Государственное
санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав
потребителей
и благополучия человека
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
флукарбазона натрия в семенах и масле
подсолнечника методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
Методические указания
МУК 4.1.3405-16
Москва 2017
1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» и ООО «Инновационный центр защиты растений» (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская, В.Ф. Павлова).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2016 г.
4. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ Руководитель
Федеральной службы ______________________ А.Ю. Попова 29 декабря 2016 г. |
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств флукарбазона
натрия в семенах и масле подсолнечника методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методические указания
МУК 4.1.3405-16
Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.234/01.00043/2016.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флукарбазона натрия в семенах и масле подсолнечника в диапазоне концентраций 0,5 - 5,0 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер.
Флукарбазон натрия
4,5-дигидро-3-метокси-4-метил-5-оксо-N-(2-трифторметоксифенил-сульфонил)1Н-1,2,4-триазол-1карбоксамид, натриевая соль (ИЮПАК).
Брутто формула: C12H10F3N4NaO6S.
Молекулярная масса: 418,29.
Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления 200 °С (с разложением).
Растворимость в органических растворителях (при 20 °С, в г/дм3): ацетонитрил - 6,4; диметилсульфоксид > 250; ацетон - 1,3; дихлорметан - 0,72; полиэтиленгликоль - 48; этилацетат - 0,14, пропанол - 0,27. Растворимость в воде при 20 °С (в г/дм3): 44 (pH 4 - 9).
Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода Kow logP = -2,85.
Давление паров 1×10-9 мПа·(при 20 °С).
Период полураспада в почве: DT50 (20 °С, аэробные условия) 2,1 день.
ЛД50 орально для крыс > 5000 мг/кг. Не токсичен для пчел.
Область применения: гербицид для борьбы с травянистыми и некоторыми широколистными сорняками.
Механизм действия - ингибирование ацетолактатсинтеза.
Гигиенические нормативы для флукарбазона натрия в России: МДУ в зерне хлебных злаков - 0,2 мг/кг, для подсолнечника не установлен.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические параметры
Анализируемый объект |
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг |
Показатель точности* (границы относительной погрешности (Р = 0,95), ±δ, % |
Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), σr, % |
Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), σR, % |
Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, % |
Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % (Р = 0,95) |
Семена подсолнечника |
0,5 - 5,0 |
23 |
9 |
12 |
26 |
34 |
Масло подсолнечника |
0,5 - 5,0 |
23 |
9 |
12 |
26 |
34 |
________ * Соответствует расширенной неопределенности Uотн. (в относительных единицах) при коэффициенте охвата k = 2 |
Полнота извлечения флукарбазона натрия, стандартное
отклонение,
доверительный интервал среднего результата для n
= 20, Р = 0,95
Анализируемый объект |
Предел обнаружения, мг/кг (мг/дм3) |
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/дм3) |
Полнота извлечения, % |
Стандартное отклонение, S |
Доверительный интервал среднего результата, ± % |
Семена подсолнечника |
0,5 |
0,5 - 5,0 |
85,2 |
2,43 |
1,06 |
Масло подсолнечника |
0,5 |
0,5 - 5,0 |
84,6 |
3,12 |
1,37 |
Метод основан на определении флукарбазона натрия по свободной кислоте флукарбазону методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов раствором калия фосфорнокислого 2-замещенного, последующей очистки в системе несмешивающихся растворителей и очистке на патроне для твердофазной экстракции.
Идентификация флукарбазона натрия проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки |
|
Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 150 г, предел допустимой погрешности 5 мг |
|
Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 81/210 г, предел допустимой погрешности 0,1/0,3 мг |
|
Колбы мерные на 10, 100 см3 |
|
Микродозаторы одноканальные переменного объема от 100 до 1000 мм3 и от 1 до 5 см3 |
|
Цилиндры мерные на 50 и 100 см3 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Ацетонитрил для ВЭЖХ |
ТУ 2634-002-04715285-12 |
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная) |
ГОСТ Р 52501-05 |
Калий фосфорнокислый 2-замещенный, 3-водный, чда |
|
Кислота ортофосфорная 98 %, хч |
|
Метанол, хч |
|
н-Гексан, хч |
ТУ 6-09-3375-78 |
Натрий сернокислый безводный, чда |
|
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 |
|
Смесь № 1: хлористый метилен - метанол в соотношении 95:5 по объему |
|
Смесь № 2: хлористый метилен - метанол в соотношении 1:1 по объему |
|
Флукарбазон с содержанием основного вещества 98,8 % |
|
Флукарбазон натрия с содержанием основного вещества 95,5 % |
|
Хлористый метилен, хч |
ТУ 6-09-3716-80 |
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (100×2,1) мм, 1,7 мкм |
|
Вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции |
|
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 25, 50 и 100 см3 |
|
Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислым сорбентом с постоянной активностью, на основе силикагеля, по 0,4 г |
ТУ 4215-002-0545-931-94 |
Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см3 |
|
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар |
|
Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 37 кГц |
|
Универсальная индикаторная бумага pH 0 - 14 |
|
Устройство перемешивающее (50 - 200 колебаний в минуту) |
ТУ 4389-007-44330709-11 |
Центрифуга со скоростью вращения 4000 об./мин |
|
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.
Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-15.
4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7.1.1. Кондиционирование колонки
Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.
7.1.2. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции
Патрон для твердофазной экстракции последовательно промывают 2 см3 метанола, затем 4 см3 хлористого метилена.
7.2.1. 0,005М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 по объему, используя мерные цилиндры.
7.2.3. 0,1М раствор калия фосфорнокислого 2-замещенного: 22,8 г калия фосфорнокислого 2-замещенного, 3-водного помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.2.4. 2М раствор ортофосфорной кислоты: 224 г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.3.1. Основной раствор флукарбазона для градуировки
(соответствует концентрации флукарбазона натрия 1,0 мг/см3)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают точную навеску флукарбазона 94,7 мг, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение месяца.
7.3.2. Приготовление градуировочных растворов
Градуировочные растворы, соответствующие концентрациями флукарбазона натрия 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 мкг/см3, готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.
7.3.2.1. Раствор № 1 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 5,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,5 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.
7.3.2.2. Раствор № 2 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 2,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.2.3. Раствор № 3 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.2.4. Раствор № 4 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.3.2.5. Раствор № 5 флукарбазона, соответствующий концентрации флукарбазона натрия 0,25 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение двух недель.
7.3.3. Приготовление растворов внесения
7.3.3.1. Исходный раствор флукарбазона натрия для внесения с концентрацией 100 мгк/см3: точную навеску флукарбазона натрия 10,5 мг (содержание действующего вещества 95,5 %) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в воде и доводят объем до метки водой.
7.3.3.2. Раствор № 1 флукарбазона натрия для внесения с концентрацией 10,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 10 см3 исходного раствора флукарбазона натрия для внесения и доводят до метки водой.
Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения флукарбазона.
Растворы внесения можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение двух недель.
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика флукарбазона - концентрация флукарбазона натрия в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флукарбазона натрия в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:
С = KS, где |
S - площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
|
С - аттестованное значение массовой концентрации флукарбазона натрия в градуировочном растворе;
СK - результат контрольного измерения массовой концентрации флукарбазона натрия в градуировочном растворе;
λконтр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λконтр. = 10 % при Р = 0,95).
В кругло донную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора флукарбазона № 3. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см3 хлористого метилена и переносят на подготовленный патрон. Колбу дважды порциями по 1 см3 обмывают хлористым метиленом и смывы тоже вносят на патроны. Промывают патроны 6 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют флукарбазон 8 см3 смеси № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.4.
Фракции, содержащие флукарбазон, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.
Примечание. Проверку хроматографического поведения веществ на патронах для ТФЭ следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.
Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также отбор проб семян подсолнечника для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 0852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре (0 - 4) °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.
Навеску измельченных семян 10 г помещают в коническую плоскодонную колбу, добавляют 50 см3 0,1М раствора калия фосфорнокислого 2-замещенного и экстрагируют в ультразвуковой ванне 10 мин. Растворитель декантируют и экстракцию повторяют еще с 50 см3 0,1М раствора калия фосфорнокислого 2-замещенного. Объединенный экстракт фильтруют через вату, подкисляют 2М раствором фосфорной кислотой до pH 3, переносят в делительную воронку и дважды порциями по 30 см3 экстрагируют хлористым метиленом. Объединенный органический экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия, собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.3.
К навеске масла 10 г добавляют 50 см3 гексана, переносят в делительную воронку и дважды порциями по 20 см3 экстрагируют 0,1М раствором калия фосфорнокислого 2-замещенного. Объединенный водный экстракт промывают 20 см3 гексана, подкисляют 2М раствором фосфорной кислотой до pH 3 и дважды порциями по 30 см3 экстрагируют хлористым метиленом. Объединенный органический экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия, собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.3.
Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1 - 9.2), количественно переносят тремя 1 см3 порциями хлористого метилена на подготовленный патрон (п. 7.1.2). Промывают патроны 6 см3 смеси № 1. Флукарбазон элюируют 5 см3 смеси № 2. Элюат переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см3 и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют на содержание флукарбазона натрия по п. 9.4.
Ультраэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (100×2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005М ортофосфорная кислота в соотношении 30:70. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3.
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание флукарбазона натрия в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
|
Sx - площадь пика флукарбазона на хроматограмме испытуемого образца, (AU);
K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;
Р - навеска анализируемого образца, г.
Содержание остаточных количеств флукарбазона натрия в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флукарбазона натрия с концентрацией 5,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
Примечание. Расчет содержания вещества в пробах может быть проведен с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
|
X1, Х2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r - значение предела повторяемости (r = 2,8σr).
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
|
- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
|
δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,5 мг/кг, где 0,5 мг/кг - предел обнаружения флукарбазона натрия в семенах подсолнечника).
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Сд должна удовлетворять условию:
Сд = Δл,Х + Δл,Х′, где |
±Δл,Х (±Δл,Х′) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
Δл = ±0,84Δ, где |
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
|
δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:
|
, , Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
|
(1) |
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
|Кк| ≤ К, |
(2) |
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):
|
(3) |
X1 и Х2 - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.