4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
Азоксистробина (ICIA 5504) и его
геометрического изомера (R 230310)
в семенах и масле рапса и подсолнечника
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3204-14

Москва 2015

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин, Е.В. Довгилевич, А.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 июня 2014 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 июля 2014 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств азоксистробина
(ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310)
в семенах и масле рапса и подсолнечника методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации от 27.05.2013 № 01.00282-2008/0166.27.05.13.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в семенах и масле рапса и подсолнечника в диапазоне 0,25 - 2,5 мг/кг. Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества ICIA 5504 по ИЮПАК: метил(E)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метокси-акрилат.

Структурная формула ICIA 5504:

Молекулярная масса: 403,4.

Эмпирическая формула: C₂₂H₁₇N₃O₅.

Агрегатное состояние: кристаллический порошок.

Цвет, запах: бесцветный, без запаха.

Давление паров: 1,1×10^-7 мПа (при 20 °С).

Коэффициент распределения октанол-вода: K_ow logP = 2,5 (при 20 °С).

Плотность: 1,34 г/см³ (при 20 °С).

Температура плавления: 116 °С.

Растворимость в воде мг/дм³ (25 °С): при pH 5,2 - 6,2; pH 7,0 - 6,7; pH 9,2 - 5,9.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 20 °С): ацетон - 86; ацетонитрил - 340; гексан - 0,057; дихлорметан - 400; метанол - 20; толуол - 55; этилацетат - 130; н-октанол - 1,40.

Азоксистробин стабилен в водных растворах при pH 5 - 7 при комнатной температуре, в том числе при концентрациях менее 1 мкг/кг.

В почве период полураспада 8 недель (лабораторные условия), 2 недели (полевые условия). Основным путем разложения вещества на поверхности почвы является фотолиз (период полураспада 11 дней) с образованием геометрического Z-изомера.

Краткая токсикологическая характеристика. Азоксистробин относится к веществам мало опасным по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД₅₀ для крыс более 2000 мг/кг), но к опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ для крыс (4 ч) от 698 до 962 мг/м³). Не обладает генотоксическим, канцерогенным и нейротоксическим действием.

Область применения. Азоксистробин - фунгицид защитного, куративного и искореняющего действия с трансламинарными и системными свойствами. Подавляет прорастание спор и рост мицелия, обладает антиспорулянтной активностью. В дозах 100 - 375 г/га применяется против мучнистой росы, ржавчины, чешуйчатой пятнистости, пятнистости листьев зерновых, против ржавчины и корневых гнилей на рисе, против милдью виноградной лозы, против ржавчины и корневых гнилей на томате и картофеле, против настоящей и ложной мучнистой росы тыквенных, против корневых гнилей арахиса, цитрусовых, газонных трав. Препарат эффективен против штаммов патогенных грибов, устойчивых к ингибиторам С¹⁴-деметилазы, фенил амидам, дикарбоксимидам и бензимидазолам.

Применяется в России в качестве фунгицида на томатах, огурцах в дозе 0,4 - 0,5 дм³/га, на винограде в дозе 0,6 - 0,8 дм³/га и на зерновых в дозе 0,5 - 1,0 дм³/га. Проходит регистрационные испытания в России на посадках картофеля в качестве фунгицида с нормой расхода 3,0 дм³/га.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,03 мг/кг массы человека;

ПДК в воде водоемов 0,01 мг/дм³;

МДУ в продукции (мг/кг): томаты и огурцы - 3,0; виноград - 2,0; клубни картофеля - 0,05; зерно хлебных злаков: ячмень, овес - 0,5; пшеница, рожь, тритикале - 0,3.

МДУ в импортируемой продукции (мг/кг): семена рапса и подсолнечника - 0,5.

R 230310 - Z-геометрический изомер азоксистробина.

Название действующего вещества R-230310 по ИЮПАК: (Z)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.

Структурная формула:

R 230310 представляет собой кристаллический порошок желтого цвета.

Физико-химические свойства близки к физико-химическим свойствам азоксистробина.

1. Погрешность измерения

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Метрологические параметры для азоксистробина (ICIA 5504)
и его геометрического изомера (R 230310)

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата для азоксистробина (ICIA 5504)
и его геометрического изомера (R 230310)

2. Метод измерений

Метод основан на определении азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта на концентрирующих патронах № 1 и колонках с флоризилом.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

3. Средства измерений, реактивы,
вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-91.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С, относительной влажности не более 80 % и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с флоризилом и концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с флоризилом и концентрирующих патронах № 1, установление градуировочных характеристик.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отоптанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/дм³.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.1.4. Очистка этилацетата

Этилацетат промывают равным объемом 5 % раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем этилацетат сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Этилацетат перегоняют при температуре 77,1 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 77,1 °С, отбрасывают.

7.1.5. Очистка хлористого метилена

Хлористый метилен промывают равным объемом 5 % раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °С, отбрасывают.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление рабочих растворов

7.2.1.1. Приготовление 5 % раствора гидрокарбоната натрия.

В мерную колбу на 1000 см³ переносят 50 г гидрокарбоната натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

7.2.1.2. Приготовление 0,1 М раствора соляной кислоты.

Мерной пипеткой отбирают 4,1 см³ концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 см³, куда предварительно наливают около 100 см³ дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 дм³ помещают 500 см³ ацетонитрила и 500 см³ очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см³/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.3. Приготовление градуировочных растворов

7.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией азоксистробина (ICIA 5504) 1,0 мг/см³.

Взвешивают 50 мг азоксистробина (ICIA 5504) в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 1 хранят в холодильнике не более 3 месяцев.

7.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией геометрического изомера азоксистробина (R 230310) 1,0 мг/см³.

Взвешивают 50 мг R 230310 в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 2 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 2 хранят в холодильнике не более 3 месяцев.

7.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 10,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³. Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см³ и помещают в ту же колбу объемом 100 см³, доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор № 3 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор № 3 хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 1,0 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор № 4 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,5 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор № 5 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,2 мкг/см.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор № 6 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,1 мкг/см³.

Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор № 7 используется для хроматографического исследования и для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор хранят в холодильнике не более 1 месяца.

7.2.3.8. Стандартные растворы азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) с концентрацией 25,0; 10,0; 5,0 и 2,5 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы семян рапса и подсолнечника

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 25,0; 10,0; 5,0 и 2,5 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы семян.

7.2.3.9. Стандартные растворы азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) с концентрацией 12,5; 5,0; 2,5 и 1,25 мкг/см³ для внесения в контрольные образцы масла рапса и подсолнечника.

Методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 25,0; 10,0; 5,0 и 2,5 мкг/см³ и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы масла.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см³.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки
экстракта и проверка хроматографического поведения
азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера
(R 230310) на них

7.4.1. Подготовка концентрирующих патронов № 1
для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см³/мин. При работе на патронах № 1 используют очищенную воду.

Патрон № 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люэр объемом не менее 10 см³ (используют как емкость дня элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см³ смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 10 см³ воды. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения азоксистробина
(ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310)
на концентрирующих патронах № 1

Из стандартного раствора азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в ацетонитриле, содержащего по 1 мкг/см³ каждого соединения, отбирают 1 см³, помещают в круглодонную колбу объемом 100 см³ и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 см³ воды, перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 см³, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор сначала обмывают 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:5, затем тремя порциями по 5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ ацетонитрила и хроматографируют. Элюат после прохождения каждой порции упаривают досуха. Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310), полноту смывания с патрона и необходимый объём элюента.

Изучение поведения азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

7.5. Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта и
проверка хроматографического поведения азоксистробина
(ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на ней

7.5.1. Подготовка колонки с флоризилом для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила с зернением 60/100 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флоризила наносят слой безводного серно-кислого натрия толщиной 1 см.

Непосредственно перед использованием колонку последовательно промывают 10 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2, а затем 20 см³ гексана.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на колонке с флоризилом.

Из стандартного раствора азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в ацетонитриле, содержащего по 1 мкг/см³ каждого соединения, отбирают 1 см³, помещают в круглодонную колбу объемом 100 см³ и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см³ этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 см³ гексана, перемешивают и полученный раствор вносят на колонку. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходную колбу последовательно обмывают 20 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2,20 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 2:1 и 4 порциями объёмом 5 см³ каждая смеси гексана с этилацетатом в соотношении 2:8. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310), полноту смывания с колонки и необходимый объём элюента.

Изучение поведения азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флоризила.

7.6. Подготовка и кондиционирование колонки
для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 см³/мин 3 - 4 ч.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» от 21.08.79 № 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ 22391-89 «Подсолнечник. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ Р 52465-05 «Масло подсолнечное. Технические условия», ГОСТ Р 53457-09 «Масло рапсовое. Технические условия», ГОСТ Р 52062-03 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».

Отобранные пробы семян подсолнечника и рапса подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Пробы подсолнечного и рапсового масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 10 суток.

9. Выполнение определения

Анализ образцов должен быть выполнен в течение одного дня.

9.1. Семена рапса

9.1.1. Экстракция и очистка полученного экстракта

Образец измельченных семян рапса массой 10 г помещают в полипропиленовую банку дня экстракции объемом 250 см³, прибавляют 30 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в делительную воронку объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 30 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке объемом 250 см³.

К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия и выпаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением
в системе несмешивающихся растворителей

К остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 50 см³ хлористого метилена, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят в делительную воронку объемом 250 см³. Хлористый метилен промывают последовательно 50 см³ 5 % водного раствора гидрокарбоната натрия, а затем 50 см³ 0,1 М водного раствора соляной кислоты. Водные фракции отбрасывают, а хлористый метилен собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 см³ ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора и помещая на 5 с в ультразвуковую ванну, прибавляют 9 см³ воды, тщательно перемешивают и вносят на предварительно подготовленный патрон, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:5, вносят на патрон, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, вносят на патрон, элюат собирают в концентратор объемом 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 25 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

9.2. Семена подсолнечника

9.2.1. Экстракция и очистка полученного экстракта

Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют 30 см³ ацетонитрила и помещают на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через фильтр низкой плотности в делительную воронку объемом 250 см³. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 30 см³ ацетонитрила и помещая на 5 мин в ультразвуковую ванну. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке объемом 250 см.

К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия и выпаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей».

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с флоризилом

Сухой остаток растворяют в 2 см³ этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 см³ гексана, перемешивают и полученный раствор вносят на колонку, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 20 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 8:2 и 20 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 2:1, элюаты отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 15 см³ смеси гексана с этилацетатом в соотношении 2:8, вносят на колонку, элюат собирают в концентратор объемом 100 см³ и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 25 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1 : 1 и хроматографируют.

9.3. Масло подсолнечника

9.3.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением
в системе несмешивающихся растворителей

Из пробы подсолнечного масла отбирают в стакан навеску массой 5 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 см³ двумя порциями гексана объемом по 25 см³, азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310) экстрагируют тремя порциями по 50, 50 и 30 см³ ацетонитрила, каждый раз интенсивно встряхивая воронку в течение 2 мин. Гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку.

К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия и выпаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей» и п. 9.2.3 «Очистка экстракта на колонке с флоризилом».

Сухой остаток растворяют в 12,5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

9.4. Масло рапса

9.4.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением
в системе несмешивающихся растворителей

Из пробы рапсового масла отбирают в стакан навеску массой 5 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 см³ двумя порциями гексана объемом по 25 см³, азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310) экстрагируют тремя порциями по 50, 50 и 30 см³ ацетонитрила, каждый раз интенсивно встряхивая воронку в течение 2 мин. Гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку.

К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт промывают двумя порциями гексана объемом по 50 см³. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия и выпаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2 «Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей» и п. 9.1.3 «Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1».

Сухой остаток растворяют в 12,5 см³ смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

9.5. Условия хроматографирования

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостной, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С, с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С18.

Предколонка хроматографическая стальная, длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами С8.

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 50:50.

Длина волны: 255 нм.

Время удерживания: первым с колонки выходит геометрический изомер (R 230310), а затем азоксистробин (ICIA 5504).

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

10. Обработка результатов

Содержание азоксистробина или R 230310 в пробах рассчитывают по формуле:

X - содержание азоксистробина или R 230310 в пробе, мг/кг;

S_cm - высота (площадь) пика стандарта, мм;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

Р - содержание азоксистробина или R 230310 в аналитическом стандарте, %.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8×σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,25 мг/кг»*

* - 0,25 мг/кг - предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) проводят при смене основных градуировочных растворов № 1 и 2 каждые три месяца, при смене основных градуировочных растворов № 3, 4, 5, 6 и 7 - каждый месяц, а также в начале и при окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) контрольного измерения, мкг/см³;

С - известная концентрация градуировочного раствора азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

3,73 или 2,71 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (А) превышает 3,73 или 2,71 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов этаметсульфурон-метила, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С_𝜕 должна удовлетворять условию:

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

Δ_л = ±0,84Δ, где

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %. Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

 - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Приложение 1

Полнота извлечения азоксистробина (ICIA 5504)
и его геометрического изомера (R 230310) из семян
и масла рапса и подсолнечника
(5 повторностей для каждой концентрации, Р = 0,95)