Методические
указания Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ
от 19 марта 1996 г. № 13-7-2/555
«По лабораторной диагностике трихомоноза крупного рогатого скота»
1.1. Трихомоноз - протозойная болезнь крупного рогатого скота, вызываемая Trichomonas foetus, характеризуется поражением и функциональным расстройством половой сферы. Течение болезни преимущественно хроническое, но у коров и нетелей бывает острое.
1.2. Диагноз на трихомоноз устанавливают на основании результатов микроскопического, культурального исследований с учетом клинических и эпизоотологических данных.
1.3. Лабораторные исследования на трихомоноз включают:
микроскопию нативного материала;
посев материала на питательную среду;
дифференциацию возбудителей.
2.1. Для исследования в лабораторию направляют: слизь из влагалища или шейки матки от подозреваемого в заболевании животного; соскобы со слизистой оболочки препуциального мешка, секрет придаточных половых желез, сперму быка, выделения из половых органов; абортированный плод целиком или сычуг с содержимым, паренхиматозные органы плода и часть плаценты.
2.2. Перед отбором материала для исследования моют наружные половые губы у коров, область препуциального отверстия у быков тёплой водой и вытирают чистым полотенцем.
2.3. Вагинально-цервикальную слизь берут в период течки. За день до отбора материала рекомендуется вводить животным подкожно 1,5 - 2,0 см3 0,5 %-ного водного раствора прозерина или 1 %-ного раствора карбохолина.
2.4. При отборе материала и его разведении используют водный раствор хлорида натрия массовой концентрацией 8,5 г/дм3, рН 7,0 - 7,2 (далее раствор хлорида натрия).
2.5. Вагинально-цервикальную слизь берут полистироловыми пипетками. Для этого к шприцу при помощи резиновой муфты присоединяют полистироловую пипетку, набирают 5 см3 раствора хлорида натрия и через раскрытое зеркалом влагалище вводят его под давлением в шейку матки на глубину 3 - 4 см. Затем, не извлекая пипетки, шприцем насасывают раствор хлорида натрия со слизью, переносят в стерильную пробирку, которую закрывают резиновой пробкой.
Вагинальную слизь можно брать ложкой-катетером, которую вводят во влагалище животного без зеркала. При этом положение ложки должно быть боковым, а ее стержня - горизонтальным. Ложкой делают соскобы из различных мест слизистой оболочки влагалища и через канал стержня переливают в пробирку. Если соскоб густой консистенции, через канал стержня вводят 5 см3 раствора хлорида натрия, затем насасывают, выливают в пробирку и закрывают пробкой.
2.6. От быков станций (предприятий) по искусственному осеменению животных берут сперму и препуциальную слизь; от быков, используемых для естественного спаривания, - препуциальную слизь и секрет придаточных половых желез.
Сперму у быков получают при помощи искусственной вагины и переливают в стерильные флаконы и пробирки.
Секрет придаточных половых желез у быков получают путем их массажа через прямую кишку в стерильные пробирки или флаконы.
Слизь из различных мест слизистой оболочки препуция берут с помощью прибора ПСБ-1. Смонтированный прибор вводят в полость препуция до ее середины. Затем выдвинутым стержнем с наконечником и впитывающим тампоном делают 3 - 4 возвратно-поступательных движения от свода препуциальной полости до трубки прибора. Стержень втягивают в трубку, осторожно извлекают, опускают в пробирку с 3 см3 раствора хлорида натрия, тампон отжимают и извлекают, пробирку закрывают резиновой пробкой.
2.7. Материал для исследования отбирают не раньше, чем через 6 дней после профилактических орошении и через 10 дней после лечения трихомонадоцидными препаратами.
2.8. Пробы секрета придаточных половых желез, неразбавленной спермы, препуциальной, влагалищной слизи, патологических выделений в пробирках или флаконах помещают в термос со льдом и нарочным доставляют в лабораторию не позднее 4 ч после отбора.
2.9. Абортированный плод целиком или сычуг с содержимым, паренхиматозные органы плода, часть плаценты во влагонепроницаемой таре доставляют в лабораторию не позднее 12 ч после аборта. В холодное время года плоды рекомендуется замораживать.
3.1. С измененных участков плаценты делают соскобы и опускают во флаконы.
Соскобы густой консистенции разбавляют раствором хлорида натрия температуры 37 °C в 2 - 5 раз.
3.2. Из доставленного для исследования патологического материала делают по 2 препарата из каждого объекта. Жидкий материал (соскобы, слизь препуциальная, влагалищная, секрет, патологические выделения) берут пастеровской пипеткой со дна флакона или пробирки, каплю наносят на чистое предметное стекло и накрывают покровным. Готовый препарат, исследуют методом раздавленной капли под малым (×8 - 10), затем под средним увеличением микроскопа (×40) в затемненном поле зрения.
3.3. В положительных случаях в препаратах обнаруживают живых трихомонад с ундулирующей мембраной и аксостилем, движения их скачкообразно-поступательное или поступательно-вращательное. Дифференциацию трихомонад проводят как указано в п. 5.1.
4.1. При Отсутствии трихомонад в исходных мазках проводят культуральные исследования, используя среду Петровского или пептонно-агаровую (приложение).
4.2. Каждую пробу (сперму, секрет, препуциальную, влагалищную слизь, патологические выделения) от животного высевают в две пробирки со средой. При исследовании абортированного плода пастеровской пипеткой делают посевы из смеси содержимого грудной, брюшной полостей, сычуга, из печени, легких, сердца, соскобов с измененных участков плаценты, околоплодной жидкости в две пробирки со средой. В пробирки со средой вносят по 0,3 - 0,5 см3 материала.
4.3. Засеянные пробирки инкубируют в термостате при 37 ± 1 °С в течение 10 дн.
Посевы просматривают визуально на 3, 5, 7, 9 дн. При обнаружении помутнения среды стерильной пипеткой берут каплю среды со дна пробирки и готовят препарат. Если в препарате обнаруживают живых трихомонад, исследование прекращают.
5.1. Для дифференциации из материала или среды, содержащих трихомонад, готовят по 2 мазка. Материал берут стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки, наносят на чистое обезжиренное предметное стекло и распределяют тонким слоем. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют этиловым ректификованным спиртом 96-градусным в течение 20 - 25 мин, окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе (краску разводят дистиллированной водой рН 7,0 - 7,2 в соотношении 1:10) - 40 - 90 мин. (в зависимости от качества краски и температуры), промывают дистиллированной или водопроводной водой рН 7,0 - 7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа (×90).
5.2. При микроскопии обнаруживают трихомонад округлой, овальной, грушевидной, ланцетовидной, палочковидной форм. Цитоплазма трихомонад окрашивается в голубой цвет различной интенсивности, ядро - в красно-фиолетовый или красный, жгутики - в красный или розовый цвет.
От переднего конца Т. foetus отходят 4 жгутика, из которых три направлены вперед, а четвертый, окаймляя ундулирующую мембрану, идет назад и оканчивается свободно. Вдоль всего тела расположен аксостиль. Ядро овальной формы, чаще расположено ближе к передней части тела возбудителя.
5.3. Трихомонад необходимо дифференцировать от других жгутиковых простейших. Дифференциация основана на наличии характерных морфологических признаков возбудителей. У непатогенных жгутиковых родов Oicomonas, Cercomonas, Bodo ундулирующая мембрана и аксостиль отсутствуют и имеются 1 или 2 жгутика.
5.4. Результат исследований считают положительным при обнаружении в препарате из нативного материала или посевов возбудителя трихомоноза.
Микроскопического - 1 дн,
Культурального - 10 дн.
С утверждением настоящих Методических указаний на территории Российской Федерации утрачивает силу «Методические указания по лабораторной диагностике трихомоноза крупного рогатого скота», одобренные Главветупром МСХ СССР 29.12.85 г.
Приложение
|
Рецепты питательных сред
1. Среда Петровского. Свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, пленок, канальцев и измельчают в мясорубке. 1 кг фарша заливают 1 дм3 водопроводной воды рН 7,0 - 7,2, настаивают в течение 1 ч и кипятят при помешивании 1 ч. После отстаивания фарш удаляют, а жидкость доливают дистиллированной водой рН 7,6 - 7,2 до первоначального объема и фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
Берут 500 см3 печеночной воды и 500 см3 дистиллированной воды рН 7,0 - 7,2 добавляют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия (химически чистого) и доводят до кипения. Бульон охлаждают, определяют рН и доводят 1 %-ным водным раствором едкого натра до 8,2 - 8,4. Бульон повторно кипятят в течение 30 мин. Затем добавляют 10 г мальтозы или глюкозы, 0,3 г растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки по 8 см3, заливают вазелиновым маслом по 0,3 - 0,5 см3, стерилизуют при 112 ± 1 °С в течение 30 мин.
Полученная среда светло-коричневого или светло-соломенного цвета, рН готовой среды 7,2 - 7,4.
Срок хранения среды в холодильнике до 6 мес.
2. Пептонно-агаровая среда. К 900 см3 кипяченой дистиллированной воды рН 7,0 - 7,2 добавляют 0,5 г агар-агара и смесь кипятят до полного растворения компонента. В горячий раствор последовательно вносят 20 г пептона, 10 г глюкозы, 7 г хлорида натрия (химически чистого.), постоянно встряхивая колбу. После растворения компонентов среду в горячем виде фильтруют через слой фильтровальной бумаги, в фильтрат добавляют кипяченную дистиллированную воду до первоначального объема, закрывают резиновой пробкой с инъекционной иглой, а горлышко с пробкой перевязывают двумя слоями марли и ставят в кипящую баню на 1 ч, рН среды 6,9 - 7,2. Если рН среды ниже, добавляют по каплям 1 %-ный водный раствор едкого натра.
Охлажденную среду разливают в стерильные пробирки по 8 см3, наслаивают вазелиновое или растительное масло по 0,5 см3, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 112 ± 1 °С в течение 30 мин. Среда светло-соломенного цвета, содержит небольшую взвесь из частиц агар-агара.
Срок хранения среды в холодильнике до 3 мес.
Перед посевом в каждую пробирку со средами добавляют стерильную сыворотку крови лошади или крупного рогатого скота без признаков гемолиза - 1 см3 и антибиотики из расчета на 1 см среды: стрептомицин - 1 мг, пенициллин - 1000 ед., а в пептонно-агаровую среду дополнительно нистатит - 250 ед. После чего пробирки помещают в термостат при 37 ± 1 °С на 1 - 1,5 ч.
СОДЕРЖАНИЕ
|
2. Отбор и пересылка материала для исследования 3. Микроскопическое исследование |