Министерство сельского хозяйства и продовольствия
Российской Федерации
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

ПИСЬМО

от 6 сентября 1994 года № 13-7-2/150

Методические указания
по лабораторным исследованиям на трипаносомозы
лошадей, верблюдов, ослов, мулов и собак

(с изменениями на 27 января 1997 года)

Документ с изменениями, внесенными:
письмом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России
от 27 января 1997 года № 13-7-2/838.

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель начальника

Департамента ветеринарии

В.М. Авилов

1. Общие положения

1.1 Трипаносомозы (су-ауру, случная болезнь) - протозойные болезни животных, протекающие преимущественно хронически.

Су-ауру вызываются Trypanosoma evansi поражает верблюдов, лошадей, ослов, мулов и собак. Заболевание сопровождается анемией, увеличением лимфатических узлов, особенно шейных, отеком головы и нервными явлениями.

Случная болезнь вызывается Trypasoma equiperdum и характеризуется появлением отеков половых органов, язв на коже, парезом и параличом лицевых и крестцовых нервов. Болеют лошади, ослы, мулы.

1.2. Диагноз на трипаносомозы ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований (на случную болезнь - микроскопического, серологического; на су-ауру - микроскопического, биологического, серологического и формалиновой реакции).

1.3. В лаборатории для исследования направляют:

на су-ауру - тонкие мазки крови периферических сосудов (уха, хвоста, венчика) от подозреваемого в заболевании животного или сердце, часть печени, селезень, лимфатические узлы от павшего. Исследование крови в раздавленной капле можно проводить в хозяйстве: на случную болезнь - соскобы с примесью крови из различных мест слизистой оболочки влагалища, мочеиспускательного канала, сперму, экссудат из надрезов отеков и бляшек.

Соскобы из различных мест слизистой оболочки уретры берут с помощью уретральной ложки. Для этого жеребца фиксируют и вводят внутримышечно в области крупа рометар в дозе 7,5 см³ на 100 кг массы тела. Через 7 - 10 мин вводят уретральную ложку на глубину 5 - 6 см и делает 3 - 4 возвратно-поступательных движения по стенке уретра. После чего уретральную ложку осторожно извлекают, опускают материал в пробирку физиологического раствора pH 7,0 - 7,2 и закрывают резиновой пробкой.

Сперму от жеребцов получают на искусственную вагину, переливают в стерильные пробирки по 2 см³ и закрывают пробками.

Соскобы со стенок влагалища берут уретральной ложкой через влагалищное зеркало. Материал осторожно опускают в пробирку с 2 см³ физиологического раствора pH 7,0 - 7,2 и закрывают пробкой. Экссудат из надрезов отеков и бляшек собирают шприцем, переносят в пробирку и закрывают пробкой.

Для серологического исследования направляют 1 - 2 см³ сыворотки крови, нативной или консервированной 5 %-ным раствором фенола (1 капля на 1 см³ сыворотки) или сухой борной кислотой (2 - 4 % к объему); для биологического - гепаринированную (5 Ед. гепарина на 1 см³ крови) или цитрированную (1 капля 6 %-ного водного раствора лимонно-кислого натрия на 1 см³ крови).

Мазки упаковывают в чистую бумагу, патологический материал во влагонепроницаемую тару.

(Измененная редакция. Изм. от 27.01.1997 г.)

1.4. Патологический материал доставляют в лабораторию в термосе со льдом не позднее 4 ч, кровь и сыворотку - не позднее 2 дней с момента взятия.

2. Микроскопическое исследование

2.1. При исследовании на месте каплю крови периферических сосудов наносят на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют в раздавленной капле под средним увеличением микроскопа в затемненном поле зрения.

Пробирки с соскобами, экссудатом и спермой помещают в термостат при 37 °С на 15 - 20 мин. Затем берут 3 - 4 капли из разных слоев содержимого пробирки и готовят препараты, как указано выше.

При микроскопии обнаруживают живых трипаносом по колебанию ундулирующей мембраны.

(Измененная редакция. Изм. от 27.01.1997 г.)

2.2. Из доставленных соскобов, экссудата, спермы, каждого органа делают по 2 тонких мазка и высушивают на воздухе.

Мазки крови периферических сосудов, из внутренних органов, соскобов экссудата и спермы фиксируют этиловым ректификованным спиртом массовой долей 96 % в течение 20 - 25 мин, окрашивают по Романовскому 30 - 50 мин (краску Гимза используют в разведении 1:20), промывают дистиллированной или водопроводной водой pH 7,0 - 7,2 до исчезновения следов краски на фильтровальной бумаге, высушивают и исследуют под иммерсионной системой микроскопа.

При микроскопии необходимо учитывать, что трипаносомы вызывающие су-ауру и случную болезнь, морфологически не дифференцируются, имеют веретенообразную форму, заостренную с переднего и слегка округленную с заднего конца. Цитоплазма трипаносом окрашивается в синевато-фиолетовый цвет, ядро - в красный, кинетопласт и жгутик - в розовый (интенсивность окрашивания зависит от времени окраски, качества краски).

(Измененная редакция. Изм. от 27.01.1997 г.)

3. Биологическое исследование

3.1. Заражение лабораторных животных проводят в случае получения отрицательных результатов микроскопического исследования на су-ауру и наличии клинических признаков у больного животного, а также при необходимости дифференциации су-ауру от случной болезни.

3.2. Для заражения используют нативную, консервированную кровь или суспензию из паренхиматозных органов.

Кусочки органов массой 1,0 - 1,5 г измельчают и тщательно растирают в стерильной ступке с 1 - 2 см³ физиологического раствора. Для заражения суспензию разводят стерильным физиологическим раствором pH 7,0 - 7,2 в соотношении 1:10.

3.3. Консервированную или нативную кровь вводят подкожно в области спины или внутриутробно в нижней трети живота, суспензию из паренхиматозных органов - подкожно в дозе 0,4 см³ 3 белым мышам массой 12 - 15 г.

3.4. Наблюдение за зараженными белыми мышами ведут в течение 10 дней.

3.5. Гибель белых мышей наступает через 3 - 4 дня. Из паренхиматозных органов павших животных делают тонкие мазки, окрашивают как указано в п. 2.2 и исследуют на наличие возбудителя су-ауру, так как возбудитель случной болезни в организме белой мыши не размножается.

При отсутствии гибели зараженных животных в указанные сроки, от них, начиная с 5 дней после заражения, ежедневно исследуют кровь, взятую из хвостовой вены, на наличие возбудителя су-ауру в раздавленной капле или окрашенном препарате.

4. Серологическое исследование

4.1. Исследование сывороток крови лошадей, ослов, мулов и собак проводят в реакции связывания комплемента (РСК), верблюдов - в формалиновой реакции (ФР).

4.2. Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

4.2.1. Компоненты реакции и подготовка их к работе.

Компоненты реакции:

- антиген трипаносомный жидкий или лиофилизированный, используют в рабочем разведении, указанном на этикетке;

- комплемент - нативная, консервированная или сухая (изготовленная на биофабрике) сыворотка крови морской свинки. При использовании сухого комплемента содержимое необходимого количества ампул растворяют в физиологическом растворе и сливают в одну пробирку. Полученный раствор комплемента используют для титрования (в разведении 1:20) и главного опыта;

- гемолитическая сыворотка (гемолизин) с титром не ниже 1:1000, которую используют в реакцию в удвоенном титре. Например, при титре гемолизина 1:1000 его берут в реакцию в разведении 1:500. Гемолизин титруют 1 раз в 3 мес. по общепринятой схеме:

испытуемая, трипаносомная и нормальная сыворотки, разведенные для главного опыта и титрования комплемента, инактивируют при 60 - 62 °С (сыворотки ослов, мулов - при 64 - 65 °С) - 30 мин;

- 2,5 %-ная взвесь эритроцитов барана, отмытых физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500 - 3000 об/мин в течение 10 - 15 мин до полной прозрачности надосадочной жидкости.

Перед постановкой реакции готовят разведение каждого компонента в соответствии с указаниями на этикетках и в количестве, необходимом для всего опыта, включая титрование.

В процессе работы не допускается дополнительно разводить компоненты, смешивать их с ранее разведенными и использовать в реакции без титрования.

Физиологический раствор - 0,85 %-ный раствор химически чистого хлорида натрия на дистиллированной воде pH 7,0 - 7,2 готовят в день постановки реакции и кипятят в течение 5 мин.

Гемолитическую систему готовят путем смешивания равных объемов 2,5 %-ной взвеси эритроцитов и гемолизина в удвоенном титре, выдерживают ее при комнатной температуре в течение 20 - 30 мин.

4.2.2. Титрование комплемента в гемолитической системе проводят при получении каждой новой серии сухого комплемента или при использовании нативной сыворотки крови морской свинки.

4.2.3. Титрование комплемента в бактериолитической системе проводят перед каждой постановкой реакции на 3 сыворотках: позитивной (трипаносомной), негативной и одной из опыта. Сыворотки, разведенных физиологическим раствором 1:5, инактивируют, как указано в п. 4.2.1, и разливают каждую 2 ряда пробирок штатива Флоринского по 0,2 см³. Комплемент титруют в разведении 1:20, начиная с дозы 0,02 см³ и до 0,2 см³ с интервалом 0,02 см³.

Для более точной дозировки рекомендуется приготовить в дополнительном ряду пробирок необходимые разведения комплемента в 10-кратных объемах и аппаратом Флоринского с пипетками объемом 0,2 см³ перенести разведения комплимента в ряды с сыворотками для титрования.

Порядок внесения компонентов и режим титрования указаны в таблице 1 на примере негативной сыворотки.

Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное количество его, вызывающего полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также с трипаносомной сывороткой без антигена, при полной задержке гемолиза в пробирках с трипаносомной сывороткой и антигеном (в таблице 1 титр равен 0,12).

Для главного опыта берут дозу комплемента, полученную при титровании.

4.2.4. Общее количество комплемента для главного опыта определяют по формуле:

где X - количество комплемента для главного опыта;

Т - титр комплемента в бактериологической системе;

П - количество пробирок в опыте;

20 - разведение комплемента при титровании.

Например, в опыте 100 пробирок, титр комплемента 0,12, расчет его на опыт:

Необходимое количество разведенного комплемента для реакции равно 20 см³ (0,2×100), следовательно, к 0,6 см³ основного разведения комплемента нужно добавить 19,4 см³ физиологического раствора.

4.2.5. Постановка главного опыта.

Реакцию ставят в объеме 1,0 см³ по 0,2 см³ каждого компонента.

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Для этого в первую пробирку вносят 0,1 см³ сыворотки и добавляют 0,4 см³ физиологического раствора (разведение 1:5). Из первой пробирки переносят 0,2 см³ во вторую и 0,1 см³ - в третью, куда добавляют 0,1 см³ физиологического раствора (разведение 1:10) и инактивируют как указано в п. 4.2.1.

Таблица 1

Титрование комплемента в бактериологической системе.

(на примере негативной сыворотки)

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,2 см³ трипаносомного антигена в рабочем разведении, в пробирки первого ряда - по 0,2 см³ физиологического раствора, во все пробирки - по 0,2 см³ комплемента в установленном титре.

Реакцию помещают в водяную баню на 20 мин при 37 - 38 °С, затем, в каждую пробирку вносят по 0,4 см³ гемолитической системы и вновь выдерживают в бане при том же режиме.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в одной пробирке с разведением сыворотки 1:5, для чего с 0,05 см³ сыворотки аппаратом Флоринского вносят 0,2 см³ физиологического раствора. Все сыворотки, давшие положительный или сомнительный результат, подлежат переисследованию в 3 пробирках, как указано выше.

4.2.6. Контроли главного опыта:

позитивная сыворотка в разведениях от 1:5 до ее предельного титра с антигеном и в разведении 1:5 без антигена, негативная - в тех же разведениях, что и испытуемые;

антиген в двойной дозе без сыворотки (на антикомплементарность);

антиген в двойной дозе без сыворотки и комплемента (на гемотоксичность).

4.2.7. Учет и оценка результатов реакции.

Результаты реакции учитывают дважды, сразу после выдержки в водяной бане и на следующий день при хранения реакции в холодильнике.

Сначала учитывают результаты контролей:

в пробирках с положительной сывороткой и антигеном в контроле на гемотоксичность должна быть полная задержка гемолиза;

в пробирках с негативной сывороткой с антигеном и без антигена, с позитивной сывороткой без антигена и в контроле на антикомплементарность - полный гемолиз.

Степень гемолиза выражают в крестах:

+ + + + - отсутствие гемолиза;

+ + + - гемолиз 25 % эритроцитов;

+ + - гемолиз 50 % эритроцитов;

+ - гемолиз 75 % эритроцитов;

- - полный гемолиз эритроцитов.

Положительной считают реакцию с оценкой на 2 - 4 креста в разведении 1:5 или 1 - 4 креста в разведении 1:10.

Сомнительной - 1 крест в разведении 1:5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в обоих разведениях сыворотки.

4.2.8. Животных, с сывороткой крови которых получены сомнительные результаты в РСК, исследуют повторно через 1 месяц. При получении вторично сомнительных результатов животных считают положительно реагирующими.

4.3. Постановка формалиновой реакции.

4.3.1. Формалиновая реакция не является специфической, но ее постановка допускается для обследования верблюдов.

4.3.2. Компоненты реакции: сыворотка крови верблюда и формалин массовой концентрации 400 см³/дм³.

4.3.3. Постановка реакции. В чистую сухую пробирку вносят 1 см³ сыворотки и 2 капли формалина, встряхивают, закрывают ватной пробкой и выдерживают 2 дня при комнатной температуре.

4.4.4. Учет и оценка результатов реакции:

положительная - сыворотка становится плотной, иногда мутнеет при опрокидывании пробирки не стекает;

сомнительная - сыворотка слегка густеет, стекает с трудом;

отрицательная - сыворотка остается без изменений.

5. Диагноз считают установленным при получении одного из следующих показателей:

обнаружение трипаносом в мазках из исходного материала или от зараженных животных;

положительный результат серологического исследования;

положительная формалиновая реакция при наличии клинических или эксзоотологических данных.

6. Сроки исследований:

микроскопического - 2 дня,

биологического - 10 дней,

серологического - 4 дня,

формалиновой реакции - 3 дня.

СОДЕРЖАНИЕ