Министерство сельского хозяйства и продовольствия
Российской Федерации
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

ПИСЬМО

от 6 сентября 1994 года № 13-7-2/150

Методические указания
по лабораторным исследованиям на трипаносомозы
лошадей, верблюдов, ослов, мулов и собак

(с изменениями на 27 января 1997 года)

Документ с изменениями, внесенными:
письмом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России
от 27 января 1997 года № 13-7-2/838.

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель начальника

Департамента ветеринарии

В.М. Авилов

1. Общие положения

1.1 Трипаносомозы (су-ауру, случная болезнь) - протозойные болезни животных, протекающие преимущественно хронически.

Су-ауру вызываются Trypanosoma evansi поражает верблюдов, лошадей, ослов, мулов и собак. Заболевание сопровождается анемией, увеличением лимфатических узлов, особенно шейных, отеком головы и нервными явлениями.

Случная болезнь вызывается Trypasoma equiperdum и характеризуется появлением отеков половых органов, язв на коже, парезом и параличом лицевых и крестцовых нервов. Болеют лошади, ослы, мулы.

1.2. Диагноз на трипаносомозы ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований (на случную болезнь - микроскопического, серологического; на су-ауру - микроскопического, биологического, серологического и формалиновой реакции).

1.3. В лаборатории для исследования направляют:

на су-ауру - тонкие мазки крови периферических сосудов (уха, хвоста, венчика) от подозреваемого в заболевании животного или сердце, часть печени, селезень, лимфатические узлы от павшего. Исследование крови в раздавленной капле можно проводить в хозяйстве: на случную болезнь - соскобы с примесью крови из различных мест слизистой оболочки влагалища, мочеиспускательного канала, сперму, экссудат из надрезов отеков и бляшек.

Соскобы из различных мест слизистой оболочки уретры берут с помощью уретральной ложки. Для этого жеребца фиксируют и вводят внутримышечно в области крупа рометар в дозе 7,5 см3 на 100 кг массы тела. Через 7 - 10 мин вводят уретральную ложку на глубину 5 - 6 см и делает 3 - 4 возвратно-поступательных движения по стенке уретра. После чего уретральную ложку осторожно извлекают, опускают материал в пробирку физиологического раствора pH 7,0 - 7,2 и закрывают резиновой пробкой.

Сперму от жеребцов получают на искусственную вагину, переливают в стерильные пробирки по 2 см3 и закрывают пробками.

Соскобы со стенок влагалища берут уретральной ложкой через влагалищное зеркало. Материал осторожно опускают в пробирку с 2 см3 физиологического раствора pH 7,0 - 7,2 и закрывают пробкой. Экссудат из надрезов отеков и бляшек собирают шприцем, переносят в пробирку и закрывают пробкой.

Для серологического исследования направляют 1 - 2 см3 сыворотки крови, нативной или консервированной 5 %-ным раствором фенола (1 капля на 1 см3 сыворотки) или сухой борной кислотой (2 - 4 % к объему); для биологического - гепаринированную (5 Ед. гепарина на 1 см3 крови) или цитрированную (1 капля 6 %-ного водного раствора лимонно-кислого натрия на 1 см3 крови).

Мазки упаковывают в чистую бумагу, патологический материал во влагонепроницаемую тару.

(Измененная редакция. Изм. от 27.01.1997 г.)

1.4. Патологический материал доставляют в лабораторию в термосе со льдом не позднее 4 ч, кровь и сыворотку - не позднее 2 дней с момента взятия.

2. Микроскопическое исследование

2.1. При исследовании на месте каплю крови периферических сосудов наносят на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют в раздавленной капле под средним увеличением микроскопа в затемненном поле зрения.

Пробирки с соскобами, экссудатом и спермой помещают в термостат при 37 °С на 15 - 20 мин. Затем берут 3 - 4 капли из разных слоев содержимого пробирки и готовят препараты, как указано выше.

При микроскопии обнаруживают живых трипаносом по колебанию ундулирующей мембраны.

(Измененная редакция. Изм. от 27.01.1997 г.)

2.2. Из доставленных соскобов, экссудата, спермы, каждого органа делают по 2 тонких мазка и высушивают на воздухе.

Мазки крови периферических сосудов, из внутренних органов, соскобов экссудата и спермы фиксируют этиловым ректификованным спиртом массовой долей 96 % в течение 20 - 25 мин, окрашивают по Романовскому 30 - 50 мин (краску Гимза используют в разведении 1:20), промывают дистиллированной или водопроводной водой pH 7,0 - 7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа.

При микроскопии необходимо учитывать, что трипаносомы вызывающие су-ауру и случную болезнь, морфологически не дифференцируются, имеют веретенообразную форму, заостренную с переднего и слегка округленную с заднего конца. Цитоплазма трипаносом окрашивается в синевато-фиолетовый цвет, ядро - в красный, кинетопласт и жгутик - в розовый (интенсивность окрашивания зависит от времени окраски, качества краски).

(Измененная редакция. Изм. от 27.01.1997 г.)

3. Биологическое исследование

3.1. Заражение лабораторных животных проводят в случае получения отрицательных результатов микроскопического исследования на су-ауру и наличии клинических признаков у больного животного, а также при необходимости дифференциации су-ауру от случной болезни.

3.2. Для заражения используют нативную, консервированную кровь или суспензию из паренхиматозных органов.

Кусочки органов массой 1,0 - 1,5 г измельчают и тщательно растирают в стерильной ступке с 1 - 2 см3 физиологического раствора. Для заражения суспензию разводят стерильным физиологическим раствором pH 7,0 - 7,2 в соотношении 1:10.

3.3. Консервированную или нативную кровь вводят подкожно в области спины или внутриутробно в нижней трети живота, суспензию из паренхиматозных органов - подкожно в дозе 0,4 см3 3 белым мышам массой 12 - 15 г.

3.4. Наблюдение за зараженными белыми мышами ведут в течение 10 дней.

3.5. Гибель белых мышей наступает через 3 - 4 дня. Из паренхиматозных органов павших животных делают тонкие мазки, окрашивают как указано в п. 2.2 и исследуют на наличие возбудителя су-ауру, так как возбудитель случной болезни в организме белой мыши не размножается.

При отсутствии гибели зараженных животных в указанные сроки, от них, начиная с 5 дней после заражения, ежедневно исследуют кровь, взятую из хвостовой вены, на наличие возбудителя су-ауру в раздавленной капле или окрашенном препарате.

4. Серологическое исследование

4.1. Исследование сывороток крови лошадей, ослов, мулов и собак проводят в реакции связывания комплемента (РСК), верблюдов - в формалиновой реакции (ФР).

4.2. Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

4.2.1. Компоненты реакции и подготовка их к работе.

Компоненты реакции:

- антиген трипаносомный жидкий или лиофилизированный, используют в рабочем разведении, указанном на этикетке;

- комплемент - нативная, консервированная или сухая (изготовленная на биофабрике) сыворотка крови морской свинки. При использовании сухого комплемента содержимое необходимого количества ампул растворяют в физиологическом растворе и сливают в одну пробирку. Полученный раствор комплемента используют для титрования (в разведении 1:20) и главного опыта;

- гемолитическая сыворотка (гемолизин) с титром не ниже 1:1000, которую используют в реакцию в удвоенном титре. Например, при титре гемолизина 1:1000 его берут в реакцию в разведении 1:500. Гемолизин титруют 1 раз в 3 мес. по общепринятой схеме:

испытуемая, трипаносомная и нормальная сыворотки, разведенные для главного опыта и титрования комплемента, инактивируют при 60 - 62 °С (сыворотки ослов, мулов - при 64 - 65 °С) - 30 мин;

- 2,5 %-ная взвесь эритроцитов барана, отмытых физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500 - 3000 об/мин в течение 10 - 15 мин до полной прозрачности надосадочной жидкости.

Перед постановкой реакции готовят разведение каждого компонента в соответствии с указаниями на этикетках и в количестве, необходимом для всего опыта, включая титрование.

В процессе работы не допускается дополнительно разводить компоненты, смешивать их с ранее разведенными и использовать в реакции без титрования.

Физиологический раствор - 0,85 %-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде pH 7,0 - 7,2 готовят в день постановки реакции и кипятят в течение 5 мин.

Гемолитическую систему готовят путем смешивания равных объемов 2,5 %-ной взвеси эритроцитов и гемолизина в удвоенном титре, выдерживают ее при комнатной температуре в течение 20 - 30 мин.

4.2.2. Титрование комплемента в гемолитической системе проводят при получении каждой новой серии сухого комплемента или при использовании нативной сыворотки крови морской свинки.

4.2.3. Титрование комплемента в бактериолитической системе проводят перед каждой постановкой реакции на 3 сыворотках: позитивной (трипаносомной), негативной и одной из опыта. Сыворотки, разведенных физиологическим раствором 1:5, инактивируют, как указано в п. 4.2.1, и разливают каждую 2 ряда пробирок штатива Флоринского по 0,2 см3. Комплемент титруют в разведении 1:20, начиная с дозы 0,02 см3 и до 0,2 см3 с интервалом 0,02 см3.

Для более точной дозировки рекомендуется приготовить в дополнительном ряду пробирок необходимые разведения комплемента в 10-кратных объемах и аппаратом Флоринского с пипетками объемом 0,2 см3 перенести разведения комплимента в ряды с сыворотками для титрования.

Порядок внесения компонентов и режим титрования указаны в таблице 1 на примере негативной сыворотки.

Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное количество его, вызывающего полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также с трипаносомной сывороткой без антигена, при полной задержке гемолиза в пробирках с трипаносомной сывороткой и антигеном (в таблице 1 титр равен 0,12).

Для главного опыта берут дозу комплемента, полученную при титровании.

4.2.4. Общее количество комплемента для главного опыта определяют по формуле:

где X - количество комплемента для главного опыта;

Т - титр комплемента в бактериологической системе;

П - количество пробирок в опыте;

20 - разведение комплемента при титровании.

Например, в опыте 100 пробирок, титр комплемента 0,12, расчет его на опыт:

Необходимое количество разведенного комплемента для реакции равно 20 см3 (0,2×100), следовательно, к 0,6 см3 основного разведения комплемента нужно добавить 19,4 см3 физиологического раствора.

4.2.5. Постановка главного опыта.

Реакцию ставят в объеме 1,0 см3 по 0,2 см3 каждого компонента.

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Для этого в первую пробирку вносят 0,1 см3 сыворотки и добавляют 0,4 см3 физиологического раствора (разведение 1:5). Из первой пробирки переносят 0,2 см3 во вторую и 0,1 см3 - в третью, куда добавляют 0,1 см3 физиологического раствора (разведение 1:10) и инактивируют как указано в п. 4.2.1.

Таблица 1

Компоненты реакции

Ряды пробирок

Номера пробирок

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Инактивированная негативная сыворотка 1:5

Первый

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Второй

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Комплемент в разведении 1:20

Первый

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Второй

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

Физиологический раствор

Первый

0,18

0,16

0,14

0,12

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02

-

Второй

0,18

0,16

0,14

0,12

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02

-

Антиген в рабочем разведении

Первый

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Второй

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Физиологический раствор

Первый

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Второй

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Водяная баня 20 мин. при 37 - 38 °С.

Титрование комплемента в бактериологической системе.

(на примере негативной сыворотки)

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,2 см3 трипаносомного антигена в рабочем разведении, в пробирки первого ряда - по 0,2 см3 физиологического раствора, во все пробирки - по 0,2 см3 комплемента в установленном титре.

Реакцию помещают в водяную баню на 20 мин при 37 - 38 °С, затем, в каждую пробирку вносят по 0,4 см3 гемолитической системы и вновь выдерживают в бане при том же режиме.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в одной пробирке с разведением сыворотки 1:5, для чего с 0,05 см3 сыворотки аппаратом Флоринского вносят 0,2 см3 физиологического раствора. Все сыворотки, давшие положительный или сомнительный результат, подлежат переисследованию в 3 пробирках, как указано выше.

4.2.6. Контроли главного опыта:

позитивная сыворотка в разведениях от 1:5 до ее предельного титра с антигеном и в разведении 1:5 без антигена, негативная - в тех же разведениях, что и испытуемые;

антиген в двойной дозе без сыворотки (на антикомплементарность);

антиген в двойной дозе без сыворотки и комплемента (на гемотоксичность).

4.2.7. Учет и оценка результатов реакции.

Результаты реакции учитывают дважды, сразу после выдержки в водяной бане и на следующий день при хранения реакции в холодильнике.

Сначала учитывают результаты контролей:

в пробирках с положительной сывороткой и антигеном в контроле на гемотоксичность должна быть полная задержка гемолиза;

в пробирках с негативной сывороткой с антигеном и без антигена, с позитивной сывороткой без антигена и в контроле на антикомплементарность - полный гемолиз.

Степень гемолиза выражают в крестах:

+ + + + - отсутствие гемолиза;

+ + + - гемолиз 25 % эритроцитов;

+ + - гемолиз 50 % эритроцитов;

+ - гемолиз 75 % эритроцитов;

- - полный гемолиз эритроцитов.

Положительной считают реакцию с оценкой на 2 - 4 креста в разведении 1:5 или 1 - 4 креста в разведении 1:10.

Сомнительной - 1 крест в разведении 1:5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в обоих разведениях сыворотки.

4.2.8. Животных, с сывороткой крови которых получены сомнительные результаты в РСК, исследуют повторно через 1 месяц. При получении вторично сомнительных результатов животных считают положительно реагирующими.

4.3. Постановка формалиновой реакции.

4.3.1. Формалиновая реакция не является специфической, но ее постановка допускается для обследования верблюдов.

4.3.2. Компоненты реакции: сыворотка крови верблюда и формалин массовой концентрации 400 см3/дм3.

4.3.3. Постановка реакции. В чистую сухую пробирку вносят 1 см3 сыворотки и 2 капли формалина, встряхивают, закрывают ватной пробкой и выдерживают 2 дня при комнатной температуре.

4.4.4. Учет и оценка результатов реакции:

положительная - сыворотка становится плотной, иногда мутнеет при опрокидывании пробирки не стекает;

сомнительная - сыворотка слегка густеет, стекает с трудом;

отрицательная - сыворотка остается без изменений.

5. Диагноз считают установленным при получении одного из следующих показателей:

обнаружение трипаносом в мазках из исходного материала или от зараженных животных;

положительный результат серологического исследования;

положительная формалиновая реакция при наличии клинических или эксзоотологических данных.

6. Сроки исследований:

микроскопического - 2 дня,

биологического - 10 дней,

серологического - 4 дня,

формалиновой реакции - 3 дня.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Общие положения. 1

2. Микроскопическое исследование. 2

3. Биологическое исследование. 2

4. Серологическое исследование. 3

5. Диагноз считают установленным при получении одного из следующих показателей: 5

6. Сроки исследований: 6