Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование Российской Федерации

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение химических соединений
в биологических средах

Сборник методических указаний
МУК 4.1.763 - 4.1.779-99

Минздрав России
Москва 2000

1. Разработаны под редакцией академика РАЕН, д.м.н., проф. Зайцевой Н.В., к.б.н. Улановой Т.С., к.б.н. Нурисламовой Т.В., Карнажицкой Т.Д., Суетиной Г.Н., Поповой Н.В., Митрофановой В.М., Плаховой Л.В., Рудаковой Е.А. (ПНИКИ детской экопатологии).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 6 июля 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Сущность метода. 3

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы.. 3

Требования к безопасности. 4

Требования к квалификации оператора. 4

Условия измерений. 4

Подготовка к выполнению измерений. 5

Выполнение измерений. 6

Вычисление результатов измерений. 6

Внутренний оперативный контроль. 7

Приложение А.. 8

Приложение Б. 8

Приложение В.. 9

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

6 июля 1999 г.

МУК 4.1.766-99

Дата введения: 6 сентября 1999 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Газохроматографический метод количественного определения ароматических
аминосоединений (анилин, N-метиланилин, о-толуидин, N,N-диметиланилин,
N-этиланилин, N,N-диэтиланилин) в биосредах (моча)

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 «Методики выполнения измерений» и ГОСТа Р 1.5-92 «Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов». Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение ароматических аминосоединений в моче в диапазоне концентраций:

анилин		0,045 - 2,0 мкг/см³
N-метиланилин		0,060 - 3,2 мкг/см³
о-толуидин		0,040 - 4,2 мкг/см³
N,N-диметиланилин		0,050 - 5,2 мкг/см³
N-этиланилин		0,045 - 3,0 мкг/см³
N,N-диэтиланилин		0,150 - 5,2 мкг/см³
Особенностью токсического действия ароматических аминосоединений являются функциональные нарушения центральной нервной системы, печени. Ароматические аминосоединения вызывают дерматиты, экземы и развитие аллергии.
АНИЛИН С₆Н₅NH₂		Мол. масса - 93,12
Анилин - маслянистая прозрачная светло-желтая жидкость со специфическим запахом. Т_кип - 184,4 °С, Т_плавл - минус 5,89 °С. Анилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. Анилин относится ко 2 классу опасности.
N-МЕТИЛАНИЛИН С₆Н₅NHСН₃		Мол. масса - 107,50
N-метиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 195,7 °С, Т_плавл - минус 57,0 °С. N-метиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-метиланилин относится к 3 классу опасности.
О-ТОЛУОИДИН С₆Н₄NH₂СН₃		Мол. масса - 107,15
О-толуоидин - маслообразная прозрачная жидкость от светло-желтого до красновато-коричневого. Т_кип - 199,7 °С, Т_плавл - минус 24,4 °С. О-толуоидин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. О-толуоидин относится ко 2 классу опасности.
N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИН С₆Н₅N(СН₃)₂		Мол. масса - 121,18
N,N-диметиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 194,0 °С, Т_плавл - 2,45 °С. N,N-диметиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диметиланилин относится ко 2 классу опасности.
N-ЭТИЛАНИЛИН С₆Н₅NС₂Н₅		Мол. масса - 121,1
N-этиланилин - маслянистая прозрачная жидкость с желтым оттенком со специфическим запахом. Т_кип - 204,7 °С. N-этиланилин растворим в органических растворителях и труднорастворим в воде. N-этиланилин относится к 4 классу опасности.
N,N-ДИЭТИЛАНИЛИН С₆Н₅N(С₂Н₅)₂		Мол. масса - 149,23
N,N-диэтиланилин - маслянистая прозрачная жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом. Т_кип - 216,27 °С, Т_плавл - минус 38,8 °С. N,N-диэтиланилин растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. N,N-диэтиланилин относится к 4 классу опасности.
ДИФЕНИЛ С₆Н₅С₆Н₅		Мол. масса - 154,21
Дифенил - бесцветные кристаллы. Т_кип - 255,9 °С, Т_плавл - 71,0 °С. Дифенил не растворим в воде, растворим в органических растворителях.
ХЛОРОФОРМ CHCl₃		Мол. масса - 119,38
Хлороформ - бесцветная жидкость с характерным сладковатым запахом. Т_кип - 61,15 °С, Т_плавл - минус 63,5 °С. Хлороформ растворим в этаноле, эфире, бензоле, ацетоне и сероуглероде, малорастворим в воде. Хлороворм относится ко 2 классу опасности.
Методика обеспечивает выполнение изменрений с суммарной погрешностью результата измерений:
анилин	12,4 %
N-метиланилин	11,8 %
о-толуидин	15,0 %
N,N-диметиланилин	10,0 %
N-этиланилин	21,42 %
N,N-диэтиланилин	15,4 %
при доверительной вероятности 0,95.

Сущность метода

Методика основана на предварительном концентрировании анализируемых соединений из биологического материала экстракцией хлороформом и последующего газохроматографического анализа хлороформенного экстракта.

Измерение концентрации ароматических аминосоединений выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием.

Нижний предел измерения в объеме пробы:

анилин	0,045 мкг,
N-метиланилин	0,060 мкг,
о-толуидин	0,040 мкг,
N,N-диметиланилин	0,050 мкг,
N-этиланилин	0,045 мкг,
N,N-диэтиланилин	0,050 мкг.

Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды и алифатические спирты. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 40 мин.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными метрологическими характеристиками.

Средства измерений

Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические	ГОСТ 24104-80Е
Секундомер «Агат»	ГОСТ 5072-79Е
Микрошприцы МШ-10	ТУ 5Е2.833.106
Шприцы медицинские стеклянные вместимостью 5 см³	ТУ 64-1-378-83
Посуда лабораторная стеклянная	ГОСТ 1770-84
Колбы мерные вместимостью 100, 1000 см³	ГОСТ 1770-74Е
Пипетки вместимостью 1, 5, 10 см³	ГОСТ 20292-74
Воронка делительная	ГОСТ 23932-79

Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стальная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм
Бидистилятор	ГОСТ 15150-69
Редуктор кислородный	ТУ 26-05-235-70
Ротационный испаритель типа ИР-1, ИР-1М или аналогичный
Центрифуга СМ-4, 3000 об/мин

Материалы

Гелий в баллоне	ТУ 51-940-80
Водород технический	ГОСТ 3022-80
Воздух в баллоне	ГОСТ 11882-73

Реактивы

3 % OV-1 на хроматоне N-супер фракции 0,16 - 0,20 мм - неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки
Анилин ч.д.а.	ГОСТ 5810-78
N-метиланилин технический	ТУ 6-02-571-81
N,N-диметиланилин ч.д.а.	ГОСТ 5855-78
О-толуоидин ч.д.а.	ГОСТ 10205-73
N-этиланилин технический	ТУ 6214-12-37-77
N,N-диэтиланилин ч.д.а.	ГОСТ 10162-75
Дифенил ч.д.а.
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Хлорид натрия х.ч.	ГОСТ 4233
Хлороформ фарм.	ГОСТ 20015-88

Требования к безопасности

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям «Пожарных норм проектирования зданий и сооружений» (СНиП IIА-5-700) и «Санитарных норм проектирования промышленных предприятий» (СН-245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

При работе необходимо соблюдать «Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях», утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981), и «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением», утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивом соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе.

Условия измерений

При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха - (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха - не более 80 % при температуре 25 °С.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

Приготовление стандартных смесей

Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую исследуемых компонентов, и готовят серию рабочих стандартных растворов.

Стандартные растворы аминосоединений и внутреннего стандарта готовят в мерных колбах вместимостью 100 см³ с содержанием этих веществ 20, 30, 50, 60, 70 мг и дифенила с содержанием 100, 90, 70, 60, 50 мг в хлороформе.

Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 55 см³/мин при температуре 300 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом внутреннего стандарта (в качестве внутреннего стандарта - дифенил). Она выражает зависимость калибровочных коэффициентов (K_i/cm) от отношения площадей пиков на хроматограмме (S_i/S_ст) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Для этого в каждую колбу вместимостью 100 см³ вносят небольшое количество хлороформа и взвешивают, затем прибавляют аминосоединения и внутренний стандарт и взвешивают колбу повторно. Объем доводят до метки хлороформом и по разности результатов первого и второго взвешиваний вычисляют массу аминосоединений и внутреннего стандарта. Срок хранения - 3 ч.

Таблица

Стандартные растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации аминосоединений (фрагмент шкалы)

Номер смеси для градуировки	1	2	3	4	5
Масса АНИЛИНА в 10 мм³ хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса N-МЕТИЛАНИЛИНА в 10 мм³ хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса О-ТОЛУИДИНА в 10 мм³ хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса N,N-ДИМЕТИЛАНИЛИНА в 10 мм³ хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса N-ЭТИЛАНИЛИНА в 10 мм³ хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса N,N-ДИЭТИЛАНИЛИНА в 10 мм³ хлороформа, мкг	2,0	3,0	5,0	6,0	7,0
Масса ДИФЕНИЛА в 10 мм³ хлороформа, мкг	10,0	9,0	7,0	6,0	5,0

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 мм³ каждого стандартного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок	110 °С,
температура испарителя	180 °С,
температура детектора	120 °С,
скорость программирования температуры	3 °С/мин,
расход газа-носитеяя (гелия)	55 см³/мин,
расход водорода	33 см³/мин,
расход воздуха	300 см³/мин,
шкала измерителя тока	10×10^-12 А,
скорость диаграммной ленты	240 мм/ч,
время удерживания: хлороформа	1 мин 45 с,
анилина	6 мин 15 с,
N-метиланилина	9 мин,
о-толуидина	9 мин 15 с,
N,N-диметиланилина	9 мин 50 с,
N-этиланилина	11 мин,
N,N-диэтиланилина	20 мин,
дифенила	37 мин.

На хроматограмме находят значения площадей пиков и внутреннего стандарта и вычисляют калибровочные коэффициенты на основании анализа бинарных смесей: анилин-дифенил, N-метиланилин-дифенил, о-толуидин-дифенил, N,N-диметиланилин-дифенил, N-этиланилин-дифенил и N,N-диэтиланилин-дифенил. Значение калибровочного коэффициента вычисляют по формуле:

S_i, S_cm - площади пиков исследуемого компонента и стандарта, мм²;

Q_i, Q_cm - количество исследуемого компонента и стандарта, мг.

По результатам 5 измерений определяется среднее значение калибровочного коэффициента K_i/cm и строится градуировочный график в координатах калибровочный коэффициент - отношение площадей пиков S_i/S_cm.

Градуировку проверяют 1 раз в неделю и при смене партии реактивов.

Отбор проб

Отбор проб мочи в объеме 100 см³ производится в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

Выполнение измерений

Анализируемую пробу мочи в количестве 100 см³ помещают в делительную воронку, добавляют 30 г (хлорид натрия) и 10 см³ хлороформа. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 15 мин, после отстаивания хлороформенный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 20 мин. Полученный центрифугат упаривают на ротационном испарителе и проводят газохроматографический анализ.

Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации анилина, N-метиланилина, о-толуидина, N,N-диметиланилина, N-этиланилина, N,N-диэтиланилина (мкг/см³) в биопробе вычисляют по формуле:

С - концентрация анализируемых соединений в биопробе, мкг/см³;

S_i, S_cm - площади пиков компонентов и стандарта, мм²;

K_i/cm - калибровочный коэффициент;

m_cm - навеска стандарта, мг;

V - объем пробы, см³.

Внутренний оперативный контроль

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

Контроль сходимости выходных сигналов

Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений.

Результат контроля признается положительным при выполнении условия:

S - площадь пика, мм²;

- среднее арифметическое значение площади пиков при вводе 3 параллельных проб градуировочного раствора.

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 - 150 %. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

|X' - X - С| < К_д, где

С - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией, мкг/см³;

К_д - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см³.

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают

, где

- характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/см³.

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что

К'_д = 0,84∙К_д

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.