 см3. Хлорантранилипрол экстрагируют тремя порциями ацетонитрила по 50 см3, каждый раз интенсивно встряхивая воронку в течение 2 минут. Гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт возвращают в чистую делительную воронку.
Ацетонитрильный экстракт промывают двумя порциями гексана объемом по 30 см3. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 см3 через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.
9.3.2.
Очистка экстракта перераспределением
в системе несмешивающихся растворителей
К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.3.1, прибавляют 5 см3 ацетона, 50 см3 воды, перемешивают, тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят в делительную воронку объемом 250 см3 через фильтр низкой плотности. Водную фазу подкисляют 4 н серной кислотой до pH 2. Добавляют 30 см3 хлористого метилена, перемешивают, дегазируют (обязательно!!!) и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 см3, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 см3 хлористого метилена и встряхивая воронку в течение 2 мин. Хлористый метилен объединяют в концентраторе объемом 250 см3 и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С.
Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.3 «Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия» и по п. 9.2.3 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1».
После очистки проводят дериватизацию как указано в п. 7.3.2.
После дериватизации из верхнего слоя (этилацетата) отбирают аликвоту 5 см3, переносят в концентратор объемом 100 см3 и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 см3 ацетона и 1 мм3 пробы вводят в хроматограф.
Хроматографическая система, включающая:
- хроматограф газовый с детектором по захвату электронов (ЭЗД), снабженный приспособлениями для капиллярной колонки и с возможностью использования автосамплера на 16 проб с дополнительным лотком на 150 виал, с микрошприцем для газовой хроматографии объемом до 10 мм3 для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему;
- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.
Колонка хроматографическая капиллярная из кварцевого стекла с внутренний диаметром 0,32 мм, длиной 30 м, с неподвижной фазой, содержащей 5 % фенилсилоксана и 95 % метилсилоксана, толщина пленки 0,25 мкм.
Температура детектора - 320 °С, поток газа поддувки (азот) - 25,0 см3/мин.
Температура испарителя - 300 °С, тип газа гелий, режим Split, давление 17,99 psi, деление потока 20:1, общий поток 57,6 см3/мин, поток обдува септы 3,0 см3/мин.
Программированный нагрев колонки с 180 °С (выдержка 1 мин) по 25 град/мин до 270 °С, с 270 °С по 5 град/мин до 300 °С (выдержка 5 мин), режим постоянный поток, поток колонки 2,6 см3/мин, средняя скорость 48,6 см/с.
Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,01 - 0,1 нг.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор IN-EQW78 с концентрацией 0,1 мкг/см3 в пересчете на хлорантранилипрол, соответственно разбавляют.
Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание хлорантранилипрола рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:
|
X - содержание хлорантранилипрола в пробе, мг/кг;
Scm - высота (площадь) пика стандарта, мВ;
Snp - высота (площадь) пика образца, мВ;
А - концентрация стандартного раствора, мкг/см3;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m - масса анализируемого образца, г;
Р - содержание хлорантранилипрола в аналитическом стандарте, %.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
X1, Х2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8×σr.
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
|
- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
|
δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг»*
________
* 0,01 мг/кг - предел обнаружения.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
Контроль стабильности градуировочной характеристики для IN-EQW78 в пересчете на хлорантранилипрол проводят при смене основного градуировочного раствора № 1 каждые четыре месяца, при смене основного градуировочного раствора № 2 - каждый месяц, при смене основных градуировочных растворов 3, 4, 5 и 6 - каждые 10 суток, а также в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание IN-EQW78 в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,01 до 0,1 мкг/см3 в пересчете на хлорантранилипрол.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
|
X - концентрация IN-EQW78 контрольного измерения, мкг/см3;
С - известная концентрация градуировочного раствора IN-EQW78 в ацетоне, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
7 - погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (А) превышает 7 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов IN-EQW78, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.4.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки Сд должна удовлетворять условию:
|
- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:
Δл = ±0,84Δ, где |
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
|
δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
|
, Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
|
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
|Кк| ≤ К, |
(2) |
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):
|
(3) |
X1, Х2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
(5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)
Среда |
Внесено хлорантранилипрола, мг/кг |
Обнаружено хлорантранилипрола, мг/кг |
Полнота определения, % |
Зеленая масса растений |
0,01 |
0,0077 ± 0,0003 |
77,4 |
0,02 |
0,0160 ± 0,0005 |
80,2 |
|
0,05 |
0,0403 ± 0,0014 |
80,6 |
|
0,10 |
0,0832 ± 0,0021 |
83,2 |
|
Семена сои |
0,01 |
0,0079 ± 0,0003 |
78,6 |
0,02 |
0,0151 ± 0,0009 |
75,4 |
|
0,05 |
0,0364 ± 0,0015 |
72,7 |
|
0,10 |
0,0758 ± 0,0048 |
75,8 |
|
Семена подсолнечника |
0,01 |
0,0082 ± 0,0003 |
82,4 |
0,02 |
0,0167 ± 0,0007 |
83,5 |
|
0,05 |
0,0389 ± 0,0007 |
77,8 |
|
0,10 |
0,0758 ± 0,0019 |
75,8 |
|
Зерно кукурузы |
0,01 |
0,0080 ± 0,0005 |
80,2 |
0,02 |
0,0162 ± 0,0007 |
81,0 |
|
0,05 |
0,0409 ± 0,0023 |
81,9 |
|
0,10 |
0,0761 ± 0,0029 |
76,1 |
|
Зерно гороха |
0,01 |
0,0076 ± 0,0002 |
76,2 |
0,02 |
0,0151 ± 0,0007 |
75,4 |
|
0,05 |
0,0373 ± 0,0022 |
74,6 |
|
0,10 |
0,0744 ± 0,0041 |
74,4 |
|
Растительные масла (масло кукурузы) |
0,01 |
0,0079 ± 0,0006 |
79,0 |
0,02 |
0,0158 ± 0,0006 |
79,1 |
|
0,05 |
0,0406 ± 0,0017 |
81,2 |
|
0,10 |
0,0802 ± 0,0023 |
80,2 |