4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика холеры

Методические указания
МУ 4.2.1097-02

1. Разработаны сотрудниками Министерства здравоохранения Российской Федерации Ю.М. Федоровым, Н.Я. Жилиной; Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Ю.М. Ломовым, Б.Н. Мишанькиным, Л.С. Подосинниковой, Л.Г. Воронежской, И.Я. Черепахиной, Т.А. Кудряковой, Б.Л. Мазрухо, Л.М. Смоликовой, И.В. Рыжко, Р.И. Цураевой, Э.А. Москвитиной, Б.П. Голубевым; Противочумного Центра Минздрава России А.А. Кюрегяном, С.М. Ивановой, Ю.С. Королевым; Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» А.К. Адамовым, З.В. Малыхиной, Т.В. Бугорковой, Н.И. Смирновой, Л.Ф. Ливановой; Иркутского научно-исследовательского противочумного института А.С. Марамовичем, В.С. Ганиным, Л.Я. Урбанович, В.И. Погореловым; Ставропольского научно-исследовательского противочумного института В.Н. Савельевым; Причерноморской противочумной станции Г.В. Гальцевой; Государственного Центра по антибиотикам С.В. Сидоренко; Российской медицинской академии последипломного образования Е.А. Ведьминой; ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздрава России Т.И. Анисимовой, Л.В. Саяпиной.

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 января 2002 г.

3. Введены взамен «Инструкции по организации и проведению противохолерных мероприятий» утв. МЗ и МП РФ от 09.06.95 № 01-19/50-11.

Содержание

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Лабораторная диагностика холеры

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания разработаны для внедрения и применения санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.1086-02 «Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору» в части, касающейся организации и проведения лабораторной диагностики холеры.

1.2. Настоящие методические указания предназначены для специалистов бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических и противочумных учреждений.

2. Нормативные ссылки

2.1. Санитарные правила по безопасности работ с микроорганизмами СП 1.2.006-93. Ч. I: Порядок выдачи разрешения на работу с микроорганизмами I - IV групп патогенности и рекомбинантными молекулами ДНК.

2.2. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности: СП 1.2.011-94.

2.3. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности: СП 1.2.036-95.

2.4. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами: СП 1.2.731-99.

2.5. Условия транспортирования и хранения медицинских иммунобиологических препаратов: СП 3.3.2.0-28-95.

2.6. Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору: СП 3.1.1086-02.

2.7. Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценка противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры: МУ 3.1.1096-02.

3. Характеристика возбудителя холеры

Холера - острая инфекционная болезнь из группы карантинных инфекций, с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, водным, пищевым и контактно-бытовым путями распространения инфекции.

Холерные вибрионы относятся к виду V. cholerae, который включает как патогенные, способные вызывать заболевания, склонные к эпидемическому и пандемическому распространению, так и свободноживущие в воде вибрионы, безопасные для человека или обусловливающие спорадические случаи диарей и инфекций с внекишечной локализацией возбудителя. Известно около 200 О-серологических групп холерных вибрионов, из которых лишь холерные вибрионы О1 серогруппы до последнего десятилетия являлись возбудителями грозной инфекции. С 1993 г. по решению ВОЗ как холеру регистрируют заболевания, вызываемые холерными вибрионами О139 серогруппы. Таким образом, к настоящему времени известны три варианта возбудителя холеры: холерные вибрионы О1 серологической группы - классические и эльтор (варианты Огава, Инаба, Гикошима) и холерные вибрионы новой О139 серогруппы.

Наличие гена холерного токсина (ctx AB), независимо от его экспрессии, отличает токсигенные (эпидемические) от свободноживущих холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп; кроме того, в геноме токсигенных эпидемически значимых вариантов присутствует ряд генов, кодирующих синтез белка TOX T, передающего сигналы запуска синтеза холерного токсина (CT), токсинкорегулируемых пилей адгезии (TCP) и фактора колонизации (ACF). Известно, что свободноживущие атоксигенные холерные вибрионы О1 чрезвычайно редко имеют tcp ген в своей хромосоме.

Характеристика генома выделенных штаммов молекулярно-биологическими методами может быть использована для эпидемиологического анализа и решения вопросов заноса, распространения и укоренения инфекции.

Известно многообразие фенотипических изменений атоксигенных холерных вибрионов, выделенных на свободных от холеры территориях, а также распространение эпидемически значимых фагорезистентных вариантов холерных вибрионов и штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

4. Организация лабораторных исследований

Диагностические исследования на холеру в регламентированном объеме могут проводить:

• бактериологические лаборатории территориальных центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных служб, имеющие разрешение на работу с микроорганизмами III группы патогенности;

• лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в субъектах федерации (республиканских, краевых, областных, городских), ведомственных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру;

• лаборатории противочумных учреждений, имеющие разрешение на проведение диагностических исследований на холеру и на работу с возбудителем холеры.

Организация и выполнение диагностических исследований на холеру в лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями, регламентирующими:

• безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами - для бактериологических лабораторий центров госсанэпиднадзора, лечебно-профилактических учреждений и ведомственных служб;

• безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности - для лабораторий особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора ведомственных и противочумных учреждений;

• порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности;

Порядок получения лабораториями разрешения на работу с микроорганизмами I - IV групп патогенности определяется действующими нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.

Все диагностические лаборатории, выполняющие работы с микроорганизмами I - IV групп патогенности, должны иметь лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний.

В условиях осложнения эпидемиологической обстановки временное разрешение на проведение диагностических исследований на холеру бактериологическим лабораториям центров госсанэпиднадзора, включенным в состав лабораторной службы очага, в случае расширения их функциональных обязанностей, предоставляется решением медицинского штаба очага.

4.1. При осуществлении эпидемиологического надзора

4.1.1. Бактериологические лаборатории центров госсанэпиднадзора в городах и районах, учреждений лечебно-профилактических и ведомственных служб:

• проводят плановые диагностические исследования на холеру материала от больных острыми кишечными инфекциями, определенного контингента здоровых лиц и проб из объектов окружающей среды в объеме, предусмотренном для соответствующего типа территорий по эпидпроявлениям холеры. Исследования ведут до установления отрицательного результата анализа или до выделения культуры с характерным для вибрионов ростом на агаровой и полиуглеводной средах и положительной реакцией на оксидазу. Культуры проверяют на чистоту в мазке, окрашенном по Граму, на подвижность и в реакции агглютинации на стекле (далее слайд-агглютинации) с холерными сыворотками О1, Огава, Инаба, РO и О139.

При положительном результате слайд-агглютинации немедленно сообщают в территориальный центр госсанэпиднадзора, культуру для окончательной идентификации немедленно доставляют в специализированную лабораторию в установленном порядке.

При отрицательном результате слайд-агглютинации:

• культуру, выделенную от людей, направляют для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию;

• неагглютинирующиеся культуры, выделенные из объектов окружающей среды, идентифицируют на месте или по согласованию передают в территориальный центр госсанэпиднадзора.

4.1.2. Лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора в республиках, краях, областях, городах и ведомственных учреждений:

• выполняют диагностическое исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру и проб из объектов окружающей среды;

• идентифицируют культуры вибрионов, выделенных в территориальных и ведомственных лабораториях, определяя их таксономическую принадлежность, а также определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп по регламентированным для лабораторий тестам;

• осуществляют (или организуют) бактериологический контроль качества питательных сред и других диагностических препаратов, используемых в территориальных лабораториях;

• представляют оперативную информацию о выделении культур холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп;

• в установленном порядке немедленно передают в территориальное противочумное учреждение культуры холерных вибрионов, таксономическая принадлежность или токсигенность которых имеющимися средствами диагностики не определяется;

• в течение 5 дней после окончания идентификации передают в территориальное противочумное учреждение или головной по проблеме «Холера» противочумный институт все культуры холерных вибрионов О1, О139, независимо от объекта обследования, и других серогрупп при выделении от больных;

• контролируют деятельность территориальных лабораторий, оказывают им методическую помощь по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой.

4.1.3. Лаборатории противочумных учреждений:

• проводят исследования материала от больных и умерших с подозрением на заболевание холерой, а также проб из объектов окружающей среды;

• подтверждают таксономическую принадлежность культур холерных вибрионов, выделенных на курируемой территории;

• идентифицируют все атипичные культуры холерных вибрионов с использованием дополнительных методов серологической, биохимической и других видов идентификации с целью уточнения таксономической принадлежности;

• определяют эпидемическую значимость (токсигенность) и антибиотикочувствительность культур;

• осуществляют методическое руководство по всем вопросам лабораторного обеспечения эпидемиологического надзора за холерой на курируемой территории;

• в установленном порядке передают с паспортами выделенные культуры холерных вибрионов в территориальный противочумный институт, в головной по проблеме «Холера» - Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Кроме того, паспорта на эти же культуры направляют в Противочумный центр Минздрава России.

Лабораторное обеспечение эпидемиологического надзора за холерой осуществляют в соответствии с планом противохолерных мероприятий, действующими нормативными и методическими документами. Профилактические исследования на холеру проводят в пределах рабочего дня с использованием соответствующих питательных сред, диагностические исследования материала от подозрительных на холеру больных (трупов) - в условиях круглосуточного режима работы лаборатории.

4.2. При проведении противоэпидемических мероприятий

Организация и регламентирование деятельности лабораторий, а также формирование лабораторной службы в очаге холеры осуществляется в соответствии с действующими методическими указаниями по вопросам профилактики холеры, организации мероприятий и оценки противоэпидемической готовности медицинских учреждений к проведению мероприятий на случай возникновения очага холеры.

5. Бактериологическое исследование

В системе противохолерных мероприятий значительное место занимает бактериологический анализ, от правильности и своевременности проведения которого зависит характер и объем профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Исследования проводят с целью:

• выявления больных холерой и вибриононосителей;

• установления окончательного диагноза при вскрытии трупов лиц, умерших от подозрительного на холеру заболевания;

• обоснования выбора средств этиотропной терапии холеры;

• бактериологического контроля эффективности лечения больных холерой и вибриононосителей;

• бактериологического контроля объектов окружающей среды, в т.ч. поверхностных водоемов;

• бактериологического контроля эффективности обеззараживания в очаге инфекции.

5.1. Отбор и доставка материала на исследование

Материалом для бактериологического анализа могут служить испражнения, рвотные массы, желчь, трупный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь); предметы, загрязненные испражнениями (постельное и нательное белье и др.); вода, ил, гидробионты, сточные воды, содержимое выгребных туалетов; смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты, мухи и др.

Материал от больного забирает медицинский персонал лечебного учреждения немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками. Руководитель несет ответственность за правильность отбора, хранения и доставки проб в лабораторию.

Необходимо учитывать высокую чувствительность холерных вибрионов к дезинфицирующим средствам и кислотам, возможность антагонистического действия сопутствующей микрофлоры и предполагаемую концентрацию возбудителя в исследуемом материале. Если в материале от больных алгидной формой холеры концентрация возбудителя достигает 10⁶ - 10⁹ м.к./мл, то в испражнениях больных легкой формой и леченных антибиотиками, реконвалесцентов и носителей количество холерных вибрионов обычно не превышает 10² - 10⁴ м.к./г.

Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов. Стерилизацию посуды и других средств забора материала проводят автоклавированием, сухим жаром или кипячением в 2 %-ном растворе пищевой соды.

Материал для исследования должен быть доставлен не позже чем через 2 ч после его взятия. В случае удлинения сроков доставки используют транспортные среды. Наиболее удобной и достаточно эффективной является 1 %-ная пептонная вода (рН 8,4 ± 0,1).

В пептонную воду в качестве ингибитора сопутствующей флоры может быть добавлен теллурит калия из расчета 1:100000 - 1:200000 или моющее средство «Прогресс» в концентрации 0,1 - 0,2 %. В отдельных случаях для транспортирования материала могут быть использованы солевые консерванты (см. раздел 7).

На флаконах (пробирках) с пептонной водой, передаваемых в стационары для отбора проб, должна быть этикетка или надпись с указанием названия среды и даты ее приготовления.

Среды во флаконах или пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, рекомендуется хранить не более 2 суток при температуре не выше (10,0 ± 0,2) °С при условии сохранения их стерильности. Целесообразно обеспечение стационаров и групп забора проб средами в закатанных флаконах.

При наличии у больного диареи материал забирают до начала этиотропной терапии в количестве 10 - 20 мл, у больных легкими формами - 1 - 2 г испражнений. От больных тяжелой формой материал направляют в лабораторию нативным и в 1 %-ной пептонной воде. В транспортную среду вносят 1 - 2 мл или 1 - 2 г материала на 5 - 6 мл среды.

При вынужденном удлинении сроков доставки материала в лабораторию (длительное плавание, круиз и т.п.) можно использовать полоски фильтровальной (промокательной) бумаги. Жидкими испражнениями пропитывают полоску обычной плотной промокательной бумаги или другого гигроскопичного материала и герметично упаковывают в пластиковый пакет для предохранения от высыхания при транспортировании в лабораторию. На таких полосках холерные вибрионы выживают до четырех-пяти или более недель, пока сохраняется влага.

При обследовании на вибриононосительство материал забирает медицинский персонал лечебно-профилактических учреждений, в очаге - создают специальные группы по отбору проб, работающие под руководством эпидемиологов.

Материал в количестве 1 - 2 г может быть доставлен на исследование нативным, в 1 %-ной пептонной воде или другой транспортной среде.

5.1.1. Способы отбора проб от больных холерой, вибриононосителей и контактных с ними лиц, секционного материала.

• Испражнения и рвотные массы в количестве 10 - 20 мл собирают в стерильную посуду стерильными ложками или стеклянными трубками с резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого помещают меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для обеззараживания кипячением.

• Для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения стекают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки.

• Стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты вводят в прямую кишку на глубину 5 - 6 см и собирают им содержимое со стенок кишечника. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1 %-ной пептонной водой, обломив часть деревянного стержня.

• Стандартную стерильную петлю из алюминиевой проволоки перед забором материала смачивают стерильным 0,9 %-ным раствором натрия хлорида и вводят в прямую кишку на 8 - 10 см. Взятый материал переносят во флакон или пробирку с 1 %-ной пептонной водой.

• Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным.

• От умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около 10 см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез производят между двойными лигатурами, предварительно наложенными на оба конца изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объеме до 10 мл и перенести в емкость с 1 %-ной пептонной водой. Взятые образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.

Банки, пробирки с материалом закрывают непромокаемыми пробками и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном транспорте с сопровождающим. Форма направления дана в прилож. 1.

5.1.2. Отбор проб из объектов окружающей среды.

• Воду (питьевую, из поверхностных водоемов и др.) для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой.

Из водопроводных кранов пробы воды берут после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин при полном открытии крана.

• Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя способами: в объеме 1 л также в двух емкостях по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10×10 см, сложенных в 10 - 15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через сутки помещают в стерильную банку и доставляют в лабораторию.

• Гидробионтов (рыб, лягушек и др.) отлавливают из водоемов любым способом и в закрытых банках, ведрах и других сосудах доставляют в лабораторию.

Исследовать зоопланктон (дафнии, циклопы и др.) можно групповым методом, объединяя в один посев 10 - 30 образцов, отловленных на одном участке водоема. В этом случае они могут быть доставлены в одном сосуде. При исследовании рыб берут содержимое желудка и жабры.

• Смывы с различных объектов окружающей среды берут ватным или марлевым тампоном, смоченным 0,9 %-ным раствором натрия хлорида, с поверхности площадью 10×10 см. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1 %-ной пептонной водой.

• Для сбора мух расставляют мухоловки, в которые наливают 1 %-ную пептонную воду с 1 % сахара.

• Остатки пищи в очаге и по показаниям пищевые продукты отбирают по 200 г плотных и 0,5 л жидких, помещают в стеклянную посуду и закрывают. При необходимости в жидкие продукты добавляют основной пептон до 1 %-ной концентрации.

Пробы объектов окружающей среды этикетируют, заполняют направление (прилож. 2) и отправляют в лабораторию с нарочным согласно действующим СП.

Перечень предметов, входящих в укладки для отбора проб, см. в прилож. 3, 4.

5.2. Порядок исследования

При бактериологическом исследовании на холеру используют различные питательные среды: жидкие среды обогащения, щелочной агар, элективные дифференциально-диагностические среды и набор сред для идентификации.

Применяют сухие среды производственного выпуска, имеющие номера госрегистрации и лицензии, или среды, консерванты, приготовленные по рецептуре и технологии, изложенной в разделе 7. Перечень производственных питательных сред и диагностических препаратов для выделения и идентификации возбудителя холеры приведен в прилож. 5. При транспортировании и хранении медицинских иммунобиологических препаратов следует руководствоваться СП 3.3.2.028-95. Используемые для диагностики холеры питательные среды подлежат бактериологическому контролю в установленном порядке.

Агаровые среды перед использованием должны быть тщательно подсушены. Посев делают так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Все посевы инкубируют при температуре (37,0 ± 0,5) °С.

Посевы исследуемого материала на всех этапах выращивают в 1 %-ной пептонной воде 6 - 8 ч, в пептонной воде с теллуритом калия - 12 - 18 ч, на щелочном агаре - не менее 14 - 16 ч, а на плотных элективных средах - 18 - 24 ч. Теллурит калия следует добавлять в 1 %-ную пептонную воду с рН не ниже 8,3 ± 0,1, до внесения исследуемого материала. Продолжительность хранения рабочего раствора теллурита калия (1:1000) - 7 дней, а питательных сред с теллуритом калия - не более 2 суток при условии содержания их в холодильнике.

5.2.1. Исследование проб от больных и вибриононосителей, секционного материала (рис. 1).

I этап

Испражнения, рвотные массы больных, а также содержимое кишечника, желчного пузыря и суспензию кусочков слизистой тонкого кишечника трупа в объеме 0,5 - 1,0 мл засевают пипеткой в 50 - 100 мл накопительной среды, петлей - на щелочной агар и одну из элективных сред (СЭДХ, TCBS).

При исследовании материала от больных с подозрением на заболевание холерой, не допускается использование 1 %-ной пептонной воды с теллуритом калия в качестве накопительной среды.

В случае поступления материала от больных с подозрением на холеру целесообразно применять ускоренные методы исследования: иммунолюминесцентный, иммобилизацию и ПЦР со специфическими праймерами (см. раздел 6).

Материал от подозреваемых на вибриононосительство засевают в 50 мл среды накопления при индивидуальных анализах и в 100 мл - при групповых, объединяя в один флакон по 0,5 - 1,0 мл пробы не более чем от 5 человек. К групповым посевам прибегают в редких случаях при проведении массовых обследований на вибриононосительство.

Материал, доставленный в 5 мл 1 %-ной пептонной воды, полностью используют для посева в 50 мл среды накопления. В случае поступления в лабораторию материала, забранного в 50 мл 1 %-ной пептонной воды во флаконе, и доставки его не позже 2 ч после забора пробы, флакон помещают в термостат на 6 ч для накопления возбудителя. При доставке материала в более поздние сроки 5 мл его засевают в 50 мл 1 %-ной пептонной воды.

В отдельных случаях, при бактериологическом исследовании материала от лиц, принимавших антибиотики, активные по отношению к возбудителю холеры, его засевают в 200 - 300 мл 1 %-ной пептонной воды (предпочтительно в широкогорлые колбы) и на 2 чашки щелочного агара так, чтобы получить рост в виде изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 24 ч, производя последовательные высевы через 8 - 10 ч инкубации с поверхностного слоя среды на пластинки щелочного агара. Использование второй среды обогащения в этом варианте исследования нецелесообразно.

II этап (через 6 - 8 ч от начала исследования).

С первой среды накопления делают высев на щелочной агар и одну из элективных сред и в 5 - 8 мл второй среды накопления. Пересевы в жидкие и на плотные среды делают с поверхности жидкой среды большой бактериологической петлей диаметром 5 мм.

При отрицательных результатах исследования нативного материала ускоренными методами, их повторяют после 6 ч инкубации первой среды накопления.

III этап (через 12 - 16 ч от начала исследования).

Высев со второй среды накопления на щелочной агар.

В случае необходимости ускорения хода анализа материала от больного или подозрительного на заболевание холерой, отбор колоний со щелочного агара, засеянного в начале исследования, можно начинать уже на этом этапе, в остальных случаях - на следующем.

Рис. 1. Схема лабораторного исследования на холеру

IV этап (через 18 - 24 ч от начала исследования).

Отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й накопительных сред.

• Чашки с посевами просматривают в проходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы, а также (особенно в вечернее и ночное время) под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете и отбирают подозрительные на вибрионы колонии для выделения и идентификации культуры.

На щелочном агаре колонии холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в типичной S-форме - круглые, гладкие, плоские, голубоватые, гомогенные, с ровными краями, прозрачные в проходящем свете и светло-серые с голубым или зеленоватым оттенком под стереоскопическим микроскопом в косо проходящем свете (прилож. 6).

Колонии холерных вибрионов на элективных средах TCBS и СЭ-ДХ имеют ярко-желтую окраску на зеленом или синем фоне среды, полупрозрачные. Размеры колоний на щелочном агаре через 10 - 12 ч инкубации обычно не превышают 1 мм, а к 18 - 24 ч достигают 2 - 3 мм в диаметре. Темпы формирования колоний холерных вибрионов на элективных средах несколько замедлены, поэтому просмотр посевов на СЭ-ДХ или TCBS следует проводить не ранее чем через 18 - 20 ч инкубации, когда размеры их становятся близки к колониям, вырастающим на щелочном агаре.

В отдельных случаях в посевах могут также встречаться атипичные колонии: мутные с плотным центром, пигментированные (коричневые или светло-желтые), мельчайшие коккоподобные, шероховатые.

Следует иметь в виду, что состав и качество питательных сред оказывают влияние на величину и плотность колоний холерных вибрионов, а также на морфологию клеток.

• При отборе колоний можно использовать пробу на индофено-локсидазу с однокомпонентным реактивом (без альфа-нафтола) или с индикаторными бумажками из набора СИБ-1 для идентификации вибрионов. С колониями, обнаруженными на элективных средах, пробу на оксидазу ставить не рекомендуется.

• Подозрительные колонии проверяют в слайд-агглютинации с сывороткой холерной О1 в разведении 1:50 - 1:100. При положительной реакции и достаточном количестве подозрительных колоний ставят слайд-агглютинацию с варианто-специфическими сыворотками Инаба и Огава в том же разведении, приготавливают мазки для окраски по Граму и обработки флюоресцирующими иммуноглобулинами. При отрицательных результатах колонии, обнаруженные в посевах материала от больных, проверяют в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О139 и РО.

Положительная ориентировочная реакция агглютинации с холерной О1 сывороткой в разведении 1:100 и варианто-специфической в разведении 1:50 или положительная реакция с флюоресцирующими иммуноглобулинами в сочетании с морфологическими, культуральными признаками и специфической иммобилизацией позволяют выдать на соответствующем этапе предварительный ответ об обнаружении в исследуемом материале холерного вибриона О1, а в случае положительной реакции с сывороткой О139 - холерного вибриона О139 серогруппы.

• Подозрительные на вибрионы колонии, агглютинирующиеся и не агглютинирующиеся холерными О1 и О139 сыворотками, отсевают на одну из полиуглеводных сред (лактозосахарозная, Ресселя, Клиглера, маннозосахарозная или др.) и (или) на сектор пластинки щелочного агара для выделения чистой культуры, ее идентификации и определения чувствительности к антибиотикам.

V этап (через 24 - 36 ч от начала исследования).

Отбор культур для идентификации.

На полиуглеводных средах отбирают культуры с типичными для вибрионов характером роста и изменениями:

• на двууглеводных средах (лактозосахарозная, глюкозо-лактозная и Клиглер) наблюдается характерное для кислой реакции изменение цвета столбика при сохранении цвета скошенной части без образования газа, а также сероводорода, улавливаемого в среде Клиглера;

• в маннозосахарозной среде за счет ферментации обоих углеводов окрашиваются и столбик, и скошенная часть, а также улавливается образование сероводорода.

Культуры, выросшие на щелочном агаре, проверяют на наличие индофенолоксидазы.

Определяют морфологию микроорганизмов и чистоту отобранных культур, выросших на щелочном агаре и полиуглеводных средах, с помощью окрашенных по Граму мазков.

Культуры, дающие характерные изменения на полиуглеводных средах и положительные в пробе на оксидазу, проверяют в ориентировочной слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1 в разведении 1:100, РО, Инаба и Огава - в разведении 1:50. При отрицательных результатах с этими сыворотками ставят слайд-агглютинацию с холерной сывороткой О139 серогруппы, используя ее в соответствии с инструкцией по применению.

На основании положительных результатов агглютинации с сыворотками О1, Инаба или/и Огава выдают предварительный положительный ответ о выделении из исследуемого материала культуры холерного вибриона О1 соответствующего серовара.

Если выделенная культура реагирует с холерной сывороткой О139 при отрицательных результатах с сыворотками О1 серогруппы, выдают ответ о выделении холерного вибриона О139 серогруппы.

Проводят идентификацию выделенных на полиуглеводных средах или на щелочном агаре агглютинирующихся и не агглютинирующихся сыворотками О1, РО или О139 серогрупп оксидазопозитивных культур по сокращенной или полной схеме.

VI этап (через 36 - 48 ч от начала исследования).

Учитывают результаты идентификации и выдают окончательный ответ о выделении культуры холерного вибриона соответствующей серогруппы и биовара.

Для холерных вибрионов О1 эпидемическую значимость оценивают по тестам гемолитической активности и чувствительности к фагам эльтор ctx⁺ и ctx^-, а в специализированных учреждениях - по результатам ПЦР или генетического зондирования на присутствие в геноме выделенной культуры ctx АВ гена, а также токсигенности на модели кроликов-сосунков. Эпидемическую значимость холерных вибрионов О139 серогруппы определяют по тем же тестам, кроме чувствительности к фагам эльтор ctx⁺ и ctx^-. К окончанию этого этапа исследования должна быть определена антибиотикочувствительность выделенной культуры.

При выделении от больного или вибриононосителя культуры холерного вибриона, не агглютинирующейся холерными сыворотками О1 и О139, выдают ответ о выделении холерных вибрионов не О1 и не О139. При наличии вибрионных агглютинирующих диагностических сывороток определяют принадлежность к другим серогруппам (О2 - О83).

Идентификацию культур, агглютинирующихся РО-сывороткой, см. в разделе 5.3.

5.2.2. Исследование объектов окружающей среды.

Схема анализа объектов окружающей среды отличается от схемы исследования материала от больных только на I этапе, II - VI этапы изложены выше.

Вода поверхностных водоемов и водопроводная

В зависимости от времени доставки пробы возможны следующие варианты посевов с целью первичного накопления вибрионов:

• к исследуемой воде добавляют раствор основного пептона до 1 %-ной концентрации, определяют рН, в случае необходимости подщелачивают 10 %-ным раствором едкого натрия до рН - 8,4 ± 0,1. Время инкубации в 1-й среде накопления - 8 - 10 ч. Объем 2 среды накопления - 10 мл; время инкубации в среде без теллурита калия 6 ч, а с теллуритом калия - 18 - 20 ч;

• в исследуемую воду добавляют раствор основного пептона до 1 %-ной концентрации и теллурит калия из рабочего разведения 1:1000 до концентрации 1:100000 или 1:200000 в соответствии с данными проверки. Устанавливают рН - 8,4 ± 0,1. Время инкубации 18 - 24 ч; вторая среда накопления - 10 мл среды без теллурита калия, время инкубации 6 - 8 ч;

• исследование проб воды можно также проводить с использованием в качестве ингибитора посторонней флоры моющего средства «Прогресс» в концентрации 0,1 - 0,2 %;

• после добавления основного раствора пептона до 1 %-ной концентрации и установления щелочной реакции, пробы сохраняют при комнатной температуре (не выше 25° С) до утра (первая среда накопления). В начале следующего дня засевают 5 мл поверхностного слоя в 100 мл 1 %-ной пептонной воды (вторая среда накопления) и делают высев на щелочной агар; высев со второй среды накопления производят через 6 - 8 ч инкубации;

• воду фильтруют через мембранные фильтры № 2 или 3, смыв с которых сеют в накопительную среду и на агаровые пластинки. Из смыва с фильтра можно делать мазки для окраски флюоресцирующими холерными иммуноглобулинами, а также ставить РНГА, ПЦР со специфическими праймерами.

При интенсивном бактериальном загрязнении проб можно использовать III среду накопления.

Хозяйственно-бытовые сточные воды

Сточные воды, доставленные в объеме 1 л, фильтруют через бумажный или матерчатый фильтр для освобождения от механических примесей (при необходимости).

После добавления к пробам основного раствора пептона до 1 %-ной концентрации устанавливают рН 8,4 ± 0,1 и инкубируют в объемах по 500 мл 8 - 10 ч (1 среда накопления) или с добавлением теллурита калия 1:100000 (1:200000) - 18 - 24 ч.

При заборе сточных вод марлевыми тампонами, последние помещают в широкогорлые колбы или банки с накопительной средой (500 мл) и далее исследуют, как указано выше.

Гидробионты

Лягушку непосредственно перед исследованием обездвиживают уколом иглы в спинной мозг и фиксируют на препаровальной доске брюшком вверх. Поверхность брюшка обрабатывают спиртом и ножницами делают медиальный разрез. Желчный пузырь отсекают от печени, разрезают и делают отпечаток на пластинке щелочного агара. Остатки желчи вместе с желчным пузырем помещают во флаконы с 50 - 100 мл 1 %-ной пептонной воды. Содержимое желудка засевают в 1 %-ную пептонную воду, а внутренней поверхностью стенки делают отпечатки на агаровые пластинки. Посев кишечника делают таким же образом, отсекая несколько петель в верхнем, среднем и нижнем отделах кишечника.

У крупных рыб в том же порядке засевают в накопительную среду содержимое желчного пузыря, желудка, кишечника и жабры. Мелких рыб (мальков) измельчают ножницами по 10 - 20 экз. в одной пробе и делают посев суспензии петлей на чашку с агаром и в 1 %-ную пептонную воду.

Дафний, циклопов и др. рачков растирают в ступке и засевают петлей в 1 %-ную пептонную воду.

У раков исследуют кишечник и жабры, делая посев содержимого в среду накопления, и слизистой стенки - отпечатком на агаровую среду.

Пищевые продукты

Безалкогольные напитки исследуют тем же методом, что и воду.

Молоко в количестве 5 мл сеют в 50 - 100 мл среды накопления или к 0,5 л молока добавляют основной раствор пептона до 1 %-ной концентрации его в молоке. Другие молочные продукты (кефир, сметану, творог, мороженое и т.д.) в количестве 5 - 10 мл засевают в 1 %-ную пептонную воду.

Твердые пищевые продукты измельчают, растирают в ступке с физиологическим раствором и засевают в количестве 10 г в 100 мл накопительной среды и петлей на агаровые среды.

Масло засевают в жидкую среду накопления в количестве 5 - 10 г, размягчив его в термостате, или делают посев смыва с поверхности его кусков.

После посева продукта устанавливают рН среды 8,4 ± 0,1.

Смывы с объектов внешней среды и мух засевают в 1 %-ную пептонную воду и исследуют по обычной схеме.

5.2.3. Порядок исследования в условиях односменной работы лаборатории.

При осуществлении эпиднадзора за холерой исследование материала от обследуемых контингентов может выполняться в следующих вариантах.

В качестве 1-й или 2-й среды накопления используют 1 %-ную пептонную воду (рН 8,4 ± 0,1) с теллуритом калия в конечной концентрации 1:100000 - 1:200000 в соответствии с результатами его контроля.

Вопрос выбора транспортной среды и порядок исследования решают в зависимости от разницы времени с момента взятия пробы до поступления ее в лабораторию. Примерная схема забора материала от больных в 1 %-ную пептонную воду и порядок дальнейшего его исследования на холеру с учетом различного времени доставки в лабораторию представлены в табл. 1. В течение рабочей недели для отбора проб используют 1 %-ную пептонную воду без теллурита калия в объеме 5 - 10 мл, во флаконах или пробирках (транспортная среда).

Пробы до отправки в лабораторию сохраняют при комнатной температуре (24,0 ± 1,0) °С в биксах, ящике, шкафу и т.д. в специально выделенной комнате, закрывающейся на замок. Продолжительность сохранения проб в указанных условиях - до 24 ч.

В случаях когда температура в помещении превышает 25 °С, материал следует брать в 1 %-ную пептонную воду с теллуритом калия.

В лаборатории в пробы во флаконах доливают соответствующую среду накопления в количестве до 50 мл, а из пробирок все 5 - 10 мл транспортной среды с материалом переносят пипеткой в 50 мл среды накопления.

На период выходного дня лаборатории в порядке исключения допускается следующий вариант: забор материала в 50 мл 1 %-ной пептонной воды с теллуритом калия (транспортная среда); допускаемое время сохранения проб до начала исследования при температуре (20,0 ± 1,0) °С - 60 ч, (27,0 ± 3,0) °С - 48 ч. В лаборатории 5 - 10 мл поверхностного слоя среды с материалом переносят в 50 мл 1 %-ной пептонной воды без теллурита калия (1 среда накопления) и делают высев на чашку щелочного агара с дальнейшим исследованием по изложенной схеме.

Таблица 1

Порядок исследования материала в зависимости от времени отбора и доставки его в лабораторию в 1 % ПВ

Пептонную воду повышенной щелочности в качестве накопительной среды рекомендуется использовать только на первом этапе исследования с удлинением срока инкубации ее до 18 - 24 ч. Основной раствор пептона и 1 %-ную пептонную воду с рН 9,5 ± 0,5 можно готовить впрок по общепринятой методике с подщелачиванием до необходимого уровня и последующей стерилизацией при температуре 120 °С - 20 мин.

Для подщелачивания пептонной воды используют 10 - 20 % NaOH.

5.3. Идентификация культур холерных вибрионов

Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью определения их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей серогруппы (О1, О139 или др.).

К виду V. cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные палочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но не активные в отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не обладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают нитратредуктазой, не продуцируют сероводород. Таксономическое положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.

Рис. 2. Классификация вибрионов¹⁾

Примечания: 1) таксономия вибрионов представлена по Bergeys manual of Determinative Bacteriology, 1994;

2) предложено McDonell & Colwell (1985) отнести к новому роду Listonella;

3) типовые штаммы О2-О39 соответствуют Sakazaki (1970); O40-O83, а также О12; О23 и О26 не изучены в сравнении с международной коллекцией типовых штаммов.

Таблица 2

Основные дифференциальные признаки рода Vibrio и некоторых других микроорганизмов

Условные обозначения:

¹⁾ - бактериостатический агент 2,4-диамино-6,7-диизопропилптериоидин;

Х - нет данных;

+ - положительный результат в 90 %;

- - отрицательный результат в 90 %;

+/- - положительный и отрицательный результаты встречаются в равной степени;

+ (-) или (+) - в скобках редко наблюдаемый результат.

Таблица 3

Дифференциация патогенных для человека видов рода Vibrio

Условные обозначения: см. обозначения табл. 2; ¹⁾ - грамотрицательные прямые или изогнутые палочки; d - различный результат.

Таблица 4

Отношение патогенных вибрионов к дифференцирующим углеводам

Условные обозначения: () - в скобках указан редко встречающийся вариант; +/- - приблизительно 50 % штаммов не обладают этими признаками; Х - нет данных.

Возбудителями холеры являются V. cholerae О1 (биоваров классического и эльтор; сероваров Инаба, Огава или Гикошима) и О139 серогрупп.

Токсигенные, эпидемически значимые варианты холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, содержащие гены холерного токсина (ctx АВ) и токсин-корегулируемых пилей (tcp А), вызывают заболевания холерой, склонные к широкому эпидемическому распространению.

Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина), эпидемически не опасные варианты холерных вибрионов О1 и других серогрупп могут вызывать спорадические или групповые (при общем источнике инфицирования) заболевания, не склонные к широкому эпидемическому распространению.

Предварительную идентификацию проводят по комплексу признаков, включая морфологию колоний, морфологию и подвижность микробных клеток, пробу на оксидазу и слайд-агглютинацию с сыворотками О1 (1:50 - 1:100), РО (1:50) и О139 (в разведении, соответствующем обозначению на этикетке). Для культур, положительно реагирующих с сывороткой О1, устанавливают принадлежность к серологическим вариантам (Инаба и Огава) также в слайд-агглютинации.

Окончательную идентификацию выделенных на полиуглеводной среде или щелочном агаре агглютинирующихся на стекле культур проводят по сокращенной или полной схеме.

Сокращенная схема предусматривает изучение культуры в развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками О1, Инаба, Огава и РО, определение чувствительности к диагностическим бактериофагам классическому и эльтор, отношения к глюкозе в среде Хью-Лейфсона, сахарозе, маннозе, манниту и арабинозе в средах Гисса. Культуры оксидазопозитивных, активно подвижных вибрионов, расщепляющие глюкозу в среде Хью-Лейфсона до кислоты без газа, ферментирующие сахарозу, маннозу, маннит в средах Гисса и инактивные по отношению к арабинозе, агглютинирующиеся не менее чем до ½ титра сыворотками О1 и одной из варианто-специфических сывороток, относят к V. cholerae О1 серовара Огава или Инаба. Культуры, агглютинирующиеся обеими варианто-специфическими сыворотками не менее чем до ½ титра, относят к серовару Гикошима. В случае агглютинабельности выделенной культуры обеими варианто-специфическими сыворотками целесообразно повторить исследование с использованием различных серий коммерческих препаратов.

Для подтверждения выделенной культуры холерных вибрионов к О139 серогруппе достаточно положительного результата в слайд-агглютинации с соответствующей сывороткой.

Полная схема идентификации культур, агглютинирующихся холерными сыворотками О1 серогруппы, предусматривает изучение их по дополнительным тестам, определяющим принадлежность к биовару (гемагглютинация, чувствительность к полимиксину, биовароспецифическим фагам, реакция Фогес-Проскауэра), определение антибиотикограммы и эпидемической значимости по чувствительности к ctx⁺ и ctx^-фагам в сочетании с тестом Грейга на гемолиз, а в специализированных учреждениях кроме того - по результатам исследования в ПЦР, методом молекулярного зондирования на наличие гена холерного токсина и определения холерогенности на модели кроликов-сосунков.

В случае выделения культур холерных вибрионов О139 серогруппы, их также изучают по чувствительности к антибиотикам, определяют эпидемическую значимость ориентировочно по гемолитической активности в пробе Грейга, окончательно - указанными выше специальными методами.

На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические, культуральные и биохимические признаки, агглютинирующиеся О1 и одной из варианто-специфических сывороток не менее чем до ½ титра, лизирующиеся и не лизирующиеся холерным и эльтор фагами, а также на культуры, агглютинирующиеся сывороткой О139, выдают окончательный ответ, указывая чувствительность их к антибиотикам и определяя эпидемическую значимость по результатам ориентировочных или специальных исследований.

Токсигенные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, как правило, не лизируют эритроциты барана, в отличие от нетоксигенных штаммов.

Кроме того, для холерных вибрионов О1 серогруппы указывают биовар на основании чувствительности к одному из диагностических фагов (эльтор или классическому) и (или) по дополнительным признакам для фагорезистентных культур (табл. 5).

Таблица 5

Признаки, дифференцирующие биовары V. cholerae О1

Культуры, имеющие признаки вибрионов по морфологии колоний и клеток, тесту на индофенолоксидазу и ферментативной активности на полиуглеводной среде, не агглютинирующиеся на стекле холерными сыворотками О1 и О139 серогрупп, выделенные от больных острыми кишечными инфекциями, идентифицируют по тестам, определяющим принадлежность к роду Vibrio и виду V. cholerae (табл. 2 и 3). Принадлежащие к V. cholerae культуры изучают в пробе с диагностическими фагами. При выделении чувствительных к холерным диагностическим монофагам, но не агглютинирующихся холерными сыворотками О1 культур, особое значение имеет изучение их клеточного состава, т.к. в популяции таких штаммов могут находиться типичные холерные вибрионы О1 серогруппы. Если культура по совокупности признаков относится к виду холерных вибрионов, ее изучают в реакции агглютинации с набором диагностических холерных сывороток О2 - О83 серогрупп по отечественной классификации (рис. 2).

На культуры, агглютинирующиеся одной из сывороток, выдают ответ о выделении V. cholerae О2, О5 или другой серогруппы.

Если культуры не типируются указанными холерными сыворотками или они отсутствуют в лаборатории, то выделенную культуру обозначают обобщенно - V. cholerae не О1/О139 серогрупп.

Кроме этого, штаммы V. cholerae non О1 типируют бактериофагами диагностическими холерными ТЭПВ 1-7.

Энтеропатогенные холерные вибрионы не О1 группы относятся преимущественно к О2, О5, О6, О8, О9, О14, О17, О22, О24, О28, О34, О36, О41, О42, О47 и О50 серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.

У выделенных от больных штаммов холерных вибрионов не О1/О139 серогрупп определяют антибиотикограмму. Для выделенных из окружающей среды вибрионов, не агглютинирущихся холерными О1 и О139 сыворотками, целесообразность полной таксономической характеристики определяется в каждом случае отдельно для конкретных территорий и объектов с учетом эпидситуации по холере и регистрации острых кишечных заболеваний, обусловленных этими микроорганизмами.

Идентификация атипичных культур холерных вибрионов. К атипичным относят культуры холерных вибрионов, отклоняющиеся от типичных по отдельным родовым и видовым признакам, а также по агглютинабельности группо- и вариантоспецифическими сыворотками О1 и чувствительности к диагностическим фагам (классическому и эльтор). Антигенная изменчивость холерных вибрионов О1 может выражаться в ослаблении до ¼ титра или утрате агглютинабельности холерными сыворотками О1, Инаба, Огава. Встречаются штаммы, агглютинирующиеся только холерной сывороткой О1 серогруппы и не реагирующие с вариантоспецифическими сыворотками (Инаба и Огава), что делает невозможным установление их серовара. В случае S-R диссоциации культуры холерных вибрионов начинают агглютинироваться РО-сывороткой. При этом, в одних случаях штаммы агглютинируются всеми холерными сыворотками, в т.ч. и РО, их обозначают как SR-варианты, в других - измененные холерные вибрионы в диагностических титрах агглютинируются только с РО-сывороткой и не агглютинируются холерными сыворотками О1, Инаба и Огава, их относят к R-вариантам.

В последние годы возросла частота встречаемости резистентных к диагностическим холерным фагам штаммов среди холерных вибрионов О1, выделяемых как от людей, так и из объектов окружающей среды.

При этом, фагоустойчивость вибрионов, снижение или отсутствие агглютинабельности холерными сыворотками, иногда сочетается с вариабельностью по другим признакам (культурально-морфологическим и биохимическим). Штаммы, атипичные по морфологическим признакам, образуют шероховатые, слизистые, мутные и пигментированные колонии. Размер их также может варьировать, вплоть до появления едва видимых карликовых колоний. У таких культур нередко снижена подвижность, наблюдается спонтанная агглютинация в 0,9 %-ном растворе натрия хлорида. Отмечена возможность обнаружения в организме больного и в воде открытых водоемов холерных вибрионов в Л-форме. В мазках, сделанных из атипичных культур холерных вибрионов, клетки имеют форму шаров, сферопластов, встречаются вытянутые, извитые, неделящиеся клетки в виде цепей или нитей.

Нередко встречаются штаммы, измененные по биохимическим свойствам, у которых отмечается ослабление, замедление или утрата способности расщеплять углеводы и многоатомные спирты (крахмал, маннит, маннозу, сахарозу), аминокислоты (триптофан, лизин, орнитин) и другие субстраты.

Во всех случаях выделения атипичных культур обязательно изучение их по признакам, определяющим их принадлежность к роду Vibrio и виду Vibrio cholerae (определение типа расщепления глюкозы в среде Хью и Лейфсона, декарбоксилаз лизина и орнитина и дигидролазы аргинина, чувствительности к вибриостатику О129 - 2,4-диамино-6,7-диизопропилптериоидину и др.).

Атипичные культуры холерных вибрионов, обладающие указанными выше признаками рода Vibrio и вида Vibrio cholerae, агглютинирующиеся сывороткой О1 до ¼ титра, лизирующиеся и не лизирующиеся диагностическими монофагами до ДРТ, следует относить к серогруппе О1.

Для всестороннего изучения все атипичные культуры холерных вибрионов следует направлять в специализированные лаборатории.

Для подтверждения принадлежности к V. cholerae O1 слабо агглютинирующихся (ниже ¼ титра), диссоциирующих и фагорезистентных культур обязательным является использование высокочувствительных методов (ПЦР со специфическими праймерами) и, по возможности, реакции агглютинации с кроличьими холерными сыворотками, обладающими большей специфичностью, чем лошадиные, поскольку они не содержат пула неспецифических иммуноглобулинов.

Рекомендуется при изучении измененных по антигенной структуре культур использовать также такие методы, как РНГА, РНАт, иммунофлюоресценцию, преципитацию в геле, адсорбцию агглютининов по Кастеллани, реакцию агглютинации с убитыми кипячением культурами, пробу с комплементом, позволяющую отбирать из популяции измененных штаммов типичные, резистентные к нему клоны в S-форме.

При получении сомнительных результатов слайд-агглютинации с холерной сывороткой О139 серогруппы следует повторить исследование с нагретой культурой.

Для серологической идентификации спонтанно агглютинирующихся культур применяют те же методы и дополнительно реакцию агглютинации с использованием осажденной культуры и 0,3 %-ного раствора натрия хлорида для разведения диагностических сывороток и приготовления взвеси изучаемой культуры.

Ускоренная идентификация культур.

Обнаруженные на III - IV этапах исследования материала от больного подозрительные на холерный вибрион колонии или сплошной рост чистой культуры на щелочном агаре отсевают в 3 мл питательного бульона. Спустя 3 ч инкубации при (37 ± 1) °С из бульонной культуры делают мазки для окраски по Граму и препараты для постановки феномена иммобилизации с сыворотками О1 и О139 серогрупп, а также для исследования прямым и непрямым иммунофлюоресцентным методом.

При положительных результатах иммобилизации и иммунофлюоресценции с сывороткой О1 серогруппы изучение проводят по тестам:

• агглютинабельности сыворотками О1, Инаба и Огава, раститрованными двукратно в 1 %-ной пептонной воде до титра;

• чувствительности к холерным диагностическим фагам (классическому и эльтор);

• ферментации глюкозы, маннозы, сахарозы и арабинозы в тест-наборах или средах Гисса в объеме 1 мл с учетом результатов через 3 - 6 ч инкубации при температуре (37 ± 1) °С;

• чувствительности к антибиотикам;

• на присутствие генов патогенности с помощью ПЦР.

При положительных результатах иммунофлюоресценции (непрямой вариант) и иммобилизации сывороткой О139 серогруппы проводят определение биохимической активности, антибиотикограммы методом дисков, токсигенности в ПЦР.

Во всех случаях параллельно обязательно делают высев на щелочной агар для выделения чистой культуры и последующей идентификации ее по полной схеме.

5.4. Учет анализов, оформление направлений и выдача результатов

Ответ о положительном результате может быть предварительным и окончательным.

Предварительный положительный ответ выдают по результатам ускоренного исследования нативного материала и после подращивания его в пептонной воде с помощью иммунофлюоресцентного метода, специфической иммобилизации, РНГА, а также по слайд-агглютинации сыворотками О1 и О139 подозрительных на холерный вибрион колоний.

При наличии возможности на этом этапе может быть использована ПЦР со специфическими праймерами.

Предварительный ответ сообщают устно и только в случаях проведения срочных анализов.

В условиях эпидемии холеры при проведении массовых исследований после идентификации первых культур такой ответ дает право на проведение противоэпидемических мероприятий.

Окончательный положительный ответ выдают по результатам полной, сокращенной или ускоренной идентификации выделенной культуры в течение 36 - 48 ч.

При проведении массовых исследований в очаге заболеваний холерой, когда первые культуры холерных вибрионов уже были идентифицированы по полной схеме, положительные результаты тестирования в слайд-агглютинации с холерными сыворотками О1 или О139 серогрупп в сочетании с морфологией и подвижностью клеток культур, выделенных от больных диареями или при обследовании на вибриононосительство, следует считать окончательными для решения вопросов о проведении противоэпидемических мероприятий.

Достоверность таких результатов повышается при использовании ускоренных методов диагностики: иммунофлюоресцентного, иммобилизации соответствующими сыворотками, ПЦР и др. Для полной идентификации выделенные культуры передают в назначенные для этих целей группу или лабораторию, специалисты которой при необходимости вносят в ответ соответствующие коррективы и дополнения, касающиеся определения антибиотикограммы, эпидемической значимости и токсигенности.

Отрицательный ответ может быть дан только по окончании исследования по полной схеме через 36 - 48 ч; при осуществлении эпиднадзора в условиях односменной работы лаборатории, допускающей использование теллурита калия, продолжительность анализа увеличивается до 3 - 4 суток.

Запрещается выдавать отрицательные ответы по результатам ускоренного исследования (МФА, РИВ, РНГА и др.) до окончания анализа как в условиях эпидемии холеры, так и при проведении эпидемиологического надзора.

Схему выдачи ответов см. на рис. 3.

При осуществлении эпидемиологического надзора направление к анализу, а, соответственно, и ответ на него, оформляют индивидуально на каждого больного. При проведении большого объема исследований в очаге холеры направления к анализам и ответы на них оформляют списком. При обследовании здоровых людей на вибриононосительство и исследовании на холеру объектов окружающей среды групповые формы направления и ответов допускаются как при эпиднадзоре, так и в очаге холеры.

Учет анализов и культур ведут по установленным формам (прилож. 7, 8). Обязательным является ведение рабочих записей исследования подозрительных культур (прилож. 9), регистрация выделенных культур (прилож. 10), составление паспорта штамма (прилож. 11).

При работе в очаге холеры используют упрощенные формы регистрации анализов, учитывая, что более подробные сведения имеются в бланках направлений, находящихся в лаборатории до ликвидации очага. Для удобства работы направления за каждый день подшивают отдельно.

Рис. 3. Схема выдачи результатов исследований на холеру.

6. Методы изучения свойств холерных вибрионов

6.1. Серологические методы

Принадлежность холерных вибрионов к О1 или О139 серогруппе определяют в слайд-агглютинации или развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками О1, Инаба, Огава, РО и с холерной сывороткой О139 серогруппы, в соответствии с инструкциями по применению препаратов, а также в других реакциях с иммуноглобулиновыми препаратами, предназначенными для ускоренной диагностики холеры и идентификации возбудителя.

Слайд-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри, используя подозрительную на холерный вибрион колонию и (или) агаровую 12 - 18-часовую культуру и сыворотки О1 серогруппы в разведении 1:50 - 1:100. Сыворотку О139 разводят в соответствии с указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями культуры в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия.

Развернутую реакцию агглютинации ставят и учитывают по общепринятой методике в соответствии с инструкцией по применению диагностических сывороток.

Для исключения спонтанной агглютинации рекомендуется ставить развернутую реакцию в 0,3 %-ном растворе NaCl.

Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3 %-ным раствором натрия хлорида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра. Суспензию изучаемой культуры готовят в этом же растворе концентрацией 3 × 10⁹ - 5 × 10⁹ м. к./мл в объеме 8 - 10 мл. Взвесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 - 1,5 ч. В реакции используют поверхностный слой микробной взвеси, разведенной 0,3 %-ным раствором натрия хлорида до концентрации 1 млрд м. к./мл, добавляя ее по 0,5 мл во все разведения сыворотки и контроль культуры (0,5 мл 0,3 %-ного раствора натрия хлорида + 0,5 мл взвеси культуры). Учет и оценка результатов аналогичны основному варианту развернутой реакции.

Флюоресцентно-серологический метод (МФА - метод флюоресцирующих антител).

Метод дает возможность ускоренно идентифицировать выделенную культуру, а также выявить возбудителя холеры О1 серогруппы при содержании его в исследуемом материале не менее чем 10⁵ м. к. мл. Исследованию подлежат выделенная культура, нативный материал (испражнения и рвотные массы) и материал после подращивания.

Порядок приготовления мазков, обработка их флюоресцирующими иммуноглобулинами, микроскопия и оценка результатов, являющиеся общими для всех бактерий, описаны в «Наставлениях по применению иммуноглобулинов диагностических флюоресцирующих холерных адсорбированных лошадиных сухих».

Положительный результат может быть получен через 1,5 - 2 ч от начала исследования.

При просмотре мазков, обработанных иммуноглобулином холерным флюоресцирующим, особое внимание следует обращать на морфологию светящихся микробов, т.к. в отдельных случаях в мазках из испражнений здоровых людей может наблюдаться свечение микроорганизмов, отличающихся по морфологии от вибрионов (грубые крупные палочки, кокки).

Для устранения неспецифического свечения целесообразно использовать в качестве «гасителя» бычий альбумин, меченный родамином. Методика его использования описана в «Инструкции по применению альбумина бычьего, меченного родамином, сухого».

Для выявления в исследуемом материале холерных вибрионов О139 серогруппы, в связи с отсутствием в настоящее время препарата специфических флюоресцирующих иммуноглобулинов, при наличии кроличьей агглютинирующей сыворотки к вибрионам этой серогруппы возможно использование непрямого метода иммунофлюоресценции, который описан в «Инструкции по применению сыворотки диагностической антивидовой против иммуноглобулинов кролика люминесцирующей сухой».

Реакция иммобилизации вибрионов под влиянием специфических холерных сывороток О1 и О139 серогрупп (РИВ).

Метод дает возможность обнаружить возбудителя в течение нескольких минут при концентрации его в исследуемом материале не менее 10⁵ м. к./мл. На предметное стекло пипеткой или петлей наносят 2 капли испражнений, рвотных масс или поверхностного слоя среды обогащения. Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), ко второй добавляют каплю О1 сыворотки в разведении 1:50, перемешивают и также накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю смотрят под микроскопом при увеличении × 400 - 600, используя фазово-контрастное устройство или конденсор темного поля.

При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой капле наблюдают характерную подвижность, во второй иммобилизацию отдельных микробных клеток и образование неподвижных микроагглютинатов немедленно или в течение 1 - 2 мин. В случае неспецифического взаимодействия с диагностическими сыворотками наблюдается образование мелких подвижных конгломератов при активной подвижности отдельных клеток.

Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15 - 20 мин от начала исследования нативного материала. При отрицательном результате исследование повторяют после подращивания в 1 %-ной пептонной воде.

В случае отрицательного результата необходимо провести аналогичное исследование с холерной сывороткой О139 серогруппы, которую разводят 1:5.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием диагностикума эритроцитарного холерного иммуноглобулинового.

Порядок подготовки материала, ингредиентов, постановки реакции и ее учет изложены в «Инструкции по применению диагностикума эритроцитарного холерного антительного иммуноглобулинового», прилагаемой к препарату.

6.2. Биохимические свойства

Биохимическую активность холерного вибриона изучают, используя коммерческие среды и тест-наборы (прилож. 5) или среды лабораторного приготовления, рецептура которых изложена в разделе 7.

Определение индофенолоксидазы.

Реактивы: 1 %-ные водные растворы диметил-пара-фенилендиамина, тетраметил-пара-фенилендиамина (гидрохлорида), этилоксиэтил-пара-фенилендиамина сернокислого (из набора для обработки бумаги «фотоцвет») и пара-аминодиметиланилина (гидрохлорида или оксалата) в сочетании с 1 %-ным спиртовым раствором α-нафтола или без него.

Реактивы должны быть бесцветными, их следует хранить во флаконах из темно-коричневого стекла со стеклянной пробкой без доступа света в холодильнике. В случае помещения реактива во флаконы из светлого стекла, их следует обернуть алюминиевой фольгой или темной бумагой.

Постановка пробы:

• на поверхность 18-часовой агаровой культуры, подозрительной колонии или полусливного роста на щелочном агаре наносят 1 каплю 1 %-ного водного раствора одного из указанных реактивов. Положительная реакция на индофенолоксидазу - ярко-красная окраска культуры через 20 - 30 с.

При использовании двухкомпонентной реакции (в сочетании с α-нафтолом) в положительных случаях - синее окрашивание культуры.

• Для постановки пробы на оксидазу можно использовать специальные бумажки из набора СИБ, МТС-V или пропитать помещенную в чашку Петри полоску фильтровальной бумаги 2 - 3 каплями 1 %-ного водного раствора одного из реактивов. Культуру наносят на полоску смоченной реактивом бумаги платиновой петлей (но не хромникелевой), стеклянной или деревянной палочкой и размазывают в виде небольшого пятнышка. Через 10 - 30 с появляется пурпурно-красное окрашивание, свидетельствующее о положительной реакции.

Из грамотрицательных бактерий положительную пробу на индофенолоксидазу дают вибрионы, аэромонады, псевдомонады, плезиомонады, а отрицательную - все энтеробактерии.

Не следует ставить пробу на оксидазу с культурами на полиуглеводных средах, а также с колониями на элективных средах (СЭДХ и TCBS).

Учитывая возможную нестойкость реактивов и различную способность вибрионов к образованию оксидазы на различных питательных средах, пробу обязательно сопровождают положительными и отрицательными контролями соответственно с культурами вибрионов или псевдомонад и энтеробактерий, выращенными на используемом в лаборатории питательном агаре.

Проба тяжа (String test).

На чашку Петри наносят каплю 0,5 %-ного водного раствора дезоксихолата натрия или 2,5 %-ного водного раствора моющего средства «Прогресс» и в ней суспендируют 18-часовую агаровую культуру исследуемого штамма. При положительной реакции суспензия немедленно теряет мутность, становится слизистой и вязкой - тянется за петлей, что характерно для вибрионов.

Проба позволяет дифференцировать вибрионы не только от энтеробактерий, но и от других родственных грамотрицательных микроорганизмов, которые не образуют «тяжа». Исключение составляют лишь некоторые штаммы аэромонас, которые в течение примерно 60 с образуют слабо тянущуюся нить.

Определение типа расщепления глюкозы (тест Хью-Лейфсона).

В две пробирки со средой Хью-Лейфсона засевают уколом в столбик изучаемую культуру. Поверхность среды в одной из пробирок покрывают 0,5 - 1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют от 1 до 4 суток при температуре (37,0 ± 0,5) °С. Окисление определяют по желтой окраске среды только в аэробных, ферментацию - в аэробных и анаэробных условиях роста. Вибрионы расщепляют глюкозу по ферментативному типу.

Определение декарбоксилазной активности.

В пробирки со средами, содержащими лизин, орнитин, аргинин и контрольную среду без аминокислот засевают по полной петле 18-часовой культуры и заливают 0,5 - 1 мл стерильного вазелинового масла. Инкубируют посевы при температуре (37,0 ± 0,5) °С. Учет результатов ежедневно, при сомнительном результате - наблюдение до 4 суток. В результате ферментации глюкозы вначале происходит сдвиг рН в кислую сторону, а в дальнейшем при декарбоксилировании аминокислот накапливаются амины и происходит защелачивание среды.

Ферментацию углеводов и многоатомных спиртов (глюкоза, лактоза, манноза, сахароза, арабиноза, маннит, салицин, дульцит, инозит, крахмал и др.) определяют в жидких или полужидких средах Гисса с индикатором бромтимоловым синим, Андреде, ВР.

Для посева используют культуру, выращенную в течение 12 - 20 ч на плотной питательной среде или в течение 3 - 4 ч - в жидкой питательной среде. Посевы на средах с углеводами и спиртами инкубируют при (37,0 ± 0,5) °С и учитывают через 6 - 18 ч.

Для определения диастатической активности кроме среды Гисса с крахмалом может быть использована и среда Кодама. Культуру засевают в среду и также инкубируют при (37,0 ± 0,5) °С. Через 18 ч в пробирку со средой Кодама добавляют 2 - 3 капли раствора Люголя. При разложении крахмала среда не окрашивается.

Определение протеолитических свойств.

В столбик желатины уколом засевают 18-часовую культуру и инкубируют в течение 2 - 3 суток при температуре (22 ± 0,5) °С или при (37,0 ± 0,5) °С в течение 18 ч. Перед учетом результатов пробирки помещают в холодильник на 20 мин. При положительном результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (и в контрольной пробирке) - затвердевает.

Определение образования индола.

Холерные вибрионы при выращивании в средах, содержащих триптофан (пептонная вода, мясопептонный бульон, бульон Хоттингера и др.), расщепляют его с образованием индола, что выявляется с помощью индикаторных бумажек или реактива Эрлиха после инкубирования при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 18 ч.

Определение образования сероводорода.

Холерные вибрионы не продуцируют фермент тиосульфатредуктазу, т.е. не способны расщеплять неорганические серосодержащие соединения, присутствующие в среде Клиглера и маннозосахарозной среде - это является дифференциальным признаком. Однако они, так же как некоторые другие энтеробактерии, продуцируют фермент цистиндесульфогидролазу, за счет которого способны образовывать сероводород из серосодержащих аминокислот, присутствующих в достаточном количестве в бульоне Хоттингера, мясопептонном бульоне, но отсутствующие или содержащиеся в незначительном количестве в 1 %-ной пептонной воде. Поэтому для постановки этого теста культуры выращивают в 1 %-ной пептонной воде при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 18 - 20 часов. Образование сероводорода регистрируют с помощью индикаторных бумажек.

Использование микротест-систем и СИБ.

Для определения оксидазы, образования индола и сероводорода, декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролазы аргинина, ферментации углеводов и многоатомных спиртов при идентификации вибрионов можно также использовать Систему индикаторную бумажную (СИБ) и микротест-ситемы для биохимической идентификации вибрионов.

6.3. Выявление способности к биолюминесценции

Изучаемые штаммы засевают в 1 %-ную пептонную воду или на пластинки щелочного агара, инкубируют при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 18 ч. Выросшие культуры просматривают в темной комнате. Свечение наблюдают после 5 - 10-минутной адаптации в темноте.

6.4. Тесты дифференциации биоваров холерных вибрионов О1

Определение чувствительности к диагностическим холерным фагам.

В лабораторной диагностике холеры используют бактериофаги диагностические холерные классический и эльтор. При оценке результатов проб с фагами необходимо ориентироваться на диагностический рабочий титр (ДРТ), который обычно обозначают на этикетках. Определение чувствительности к фагам проводят как с цельными препаратами, так и с их 10-кратными разведениями до ДРТ в мясопептонном бульоне. Дифференциальный рабочий титр не ниже 1 × 10^-2.

Для постановки реакции в чашки разливают щелочной агар. После застывания агара и подсушивания его в течение 30 мин при температуре 37 °С дно чашек делят на квадраты по количеству образцов фагов и 10-кратных разведений фага. В пробирку с 5 мл 0,5 - 0,7 %-ного питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45 °С, добавляют 0,1 - 0,2 мл 3 - 4-часовой бульонной культуры, тщательно смешивают и выливают на поверхность агара. Чашки оставляют при комнатной температуре с приоткрытыми крышками на 30 мин. В центр квадратов наносят штампом-репликатором, стандартной петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой по капле фагов в соответствующих разведениях. После подсыхания капель чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат при температуре (37,0 ± 0,5) °С. Результаты учитывают через 3 - 4 и 18 - 20 ч. Наличие лизиса в виде одного «стерильного» пятна или группы мелких негативных колоний оценивается как положительный результат.

Определение чувствительности к полимиксину В.

В расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар (рН 7,2 ± 0,1) добавляют полимиксин B из расчета 50 единиц на 1 мл среды. После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри. На застывшие агаровые пластинки наносят обычной бактериологической петлей 18 или 3-часовую бульонную культуру. Результаты учитывают после инкубирования посевов при температуре 37 °С в течение 18 ч. Холерные вибрионы биовара cholerae не растут на полимиксиновом агаре, для холерных вибрионов биовара eltor - признак вариабелен.

Постановка реакции гемагглютинации.

На предметное стекло в чашке Петри помещают каплю 0,9 %-ного раствора хлорида натрия и суспендируют в ней петлей 18-часовую агаровую культуру. Затем добавляют каплю 2,5 %-ной взвеси куриных эритроцитов, трижды отмытых 0,9 %-ным раствором хлорида натрия. Стекло покачивают до смешивания взвеси эритроцитов и вибрионов. При положительной реакции в течение 1 мин наступает склеивание эритроцитов. Реакцию сопровождают двумя контролями: а) в каплю 0,9 %-ного раствора хлорида натрия добавляют каплю 2,5 %-ной взвеси эритроцитов; б) в капле 0,9 %-ного раствора хлорида натрия суспендируют испытуемую культуру. Контроли должны быть отрицательными. Для постановки пробы могут быть использованы эритроциты морской свинки.

Постановка реакции Фогес-Проскауэра (на ацетилметилкарбинол).

Испытуемую культуру засевают в глюкозофосфатный бульон Кларка и инкубируют при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 1 - 3 сут. Затем к 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 6 %-ного спиртового раствора альфа-нафтола и 0,4 мл 40 %-ного раствора едкого калия. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 1 ч. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или ярко-красный цвет.

6.5. Тесты межвидовой дифференциации патогенных для человека вибрионов

Определение галофильности вибрионов.

Суточную агаровую культуру исследуемого штамма засевают в 1 %-ную пептонную воду с 3 %-ным раствором натрия хлорида. Через 3 - 4 ч инкубации при температуре (37,0 ± 0,5) °С переносят строго по 1 капле выросшей культуры в пептонную воду без NaCl, с 7 и 10 %-ным раствором натрия хлорида. Через 18 - 20 ч инкубации оценивают рост культур по помутнению среды.

К негалофильным относятся V. cholerae и V. mimicus, для роста которых достаточны следовые количества соли в среде. Вибрионы остальных видов, за исключением некоторых штаммов V. fluvialis и V. metshnikovii не растут в 1 %-ной пептонной воде без добавления натрия хлорида и устойчивы к значительным его концентрациям.

Определение способности вибрионов к росту при разных температурах.

Способность вибрионов к росту при температуре 4; 20; 30; 35; 40; 45 и 50 °С выявляют при посеве суточных культур в 1 %-ную пептонную воду с 0,5 % натрия хлорида для негалофильных вибрионов и с 1,5 - 2 % натрия хлорида для галофильных вибрионов. Наличие роста оценивают визуально в сравнении с контролем. Наблюдают за посевами ежедневно в течение 2 недель.

Определение нитратредуктазы.

• Суточную агаровую культуру засевают в 1 мл бульона Хоттингера с 0,1 %-ного раствора азотно-кислого калия. После 2 суток инкубации при температуре (37,0 ± 0,5) °С в посевы добавляют 0,5 мл реактива Грисса. В положительных случаях среда сразу же окрашивается в красный цвет.

• К 1 - 2-суточной культуре в бульоне Хоттингера с 0,1 % KNO₃ добавляют 3 - 5 капель реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1 % раствора риванола в дистиллированной воде и 12 %-ного раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции бульон окрашивается в красный цвет.

Определение β-галактозидазы.

Суточную агаровую культуру засевают на скошенную поверхность агара, содержащего 10 % лактозы. Посевы инкубируют 1 - 2 суток при температуре (37,0 ± 0,5) °С. Петлю выросшей культуры суспендируют в 0,25 мл 0,9 % раствора натрия хлорида, добавляют 0,25 мл водного раствора О-нитрофенил-β-D-галактопиранозита (ONPG) и помещают в термостат при (37 ± 0,5) °C. Реакцию учитывают через 20 мин, 1, 3 и 24 ч. В положительном случае взвесь приобретает желтую окраску, отрицательном - остается бесцветной.

6.6. Оценка эпидемической значимости холерных вибрионов

6.6.1. Определение гемолитической активности (по Грейгу)

К 1 мл 18 - 24-часовой культуры, выращенной в 4 - 5 мл мясопептонного бульона или сердечно-мозгового инфуза, добавляют 1 мл 1 %-ной взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в физиологическом растворе. Смесь бульоной культуры и эритроцитов осторожно перемешивают встряхиванием и помещают на 2 ч в термостат при температуре (37,0 ± 0,5) °С, а затем в холодильник до следующего дня. Предварительный учет результатов проводят через 2 ч, окончательный - на следующий день. При положительной реакции наступает полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (1 мл бульона + 1 мл взвеси эритроцитов) гемолиз отсутствует. Чистоту опыта следует контролировать путем высева «смеси» на агаровую среду.

Для постановки пробы Грейга может быть использована дефибринированная кровь барана, консервированная борной кислотой или консервантом Алсевера. Консервированные эритроциты сохраняют свои свойства в течение 3 месяцев. Перед постановкой пробы на гемолиз дефибринированную кровь центрифугируют при 2 - 3 тыс. об./мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость удаляют, а осевшие эритроциты отмывают 0,9 %-ным раствором хлорида натрия 2 - 3 раза с промежуточным центрифугированием до получения прозрачной надосадочной жидкости. Из отмытых эритроцитов приготавливают 1 %-ную взвесь в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия, которую можно хранить при температуре 4 °С 2 - 3 дня и использовать для постановки пробы Грейга описанным выше способом. (Рецепты консервантов см. раздел 7).

6.6.2. Определение эпидзначимости холерных вибрионов эльтор комплексным методом -

по отношению к диагностическим холерным бактериофагам эльтор ctx⁺ и ctx^- в соответствии с наставлением к препаратам и гемолитической активности.

Методика определения гемолитической активности описана выше.

Для постановки пробы с фагом используют метод агаровых слоев. Испытуемую культуру в объеме 0,5 мл добавляют пипеткой в пробирку с 5,0 мл 0,5 - 0,7 % агара Мартена pH 7,6 ± 0,2, расплавленного и охлажденного до 45 °С. После перемешивания все содержимое выливают на подсушенную поверхность агара Мартена pH 7,6 ± 0,2 в чашку Петри. После застывания слоя агара с культурой на его поверхность наносят цельные фаги эльтор ctx⁺ и ctx^-. После высыхания капель фагов чашки переворачивают агаром вверх и инкубируют при температуре (37,0 ± 0,5) °С.

По лизису фагами и гемолитической активности в пробе Грейга исследуемые штаммы относят к эпидемически опасным (I группа, вариант 1) и эпидемически неопасным (III группа, варианты 6, 7, 8) или к требующим дополнительных исследований для заключения об их эпидзначимости (группа II, варианты 2, 3, 4, 5) (см. табл. 6).

Таблица 6

6.6.3. Определение токсигенности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков

Исследования проводят в лабораториях, имеющих разрешение на экспериментальную работу с микроорганизмами I - II групп патогенности.

Для заражения животных используют 4-часовую агаровую культуру, выращенную при температуре (37,0 ± 0,5) °С или 18-часовую - при температуре (20,0 ± 1,0) °С. Необходимо использовать две заражающие дозы: 1 × 10⁵ и 1 × 10⁷ м.к., которые вводят внутрикишечно в объеме по 0,2 мл двум кроликам. Заражающую дозу контролируют путем высева на две чашки щелочного агара 0,1 мл взвеси из разведения 1 × 10³ м.к./мл. Кроликов 10 - 12-дневных, массой 130 - 160 г, фиксируют к станку брюшком вверх, выстригают шерсть на операционном поле и смазывают его йодом. Дают эфирный или внутримышечно тиопенталовый наркоз (0,2 мл 1 %-ного раствора на 100 г массы). Делают разрез длиною 1 см по средней линии живота на уровне пупка. Извлекают петлю тонкого кишечника на длинной брыжейке, фиксируют с помощью мягкого пинцета и вводят взвесь вибрионов. Петлю погружают в брюшную полость, брюшную стенку и кожу послойно зашивают. Шов смазывают йодом. Оперированных крольчат кормят с помощью шприца молоком и наблюдают 48 ч. Всех погибших и умерщвленных через 48 ч животных вскрывают и делают высев содержимого кишечника на чашки щелочного агара. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в толстом кишечнике, который растянут бесцветной или светло-желтой прозрачной или слегка опалесцирующей жидкостью. Слепая кишка и прилегающие отделы толстого кишечника могут быть настолько растянуты, что сквозь них видны подлежащие петли кишечника, что создает видимость полной прозрачности кишечного содержимого. Тонкий кишечник расширен и также заполнен полупрозрачным содержимым. Описанные изменения характерны для «синдрома холерогенности», наблюдаемого при заражении эпидемически опасными, содержащими ген холерного токсина штаммами.

Токсигенные (содержащие ген холерного токсина) штаммы холерных вибрионов вызывают гибель большинства зараженных животных дозами 1 × 10⁵ и 1 × 10⁷ м.к. в течение первых двух суток с описанным выше типичным «синдромом холерогенности».

Штаммы холерных вибрионов, не содержащие гена холерного токсина, не вызывают гибели животных и изменений в кишечнике или обуславливают накопление в кишечнике выживших или павших животных мутной, коричневато-желтой жидкости, т.е. развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией других факторов патогенности.

Обязательной проверке на модели кроликов-сосунков, при отсутствии возможности определения эпидзначимости другими методами, подлежат следующие штаммы V. cholerae О1 и О139 серогрупп:

а) выделенные от людей:

• гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О139 серогруппы;

• гемолизпозитивные штаммы холерных вибрионов обеих серогрупп;

• гемолизнегативные штаммы холерных вибрионов О1 серогруппы, атипичные по серологическим свойствам и устойчивые к фагам эльтор и ctx⁺;

б) выделенные из объектов окружающей среды:

• гемолизотрицательные штаммы холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, выделенные при отсутствии эпидосложнений по холере.

6.6.4. Определение генов холерного токсина (ctx АВ)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Методом ПЦР проводят определение генов холерного токсина (ctx АВ) и токсинкорегулируемых пилей (tcp А).

В основе ПЦР лежит амплификация (умножение) участка генома, ограниченного парой специфических праймеров, путем многократного копирования при помощи фермента - термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы). Образование в результате реакции фрагментов ДНК ожидаемого размера свидетельствует о наличии в пробе специфической ДНК.

Материал для исследования. Материалом для исследования могут быть: биологический материал (испражнения, рвотные массы), объекты окружающей среды (вода поверхностных водоемов, смывы с поверхностей, стоки, ил), чистые культуры вибрионов, I и II пептонная вода.

Подготовка проб для ПЦР. Подлежащие исследованию пробы испражнений или рвотных масс в объеме 1 мл (1 г) помещают в стерильные флаконы и добавляют 49 мл 0,9 %-ного раствора натрия хлорида. Суспендируют встряхиванием и отстаивают в течение 10 мин. Затем для отделения крупных частиц центрифугируют в течение 5 мин при 4000 (600 об/мин). Надосадочную жидкость центрифугируют в течение 15 мин при 8000 (12000 об/мин), после чего осадок суспендируют в 100 мкл 0,9 %-ного раствора натрия хлорида или дистиллированной воды. Подготовленную таким образом пробу обеззараживают.

Воду из поверхностных водоемов (стоки) забирают в объеме 1 л в стерильные флаконы, закрытые ватной пробкой. Центрифугируют в полном объеме в течение 15 мин при 8000 g (12000 об/мин). Осадок ресуспендируют в 1000 или 100 мкл дистиллированной воды. Пробы обеззараживают.

Подозрительные колонии, выросшие на плотной питательной среде, суспендируют в 50 мкл дистиллированной воды в микропробирке объемом 1,5 мл.

Чистые культуры вибрионов, выросших на плотной питательной среде, суспендируют петлей в 2 мл 0,9 %-ного раствора хлорида натрия и доводят концентрацию микробных взвесей до 5 единиц по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-59-86П), что соответствует 1×10⁹ м.к./мл для вибрионов. Затем готовят 10-кратные разведения взвесей в дистиллированной воде до необходимой концентрации, с учетом чувствительности используемой ПЦР-тест-системы. Отбирают по 1 мл соответствующих разведений в микропробирки объемом 1,5 мл и обеззараживают.

При исследовании пептонной воды, ее центрифугируют в течение 15 мин при 8000 g (12000 об/мин). Осадок ресуспендируют в 100 мкл дистиллированной воды и обеззараживают.

Обеззараживание проб. Все пробы обеззараживают путем кипячения в течение 30 мин, что обеспечивает инактивацию культур холерных вибрионов согласно п. 3.1.46 СП 1.2.011-94.

Выделение ДНК. Из подготовленных и обеззараженных таким образом проб проводят выделение ДНК с помощью сертифицированных наборов для выделения ДНК и согласно прилагаемой к набору инструкции. При исследовании чистых культур этап выделения ДНК опускают, для постановки ПЦР используют обеззараженные кипячением бактериальные взвеси.

Постановка ПЦР. Для постановки ПЦР используют разрешенные комитетом МИБП к применению в практике здравоохранения ПЦР-тест-системы. Работу выполняют согласно прилагаемой к тест-системе инструкции. Амплификацию проводят на программируемых термоциклерах отечественного и зарубежного производства.

Учет результатов ПЦР. Для учета результатов ПЦР используют электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Условия проведения электрофореза, визуализации результатов и их учет отражены в инструкциях к ПЦР-тест-системам.

При этом следует обратить внимание на следующие моменты:

• Если в положительном контроле отсутствует специфическая полоса (ошибка в постановке реакции, неправильное хранение или загрязнение реактивов в процессе работы, сбой программы амплификатора) - требуется повторная постановка реакции.

• Если в отрицательном контроле выявляется специфическая полоса на уровне положительного контроля (контаминация реактивов положительной ДНК или продуктами амплификации) - необходимо поставить дополнительные отрицательные контроли на этапе постановки ПЦР. Если результат повторяется - необходимо сменить реактивы.

• Наличие полос ампликонов, располагающихся выше или ниже контрольной полосы является неспецифическим ответом и результат реакции оценивается как отрицательный.

Молекулярное зондирование.

Молекулярное зондирование холерных вибрионов на наличие ctx гена проводят с помощью зонда, сконструированного в НИИЭ им. Н.Ф. Гамалеи, представляющего собой Hinc II-Xba I фрагмент ДНК холерного вибриона эльтор размером 0,84 т.п.н., содержащий полную последовательность гена ctx A и большую часть ctx B.

Исследования с использованием радиоактивной метки могут быть проведены в учреждениях, имеющих право работы с радиоактивными изотопами. Для изучения используют суточные агаровые культуры холерных вибрионов или их отпечатки на нитрозоцеллюлозных фильтрах, обработанных по специальной методике для обеспечения специфической стерильности и безопасности при пересылке почтой.

Для получения отпечатков 3 - 6-часовую бульонную культуру холерных вибрионов, выращенную при температуре (37,0 ± 0,5) °С, наносят бактериологической петлей или штампом-репликатором на поверхность щелочного агара и выращивают при температуре (37,0 ± 0,5) °С 18 - 24 ч для получения колонии 2 - 3 мм в диаметре. Нитрозоцеллюлозный фильтр (Hybond C или Schleicher & Schuel, Germany) накладывают на поверхность агара с колониями, через 1 мин (после промокания фильтра) снимают и помещают отпечатками колоний вверх на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 N NaOH, через 5 мин перекладывают на новую бумагу, смоченную тем же раствором, и выдерживают еще 5 мин. При этом происходит лизис клеток (визуально - колонии принимают вид капель слизи) и денатурация ДНК.

Фильтр переносят на фильтровальную бумагу, смоченную нейтрализующим буфером 1. Процедуру повторяют 3 - 4 раза с интервалом в 5 мин, всякий раз используя свежую бумагу, смоченную этим буфером.

Фильтр подсушивают на воздухе на сухом листе фильтровальной бумаги в течение 5 - 10 мин и промывают 2 - 3 раза по 10 мин при комнатной температуре в 20 - 30 мл нейтрализующего буфера 2. Фильтр помещают колониями вверх на поверхность раствора и через 1 - 2 мин погружают в него.

Фильтр высушивают на воздухе и прогревают при температуре (80,0 ± 0,5) °C в течение 1,5 - 2 ч для фиксации денатурированной ДНК.

Обработанный таким образом фильтр помещают между двумя листами фильтровальной бумаги в полиэтиленовый пакет, запаивают и пересылают в плотной упаковке (желательно картонной).

Приготовление буферных смесей.

Нейтрализующий буфер 1. (0,2 М трис-HCl, рН 7,5 ± 0,1 + 1М NaCl):

1М трис-HCl - 20 мл

5М NaCl - 20 мл

H₂O - до 100 мл

Для приготовления исходного 1М трис-HCl буфера рН 7,5 ± 0,1 навеску сухого трис-основания (121,1 г) растворяют в 600 мл дистиллированной воды, доводят рН до 7,5 ± 0,1 соляной кислотой, затем доводят общий объем раствора до 1 л.

5М NaCl - 292,5 г NaCl + H₂O до 1 л.

Нейтрализующий буфер 2.

(2^xSSC + 50mM ЭДТА + 25mM калий фосфатный буфер рН 7,0)

20^xSSC - 50 мл

0,5М ЭДТА - 50 мл

1М калийфосфатный буфер рН 7,0 - 12,5 мл

Н₂О - до 500 мл

20^xSSC:

NaCl - 175,5 г

цитрат натрия - 88,3 г

Н₂О - до 1 л

Для приготовления 1М калийфосфатного буфера рН 7,0 смешивают 61 мл 1М K₂HPO₄ (34,8 г/200 мл воды) с 39 мл K₂HPO₄ (27,2 г/200 мл воды) и проверяют рН с помощью рН-метра, подводя к 7,0 добавлением одного или другого раствора.

0,5М ЭДТА:

к 93 г ЭДТА-Na₂ добавляют 300 - 350 мл подогретой дистиллированной воды и постепенно приливают концентрированный раствор NaOH до полного растворения и далее до рН 7,5 ± 0,1. Общий объем доводят водой до 500,0 мл.

6.7. Оценка антибиотикочувствительности холерных вибрионов

Для оценки антибиотикочувствительности холерного вибриона используют дискодиффузионный метод и методы серийных разведений в агаре и бульоне. Перечень антибиотиков, используемых при оценке чувствительности, определяется методическими указаниями «Экстренная профилактика и лечение опасных инфекционных заболеваний».

Методы и критерии оценки антибиотикочувствительности холерного вибриона разработаны и стандартизованы для указанных методов и ограниченного перечня антибиотиков: ампициллина, тетрациклина, доксициклина, ко-тримоксазола, хлорамфеникола.

Для оценки чувствительности холерного вибриона к другим антибиотикам, прежде всего к фторхинолонам, временно предлагается использовать методы и критерии оценки, разработанные для микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. В пользу возможности такого допущения говорит тот факт, что методы и критерии, разработанные для перечисленных выше антибиотиков, полностью совпадают с таковыми для семейства Enterobacteriacae.

В международной практике основной средой, используемой во всех методах оценки антибиотикочувствительности, является среда Mueller-Hinton (агар и бульон). Рассматриваемые в последующих разделах критерии величины МПК, позволяющие отнести исследуемые микроорганизмы к одной из категорий: «чувствительные», «устойчивые» или «промежуточные», разработаны именно для среды Mueller-Hinton.

Следует признать возможность использования для оценки антибиотикочувствительности и других сред (например, АГВ) в том случае, если они удовлетворяют требованиям, изложенным в разделе 6.7.3. Контроль качества питательных сред для определения антибиотикочувствительности с учетом соответствующих требований проводят в лабораториях учреждений, имеющих необходимые для этого референтные штаммы микроорганизмов. Указанные учреждения ежегодно информируют курируемые лаборатории о возможности использования для этих целей конкретных питательных сред с указанием номера серий и даты выпуска или снабжают их готовыми партиями сред.

6.7.1. Методы серийных разведений

Постановка методов серийных разведений для оценки антибиотикочувствительности включает следующие этапы:

• Приготовление растворов антибиотиков

• Приготовление питательных сред с антибиотиками

• Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция

• Инкубация

• Учет и интерпретация результатов

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений является приготовление растворов антибиотиков.

Приготовление растворов антибиотиков

Различают основные растворы антибиотиков - пригодные для хранения и рабочие - используемые «ex tempore» для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов антибиотиков предпочтительно использовать субстанции препаратов с известной активностью, допускается использование готовых инъекционных лекарственных форм препаратов, оральные лекарственные формы не пригодны. Для приготовления навесок антибиотиков необходимо использовать аналитические весы или другие равного класса точности.

Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000,0 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности.

В связи с тем, что антибактериальные препараты существенно различаются по растворимости, в ряде случаев возникает необходимость использовать разные вещества для первичной солюбилизации препаратов (растворители) и для доведения их до заданной концентрации (разбавители). В тех случаях, когда растворители и разбавители являются разными веществами, для солюбилизации антибиотика необходимо использовать минимально возможное количество растворителя.

Отличные от воды растворители и разбавители для отдельных антибиотиков приведены в табл. 7. Основные растворы необходимо хранить при температуре не выше -20 °С (сроки хранения отдельных антибиотиков при этой температуре существенно различаются). Оптимальными условиями для хранения основных растворов антибиотиков является температура -60 °С и ниже, длительность не более 6 месяцев.

Таблица 7

Растворители и разбавители, используемые для приготовления основных растворов антибиотиков

С целью предотвращения конденсации влаги, извлеченные из морозильника флаконы с основными растворами антибиотиков, прежде чем открыть, необходимо выдержать до достижения ими комнатной температуры.

Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготовления рабочих растворов, их повторное замораживание не допускается.

Из основных растворов антибиотиков готовят рабочие двукратные концентрации. За основу берется конечная концентрация антибиотика в питательной среде равная 1,0 мкг/мл (более высокие - 2, 4, 8 и т.д.; более низкие - 0,5, 0,25, 0,125 и т.д.). Реальные концентрации рабочих растворов должны учитывать фактор разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1:10 в плотной среде и 1:2 в жидкой). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода (метод серийных разведений в агаре) или жидкая питательная среда (метод серийных разведений в бульоне).

Примерный диапазон концентраций антибиотиков, используемых при оценке чувствительности к отдельным препаратам, приведен в табл. 8. В зависимости от целей исследования возможно использовать и иные диапазоны концентраций.

Таблица 8

Диапазон концентраций антибиотиков для оценки чувствительности микроорганизмов

6.7.1.1. Методы серийных разведений в агаре

Приготовление питательных сред с антибиотиками.

Сухая агаризованная питательная среда растворяется и автоклавируется в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48 - 50 °С, где выдерживаются до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара). Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3 - 4 мм.

Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4 - 8 °С в течение 5 суток. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые беталактамные антибиотики, особенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения.

Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков.

Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция. Инкубация.

Для приготовления суспензии используют 3 - 4-часовую бульонную или суточную агаровую культуру холерного вибриона.

Для получения бульонной культуры отбирают одну или несколько четко изолированных колоний, легким прикосновением петли к центру колонии переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0 - 5,0 мл жидкой неселективной среды, например МПБ. Инкубируют при 37 °С. Приблизительно через 3 - 4 ч инкубации мутность бульонной культуры соответствует 1 - 2 × 10⁸ м.к./мл.

Для получения суточных агаровых культур можно использовать только четко изолированные колонии, выросшие на неселективных питательных средах. Взвесь агаровых культур в концентрации 10⁹ м.к./мл готовят на стерильном изотоническом растворе или бульонной среде по ОСО ГИСК им. Л.А. Тарасевича - ОСО-42-25-59-86П.

Конечная посевная доза на поверхности питательной среды должна составлять 10⁴ м.к. Поскольку коммерческие инокуляторы, штампы-репликаторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3,0 мм переносят 1 - 2 мкл жидкости, концентрация вибрионов в суспензии для инокуляции должна быть 10⁷ м.к./мл.

Для получения суспензии требуемой концентрации (10⁷ м.к./мл) бульонную культуру следует развести в 10 раз, а взвесь агаровой - в 100 раз. Суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5 - 8 мм.

После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16 - 20 ч.

Для контроля качества приготовления суспензий периодически рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на плотную питательную среду.

Важнейшим требованием контроля качества постановки метода является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду для контроля чистоты культуры.

Результат оценки антибиотикочувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры.

Учет результатов проводят поместив чашку на темную не отражающую поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.

При росте нескольких колоний или образовании «прозоны» исследование необходимо повторить, обратив особое внимание на чистоту культуры. В ряде случаев целесообразно получить субкультуру из единичных колоний, выросших на чашках с концентрацией антибиотика выше, чем явная МПК, и провести ее идентификацию.

Интерпретацию результатов проводят с учетом данных, приведенных в табл. 9 с отнесением штаммов к «чувствительным», «устойчивым» или «промежуточным».

6.7.1.2. Метод серийных разведений в бульоне

Наиболее распространен следующий способ постановки метода серийных разведений в бульоне.

Жидкая питательная среда, прошедшая предварительный контроль качества, готовится в соответствии с инструкцией изготовителя.

Рабочие растворы антибиотиков готовят в асептических условиях по схеме, аналогичной для метода серийных разведений в агаре, но в жидкой питательной среде и в концентрациях, вдвое превышающих заданные, затем разливают по 1,0 мл в пробирки.

Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из бульонной или взвеси агаровой культуры путем разведения в жидкой питательной среде до концентрации 10⁶ м.к./мл и вносят по 1,0 мл в пробирки с растворами антибиотиков. Таким образом, конечная концентрация микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5 × 10⁵ м.к./мл.

Посевы инкубируют при 37 °С в течение 16 - 20 ч.

Учет результатов проводят визуально или спектрофотометрически. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.

При постановке метода необходимо предусмотреть следующие контроли:

• чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды;

• рост культуры в среде без антибиотика.

Качество постановки метода контролируется периодически с использованием референтных штаммов.

6.7.2. Дискодиффузионный метод

Постановка дискодиффузионного метода включает следующие этапы:

• Приготовление питательных сред

• Приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция

• Наложение дисков и инкубация

• Учет и интерпретация результатов

Для получения достоверных результатов при постановке диско-диффузионного метода необходимо жестко соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков может снизиться ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлажнения) еще до истечения срока годности. Диски должны храниться при температуре 4 - 8 °С, плотно укупоренными, для дополнительной гарантии защиты от увлажнения во флаконах коммерческих дисков содержится силикагель. Флаконы с дисками следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживать закрытыми при комнатной температуре, что обеспечит выравнивание температуры дисков и окружающей среды и, соответственно, предотвратит образование конденсата влаги после открывания флаконов.

Приготовление чашек с питательной средой.

К качеству питательных сред для постановки диско-диффузионного метода выдвигаются те же требования, что и к плотным питательным средам для постановки метода серийных разведений в агаре, соответственно используются и те же методы контроля качества.

Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением расплавленной средой, чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 4,0 мм, что достигается внесением 25 - 30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм или 60 - 70 мл в чашку диаметром 150 мм. Размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Свежеприготовленные чашки перед инокуляцией культуры необходимо подсушить при 37 °С в течение 10 - 20 мин с приоткрытой крышкой.

Чашки с агаром можно хранить в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4 - 8 °С в течение 7 - 10 суток. Перед использованием их также необходимо подсушить в течение 10 - 20 мин при 37 °С с приоткрытой крышкой.

Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

Приготовление суспензии и инокуляция.

Для приготовления инокулята используют 18 - 20-часовую агаровую или 3 - 4-часовую бульонную культуру холерного вибриона. Суспензию или бульонную культуру доводят до концентрации 10⁹ м.к./мл по отраслевому стандартному образцу ГИСК им. Л.А. Тарасевича - ОСО-42-25-59-86П и разводят в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия до конечной концентрации 10⁸ м.к./мл.

Приготовленный таким образом инокулят наносят в количестве 1 - 2 мл на поверхность питательной среды, равномерно распределяют по поверхности покачиванием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин.

Наложение дисков и инкубация.

Не позднее, чем через 15 мин после инокуляции, на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками.

Диски наносят с помощью автоматического диспенсора или стерильным пинцетом. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15 - 20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Непосредственно после наложения дисков чашки помещают в термостат кверху дном и инкубируют 14 - 18 ч при 37 °С. Увеличение интервала между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации, а соответственно и пролиферации микроорганизма, приводит к «преддиффузии» антибиотика и увеличению диаметра зоны ингибиции роста.

Учет и интерпретация результатов.

После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм, при этом предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и на едва заметный налет у края зоны. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции, в этом случае необходима повторная идентификация и повторение исследования на антибиотикочувствительность.

При оценке чувствительности к сульфаниламидам и их комбинации с триметопримом границу зоны ингибиции роста следует учитывать на уровне ингибиции роста на 80 %. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полной ингибицией роста возможно завершение 1 - 2 циклов пролиферации микроорганизма.

Интерпретация результатов производится по табл. 9.

Таблица 9

Пограничные значения диаметров зон ингибиции роста (мм) и величин МПК (мкг/мл) антибиотиков в отношении Enterobacteriaceae spp.

6.7.3. Контроль качества питательных сред для определения антибиотикочувствительности

Качество питательной среды является одним из критических параметров для корректной оценки антибиотикочувствительности. Важнейшими показателями качества питательной среды являются концентрации двухвалентных катионов Ca²⁺ и Mg²⁺, влияющих на активность аминогликозидных антибиотиков и тетрациклинов, а также тимина и тимидина, являющихся антагонистами сульфаниламидных препаратов и триметоприма.

Перед использованием в экспериментах по оценке антибиотикорезистентности каждая новая партия среды (Mueller-Hinton или какой-либо другой) должна пройти контроль качества в соответствии с описанным ниже методом.

Определение рН среды.

Определение рН среды проводят после автоклавирования и охлаждения до комнатной температуры 25 °С, приемлемый диапазон 7,2 - 7,4. При величине рН среды, выходящей за указанные пределы, возможны существенные изменения в величине МПК.

Контроль катионного состава.

Для получения воспроизводимых результатов оценки антибиотикорезистентности питательная среда должна содержать Са²⁺ 20 - 25 мг/л и Mg²⁺ 10 - 12,5 мг/мл.

Наиболее доступным интегральным методом оценки качества сред (как жидких, так и агаризованных) является сопоставление экспериментально полученной величины МПК референтных штаммов микроорганизмов с этим показателем, приведенным в их паспортной характеристике.

Наиболее подходящим штаммом для оценки качества жидких и плотных питательных сред, предназначенных для изучения антибиотикорезистентности, является штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Среду следует считать удовлетворительной по качеству, если величина МПК гентамицина находится в пределах 0,5 - 2,0 мкг/мл. Выбор гентамицина для контроля качества связан с тем, что аминогликозидные антибиотики наиболее чувствительны к колебаниям концентрации двухвалентных катионов.

Для контроля на наличие антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212. При величине МПК триметоприма/сульфаметоксазола < 0,5/9,5 мкг/мл среду следует признать удовлетворительной по качеству.

Определение величины МПК антибиотиков (или диаметров зон ингибиции роста) в отношении референтных штаммов в целях контроля качества среды проводят в соответствии с описанными выше методами. Категорическим требованием является использование антибиотиков с предварительно известной активностью.

Таблица 10

Значения величин МПК (мкг/мл) для референтных штаммов

Таблица 11

Значения величин диаметров зон ингибиции роста (мм) для референтных штаммов

7. Питательные среды, реактивы, консерванты. Порядок контроля качества питательных сред

7.1. Питательные среды

Транспортные среды:

• 1 %-ная пептонная вода, pH 8,5 ± 0,1 без ингибиторов роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения);

• 2 %-ный раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 0,7 атм.

Среды обогащения

а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:

Пептон сухой - 100,0

Натрия хлорид - 50,0

Калия нитрат - 10,0

Натрия карбонат - 25,0

Дистиллированная вода - 1 л

pH 8,4 ± 0,1.

В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, pH доводят до 8,5 ± 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1 атм.

Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.

б) 1 %-ная пептонная вода

Для получения 1 %-ной пептонной воды концентрированный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления pH 8,5 ± 0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин при давлении 0,7 атм.

1 % пептонную воду можно готовить и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же как и основного пептона.

в) Пептонная вода с теллуритом калия

В 1 %-ную пептонную воду (pH 8,5 ± 0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1 %-ный раствор теллурита калия (1:1000). Срок хранения рабочих растворов 7 дней.

Плотные среды для выделения холерных вибрионов.

Щелочной мясопептонный агар:

Мясная вода - 1 л

Пептон - 10,0

Натрия хлорид - 5,0

Агар-агар - 20,0

pH 8,0 ± 0,2.

В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20 %-ным раствором едкого натра до pH 8,3 ± 0,1. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды в начале текучим паром в течение 30 - 40 мин, а затем при 1 атм. 20 мин. Если мясопептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.

Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя на 2 - 3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре 43 ± 2 °С, время лучше отстоя продлить до 18 - 20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 1,0 атм. 20 мин.

Элективные среды.

Рекомендуется использовать питательную среду - для выделения холерных вибрионов элективно-дифференциальную, сухую, СЭДХ.

Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы О1 и не О1 групп через 12 - 18 ч формируют на этих средах плоские, прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы, диаметром 1,0 - 2,0 мм; V. parahaemolyticus - мелкие, голубоватые (цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus - крупные, желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas - голубые, Enterobacteriaceae - очень мелкие плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый цвет; колонии протея, как правило, не роятся.

Среды для идентификации вибрионов.

Среды с углеводами для отбора колоний:

Среда Ресселя

Пептон - 5,0

Натрия хлорид - 5,0

Лактоза - 10,0

Глюкоза - 1,0

Агар-агар - 10,0

Индикатор Андреде - 40 мл

Вода дистиллированная - 1 л

pH 7,3 ± 0,1

Среду варят, фильтруют разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк. Среда светлая.

Среду можно готовить на 1 - 1,3 %-ном питательном агаре, добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор Андреде.

Лактозосахарозная среда.

Готовится как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу в том же количестве.

Среда Клиглера.

1,5 - 1,7 %-ный мясопептонный агар или другой слабощелочной питательный агар - 1 л

Лактоза - 10,0

Глюкоза - 1,0

2 %-ный раствор серно-кислого закисного железа - 10,0 мл

0,8 %-ный раствор тиосульфата натрия - 10,0 мл

0,4 %-ный раствор сульфата натрия - 10,0 мл

1 %-ный раствор фенолового красного - 24,0 мл

pH 7,3 ± 0,1

Вначале в расплавленном питательном агаре (pH 7,7 ± 0,1) растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 0,5 атм. и скашивают по типу среды Ресселя. pH готовой среды 7,3 ± 0,1, цвет красный.

Маннозосахарозная среда.

1,5 % питательный агар	- 1 л
Манноза	- 1,0
Сахароза	- 10,0
Серно-кислое железо (FeSO4)	- 0,2
Гипосульфит натрия (Na2SO3×5H2O)	- 0,08
Сульфит натрия (Na2SO3)	- 0,4
0,2 % феноловый красный	- 10,0

После расплавления pH среды довести до 8,0, разлить в пробирки по 5 - 7 мл и стерилизовать при 0,7 атм. - 15 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.

Среды для идентификации.

Среды Гисса.

К 100 мл 1 % пептонной воды (pH 7,3 ± 0,1) без селитры добавляют 0,5 - 1 % необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.) и 1 % индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6 % раствора бромтимолового синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин при 0,1 - 0,2 атм. Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при щелочной - синего.

Среда Хью-Лейфсона.

Пептон	- 2,0
Натрия хлорид	- 5,0
Двузамещенный фосфат калия	- 0,3
Глюкоза	- 10,0
Бромтимоловый синий	- 0,03
Агар-агар	- 3,0
Дистиллированная вода pH 7,1 ± 0,1	- 1 л

К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2 - 3 мин. Смесь подщелачивают 20 %-ным раствором едкого натрия до pH 7,4 ± 0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1 %-ного водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4 - 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, pH 7,1 ± 0,1. При кислой реакции среда желтеет.

Бульон Кларка.

Пептон	- 5,0
Глюкоза	- 5,0
Двузамещенный фосфат калия	- 5,0
Дистиллированная вода	- 1 л

Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин.

Среда Кодама. В 1 %-ную пептонную воду добавляют 0,5 % растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя.

Среда с желатиной. К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10,0 - 15,0 г на 100 мл (летом концентрацию желатины увеличивают до 20 %). Желатине дают набухать в течение 30 мин и затем растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре (45,0 ± 5,0) °С. Устанавливают pH 7,1 ± 0,1, прибавляя к расплавленной желатине 10 %-ный раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 мин до полного свертывания белка и просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5 - 8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм 20 мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застывании оставалась совершенно ровной.

Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот.

Пептон	- 5,0
Дрожжевой экстракт	- 25,0 (сухой 3,0)
Глюкоза	- 1,0
Натрия хлорид	- 5,0
Натрия карбонат	- 0,1
Бромтимоловый синий (0,1 %-ный р-р в 20 %-ном спирте)	- 45,0 (0,045 г сухого)
Аминокислота	- 10 - 20,0
Дистиллированная вода pH 6,4 ± 0,1	- 1 л

Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают pH 6,4 ± 0,1, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую - 1 % лизина, во вторую - 1 % орнитина, в третью - 1 % аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2 %, т.к. микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления аминокислот перед стерилизацией, в случае необходимости, реакцию среды исправляют 0,1 %-ным раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1 - 2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1 - 0,2 атм. 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной - синеет.

Среды для определения гемолитической активности.

Сердечно-мозговой настой.

сердечный настой	- 500,0 мл
мозговой настой	- 500,0 мл
пептон	- 10,0 г
натрия хлорид рН 7,3 ± 0,1	- 5,0 г

Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли, устанавливают необходимую реакцию, разливают в пробирки по 4,0 - 5,0 мл, стерилизуют при 0,7 атм - 20 мин.

Мясопептонный бульон: мясная вода с 1 %-ным сухим пептоном и 0,85 %-ной поваренной соли. Способ приготовления, стерилизации тот же, что для сердечно-мозгового настоя.

7.2. Реактивы

а) Для определения образования индола

Реактив Эрлиха:

Парадиметиламинобензальдегид	- 1,0 г
Этиловый спирт	- 95,0 мл
Концентрированная соляная кислота	- 20,0 мл

Альдегид растворяют в спирте, затем добавляют кислоту, смешивают, хранят в темном месте.

Полоски фильтрованной бумаги пропитывают насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают в термостате.

б) Для выявления образования сероводорода

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксусно-кислого свинца. Подсушивают на воздухе.

Полоски индикаторных бумажек на индол и сероводород помещают под пробку пробирки с засеянной культурой. В случае образования индола полоска - краснеет, а при образовании сероводорода полоска - чернеет.

в) Для определения нитратредуктазы:

Готовят отдельно два раствора. Первый - путем растворения при нагревании в фарфоровой ступке в 20 мл дистиллированной воды 0,2 мг альфа-нафтиламина (С₁₀Н₇NН₂). Жидкость осторожно вливают в 150 мл 12 %-ного раствора уксусной кислоты. Второй - 0,5 г сульфаниловой кислоты (C₆H₄NH₂SO₃H) растворяют в 150 мл 12 %-ной уксусной кислоты.

Затем оба раствора сливают в темную склянку с хорошо притертой пробкой. Реактив Грисса должен быть бесцветным, если он розовеет, то им не пользуются.

Сложность приготовления реактива Грисса, дефицитность и токсичность входящих в него компонентов (в частности, альфа-нафтиламина) ограничивают возможности его применения. Этих недостатков лишен метод с использованием риванолового реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1 %-ного раствора риванола в дистиллированной воде и 12 %-ного раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции культура испытуемого штамма, выращенная в бульоне или 1 %-ной пептонной воде с 0,1 % KNO₃, окрашивается в красный цвет.

г) Для определения β - галактозидазной активности приготавливают М/75 раствор орто-нитрафенил - β - Д - галактопиранозида (ОНФГ).

ОНФГ - 80 мг

Дистиллированная вода - 75 мл

Фосфатный буфер - 5 мл

ОНФГ растворяют в дистиллированной воде при 37 °С, затем добавляют раствор однозамещенного фосфорно-кислого натрия (NaH₂PO₄×H₂O). pH доводят до 7,0. Раствор должен быть бесцветным - хранят при температуре - 4 °С. Перед использованием раствор выдерживают в течение нескольких минут до растворения фосфата, который на холоде кристаллизируется.

7.3. Консерванты для сохранения дефибринированной крови

Консервант с борной кислотой

Борная кислота	- 40,0 г
Глюкоза	- 50,0 г
0,9 %-ный раствор натрия хлорида	- до 1 л

Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при 100 °С - по 20 мин в течение 3 дней.

100 мл дефибринированной крови барана соединяют с 15 мл консерванта с борной кислотой.

Консервант Алсевера

Сахароза (или глюкоза)	- 20,5
Хлористый натрий	- 8,0
Цитрат натрия	- 4,2
Дистиллированная вода	- до 1,0 л

pH - 6,1 доводится 10 %-ным раствором лимонной кислоты.

Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при температуре 100 °С по 20 мин в течение 3 дней.

Консервант Алсевера и дефибринированную кровь соединяют поровну. Консервированную кровь хранят при температуре 4 ± 1 °С.

7.4. Порядок контроля качества питательных сред

Питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней микрофлоры, используемые в диагностике холеры, подлежат обязательной проверке.

Бактериологический контроль качества плотных и жидких питательных сред могут проводить лаборатории противочумных и других учреждений, имеющие разрешение на работу с возбудителем холеры, применяя для контроля тест - штаммы Vibrio cholerae P-1 (145) и Vibrio cholerae eltor M-878, а также лаборатории особо опасных инфекций центров госсанэпиднадзора и ведомственных учреждений с использованием тест-штамма авирулентного холерного вибриона не О1 серогруппы Р-9741 в порядке, определяемом действующими методическими указаниями по контролю питательных сред.

Бактериологическому контролю подлежит каждая серия сухой среды производственного выпуска, имеющая номер государственной регистрации, лицензии на ее производство и соответствующий срок годности, а также среды лабораторного изготовления.

На контроль направляют часть общего объема среды, предназначенного для проведения исследований, в количестве 200 мл агара и 100 мл основного раствора пептона производственного выпуска и в двойном объеме для серий лабораторного изготовления. В направлении следует указать название среды, предприятие-изготовитель, номер серии и срок годности сухой среды, дату контролируемой варки. Транспортируемые образцы должны быть надежно упакованы, флаконы с жидкой средой закрыты резиновыми пробками.

Оптимальный срок проверки питательной среды 10 - 14 дней после приготовления.

При положительном результате контроля пробы соответствующая серия сухой среды считается пригодной к использованию. Последующий контроль этой серии среды осуществляется ежегодно, а также при изменении условий приготовления сухой среды, независимо от времени предыдущей проверки.

Если при первом контроле среда оказалась непригодной, необходим повторный бактериологический контроль этой же серии сухой среды, при этом на контроль необходимо направлять образец новой варки и навеску сухой среды этой же серии.

При получении отрицательного результата повторного контроля среды, приготовленной на месте, и положительного бактериологического контроля образца этой же серии сухой среды, сваренного в лаборатории контролирующего учреждения, следует считать пригодной данную серию сухой питательной среды и принять меры к выяснению и устранению ошибки в технологии местного изготовления.

При получении отрицательного результата, на образец сухой среды данной серии направляют рекламацию в адрес учреждения-изготовителя и ГИСК им. Тарасевича.

Срок хранения щелочного агара и основного раствора пептона производственного выпуска (сухая среда и приготовленные из нее образцы) указаны в инструкции предприятия-изготовителя по применению среды.

Для сред лабораторного изготовления определены следующие сроки хранения:

• для щелочного агара - 6 месяцев с момента изготовления, и первичного контроля по истечению этого срока допускается переконтроль и продление срока годности еще на 3 месяца;

• для основного раствора пептона - 2 года с контролем качества среды после приготовления, затем спустя 1 - 1,5 года хранения.

Срок хранения 1 %-ной пептонной воды, при герметичной упаковке (резиновые пробки и металлические колпачки) - 2 месяца, а после переконтроля возможно продление срока хранения на 1 месяц.

Питательные среды, готовые к употреблению, хранят в темном прохладном месте (6 - 20 °С), не допуская перепада температур больше чем на 5 °С. Подъем и снижение температур губительно действуют на биологические свойства сред.

Щелочной агар и основной пептон, контролируемые авирулентным тест-штаммом холерного вибриона, подлежат периодической перепроверке по согласованию с территориальными центрами госсанэпиднадзора и противочумными учреждениями, на базе последних вирулентными тест-штаммами. Ежегодному контролю в территориальном противочумном учреждении подлежит также теллурит калия.

8. Методы серологической диагностики холеры

Серологические методы исследования, как правило, имеют дополнительное значение и лишь в отдельных случаях, при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа, их результаты могут быть решающими.

Для серологической диагностики холеры используют иммунологические реакции, выявляющие в сыворотке крови больных, переболевших и вибриононосителей, а также вакцинированных специфические антитела: агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела.

У больных холерой на 5 - 7 день от начала заболевания появляются агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела в высоких титрах. Титры антитоксинов нарастают более медленно.

Необходимо исследовать парные сыворотки с интервалом в 7 - 10 дней. Первая проба должна быть взята на 2 - 3 день болезни, а вторая - через 5 - 7 дней для оперативной диагностики и через 7 - 10 дней и более - для ретроспективной.

Кровь для серологических исследований берут из вены, а при отсутствии такой возможности из пальца. Из вены берут 1 - 5 мл крови, после свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной стеклянной палочкой или платиновой петлей. Пробирки сохраняют в холодильнике и транспортируют в лабораторию охлажденными (в термосе, сумке-холодильнике и др.). В лаборатории сыворотку инактивируют при температуре (56,0 ± 0,5) °С 30 минут.

Если кровь забирают в день постановки реакции, пробирки со свернувшейся кровью необходимо центрифугировать 10 - 15 минут при 3000 об./мин. При отсутствии возможности исследовать сыворотку немедленно ее сохраняют в ампулах при температуре (4,0 ± 0,5) °С. Кровь из пальца берут в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый флакон или пробирку с 1,6 мл 0,9 % раствора хлорида натрия (1:5).

8.1. Определение агглютининов в сыворотке крови

Обнаружение противохолерных антител методом развернутой реакции агглютинации. Исследуемую сыворотку разводят 1 %-ной пептонной водой рН 7,5 ± 0,1 в объеме 1 мл от 1:10 до 1:640. В качестве антигена используют 3 часовую бульонную культуру, выделенную в данном очаге, или исследуют в 3 рядах с культурами холерных вибрионов (сероваров Огава, Инаба и О139 серогруппы). В пробирку с раститрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 ч в термостат, затем до утра в холодильник при температуре (4,0 ± 0,5) °С, после чего отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки.

При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3 - 4 креста.

Результат исследования сыворотки больного при реакции агглютинации в разведении 1:40 и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с диагностикумом эритроцитарным холерным антигенным.

РНГА предназначена для выявления полных антител в сыворотке крови. Это достаточно специфичная и чувствительная двухкомпонентная реакция. По чувствительности значительно превосходит реакцию агглютинации. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и микрообъемах изложены в наставлении к диагностикуму эритроцитарному холерному антигенному.

Результат исследования сыворотки больного в разведении 1:40 и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител.

Реакция нейтрализации антигена (РНАг)

РНАг служит для выявления антител в сыворотке крови с использованием диагностикума эритроцитарного холерного иммуноглобулинового. РНАг - высокоспецифическая трехкомпонентная реакция. Ее принцип заключается в специфической нейтрализации добавляемого антигена полными и неполными антителами, содержащимися в сыворотке. Необходимые ингредиенты, методика постановки в макро- и микрообъемах изложены в инструкциях по применению к диагностикуму эритроцитарному холерному иммуноглобулиновому.

При использовании системы реакций РНГА и РНАг отпадает необходимость в постановке контроля специфичности с каждой исследуемой сывороткой, т.к. эти две реакции взаимно контролируют полученные результаты.

Результат исследования сыворотки больного в РНАг в разведении 1:50 (1:80) и выше считается ориентировочно положительным.

Диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титров антител при исследовании парных сывороток в РНГА и РНАг.

8.2. Определение вибриоцидных антител в сыворотке крови (РВА)

Вибриоцидные антитела в крови больных обнаруживаются с 1 - 3 дня болезни в титрах 10^-1 - 10^-3 и достигают максимальных значений 10^-4 - 10^-8 к 10 - 12 дню. Принцип метода во всех его вариантах заключается в том, что в присутствии вибриоцидных антител не происходит размножения холерных вибрионов.

При проведении серологических исследований в очаге, обусловленном возбудителем холеры определенного серовара, в реакции используют один штамм соответствующего серовара, при отсутствии этих данных - два штамма обоих сероваров.

Материалы и оборудование.

• исследуемые сыворотки, инактивированные прогреванием 30 мин при температуре (56,0 ± 0,5) °С;

• сухой комплемент или свежеполученная сыворотка морской свинки в разведении 1:20;

• 0,9 %-ный раствор хлорида натрия рН 7,2 ± 0,1;

• штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные в S-форме, не чувствительные к комплементу;

• чашки Петри со щелочным агаром;

• лоток со льдом;

• термостат на (37,0 ± 1,0) °С.

Методика постановки реакции.

Комплемент, разведенный 0,9 %-ным раствором хлорида натрия 1:20, разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В первую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания последовательно переносят по 0,1 мл до разведения 10^-10, получая десятикратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титрацию сыворотки проводят на льду, который помещают в любую емкость.

Из односуточной агаровой культуры холерного вибриона готовят взвесь в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия, содержащего в 1 мл 10000 - 20000 м.к. Стерильной градуированной пипеткой полученную взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститрованной сывороткой.

Необходимы следующие контроли: а) контроль комплемента (0,9 мл комплемента и 0,1 мл культуры); б) контроль сыворотки (0,8 мл 0,9 %-ного раствора хлорида натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл культуры); в) контроль культуры (0,9 мл 0,9 %-ного раствора хлорида натрия и 0,1 мл культуры).

Штатив с пробирками на 1 ч помещают в водяную баню или термостат при температуре (37,0 ± 0,5) °С, сделав предварительно высев из пробирки контроля культуры на 2 пластинки щелочного агара для определения фактической концентрации живых вибрионов в опытной суспензии (контроль разведения).

Через 1 ч штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высевают на чашку со щелочным агаром рН 7,0 ± 0,1. Посев равномерно распределяют по поверхности чашки покачиванием или шпателем. Чашки помещают на 18 - 24 ч в термостат при температуре (37,0 ± 0,5) °С, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

В посевах из контрольных пробирок с культурой должно вырастать количество колоний, близкое к контролю разведения.

Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает гибель не менее чем 50 % клеток холерного вибриона, что выявляется при посеве на агаровые пластинки в чашки Петри, по сравнению с количеством выросших колоний из пробирки контроля комплемента.

Пример вычисления; при посеве из опытных пробирок с разведением сыворотки 10^-1; 10^-2; 10^-3; 10^-4; 10^-5; 10^-6; 10^-7 и т.д. на чашках соответственно выросло 0; 0; 5; 10; 15; 30; 38 и т.д. колоний. При высеве из пробирки контроля комплемента также после часовой инкубации при температуре (37,0 ± 0,5) °С выросло 36 колоний, 50 % от этого числа будет составлять 18. Из 5-й пробирки выросло 15 колоний, т.е. меньше 50 % от количества колоний в контроле (18), в следующей - 30, т.е. более 50 % этого же показателя. Разведение сыворотки в 5-й пробирке составляет 10^-5, следовательно, вибриоцидный титр в данном примере будет составлять 10^-5.

Определение вибриоцидных антител (ВА) в сыворотке крови на основе ферментации углеводов.

Об отсутствии или наличии ВА судят по ферментации сахарозы, регистрируемой с помощью индикатора.

Материалы и оборудование.

• инактивированная сыворотка крови;

• штаммы холерного вибриона серовара Огава и Инаба;

• комплемент, разведенный 1:20 1 %-ной пептонной водой, содержащей 1 % сахарозы и 1 % индикатора Андреде.

• термостат на (37,0 ± 1) °С.

Методика постановки реакции.

Комплемент, разведенный 1:20 1 %-ной пептонной водой с сахарозой и индикатором Андреде разливают в пробирки по 0,45 мл. В первую пробирку добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки и после тщательного перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. (до разведения 10^-5 - 10^-9). Готовят суспензию 18 - 20-часовой агаровой культуры холерного вибриона и разводят 1 %-ной пептонной водой до концентрации 10³ м.к./мл. в 1 мл. Во все пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают в термостат.

Постановку реакции сопровождают следующими контролями:

• 0,45 мл 1 %-ной пептонной воды, содержащей 1 % сахарозы и 1 % индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыворотки + 0,45 мл взвеси культуры - контроль сыворотки;

• 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль комплемента;

• 0,45 мл 1 %-ной пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,45 мл культуры - контроль культуры;

• 0,45 мл 1 %-ной пептонной воды с сахарозой и индикатором + 0,05 мл исследуемой сыворотки - контроль стерильности сыворотки.

Через 5 - 6 ч проводят учет реакции. При этом в контроле (кроме контроля стерильности сыворотки) цвет содержимого пробирок должен перейти в красный или розовый. Изменение цвета индикатора в пробирках рабочего ряда, связанное с ферментацией сахарозы размножившимися вибрионами, свидетельствует об отсутствии вибриоцидных антител в исследуемой сыворотке. За вибриоцидный титр принимают то наибольшее разведение сыворотки, при котором цвет содержимого пробирок остается неизмененным или интенсивность его значительно отличается от окраски контрольных проб. Результат выражают в виде десятичного логарифма разведения сыворотки, взятого с обратным знаком.

Примечание. Для постановки РВА при холере, обусловленной холерным вибрионом О139 серогруппы, не может быть использован выделенный в очаге штамм в связи с возможной чувствительностью его к комплементу. В этих случаях рекомендуется предложенный специалистами Ростовского НИПЧИ, ctx^- клон холерного вибриона О139, направленный на депонирование в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» (РосНИПЧИ «Микроб»).

8.3. Определение токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови

РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД) предназначена для выявления токсиннейтрализующих антител в сыворотке крови больных холерой и вибриононосителей, у которых инфицирование обусловлено холерными вибрионами О1 и О130 серогрупп. Токсиннейтрализующие антитела появляются на 5 - 7 день болезни, достигая максимума на 14 - 21 день, затем их титр постепенно снижается. Иммуноглобулины к холерному токсину, в сравнении с вибриоцидными и другими специфическими холерными антителами, дольше циркулируют в сыворотке крови после перенесенной инфекции (до 8 - 10 и более месяцев). Условно положительным титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1:160 и выше. Целесообразно исследовать парные сыворотки. Результат РНГА с ЭХЭД позволяет сделать заключение о токсигенности (эпидемичности) циркулирующего в очаге штамма холерного вибриона, в т.ч. и без выделения культуры.

Приложение 1
(рекомендуемое)

Направление проб от людей

Приложение 2
(рекомендуемое)

Направление проб из объектов окружающей среды

Приложение 3
(обязательное)

Укладка для забора нативного материала от больного с подозрением на заболевание холерой (для лечебно-профилактических учреждений специального назначения, станций скорой и неотложной медицинской помощи, амбулаторно-поликлинических учреждений, СКП, СКО, ПСКП)

Приложение 4
(обязательное)

Укладка для забора проб из объектов окружающей среды на холеру (для центров госсанэпиднадзора)

Приложение 5
(справочное)

Перечень коммерческих иммунобиологических препаратов для диагностики холеры

Приложение 6
(рекомендуемое)

Способ отбора колоний вибрионов с помощью стереоскопического микроскопа в косо проходящем свете

Принцип метода заключается в том, что при просмотре колоний различных микробов под малым увеличением микроскопа или лупы при освещении их пучком света, косо падающим на поверхность агара, колонии приобретают способность светиться и кажутся окрашенными.

К стереоскопическому микроскопу МБС-2 или МБС-1 приспосабливают устройство для получения узкого пучка света и зеркало от микроскопа на подвижном шарнире для освещения чашки снизу под углом 45 - 50 °С.

Чашки с посевами просматривают после 12 - 18 ч инкубации. При величине угла падения луча света к поверхности агара в 40 - 50 °С колонии вибрионов по своей окраске заметно отличаются от других микроорганизмов.

Цвет колоний, выросших на щелочном агаре, при косом освещении:

Приспособления для просмотра колоний в косо проходящем свете.

1. Столик стереоскопического микроскопа МБС-1 или МБС-2 заменяют специальным приспособлением для освещения чашки снизу под углом 45 - 50°. Источником света служит осветитель от микроскопа, на который надевают кожух с отверстием диаметром 5 мм против спирали лампочки для получения узкого пучка света. Узкий пучок света направляют в центр вогнутого зеркала, которое перемещается на подвижном шарнире поворотом винта в зависимости от необходимости угла падения света. Угол вычисляют по соотношению расстояния от зеркала до чашки, которое меняется произвольно, и расстояние от чашки до поверхности стола, остающегося неизменным.

Для удобства исследования осветитель и зеркало можно вмонтировать в ящик со стеклянной крышкой, на которую помещают чашку с посевом. Это дает возможность быстро находить нужный угол падения света, передвигая зеркало поворотом винта по вмонтированной шкале.

2. Приспособление, смонтированное из основных узлов стереоскопического микроскопа БМС-1 и прибора для счета колоний.

Из раструба верхней крышки прибора для подсчета колоний удалить оба стекла вместе с упорным кольцом и снять верхнюю крышку. Из скобы передней панели вывинтить вертикальную ось, после чего убрать диск со светофильтрами. Освободить два винта, прикрепляющие патрон лампочки освещения к кронштейну на задней панели. В крышку снизу вставить вертикальную штангу от узла лупы с таким расчетом, чтобы в рабочем положении прибора муфта с прижимным винтом оказалась на дне под кронштейном импульсного счетчика. В муфту зажать держатель с угловыми губками (из комплекта лабораторного штатива), предварительно укороченный до 110 мм. Держателем закрепить патрон с лампочкой в вертикальном положении. Крышку фиксировать винтами на своем обычном месте.

Штатив микроскопа МБС-1 вместе с бинокулярной насадкой отсоединить от столика и установить непосредственно на корпус прибора для счета колоний так, чтобы 3 сферических ножки основания штатива охватили раструб крыши прибора, а окно основания было обращено к наблюдателю. Подлежащие к просмотру чашки с посевами устанавливают над открытым окном. Нужную освещенность и угол падения света находят изменением положения лампы, которое достигается поворотом штанги, после чего последнюю фиксируют цанговым зажимом.

Приложение 7
(рекомендуемое)

Журнал регистрации микробиологических исследований материала от больных (трупов) людей с подозрением на холеру и другие карантинные инфекции

Продолжение таблицы

Приложение 8
(рекомендуемое)

Журнал регистрации микробиологических исследований проб из объектов окружающей среды

Приложение 9
(рекомендуемое)

Журнал идентификации культур холерных вибрионов

Продолжение таблицы

Продолжение таблицы

Продолжение таблицы

Продолжение таблицы

Продолжение таблицы

Примечание: * - таксономическое определение, токсигенность с указанием метода определения, чувствительность к антибиотикам (значения МПК, мкг/мл); при необходимости дифференциации от других видов патогенных вибрионов добавляют тесты: рост без NaCl; расщепление салицина, дульцита, целлобиозы, тест на β -галактозидазу, наличие нитратредуктазы.

Приложение 10
(обязательное)

Журнал учета выделенных штаммов микроорганизмов (форма № 513/у)

Приложение 11
(обязательное)

Паспорт штамма