4.1. Методы контроля. Химические факторы
Методические указания МУК 4.1.1575-03
«По спектрофотометрическому измерению концентрации амилазы в воздухе рабочей
зоны»
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)
Дата введения: с момента утверждения
Ферментный препарат амилаза, (K 3.2.1.1-α-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза).
М.м. 48000.
Представляет собой пушистый порошок сероватого цвета. Оптимальные условия проявления ферментативной активности: рН 6,5 - 7,5, температура 37 °С. Растворима в воде.
Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.
Обладает общетоксическим действием. Малотоксична при различных путях воздействия на организм. Обладает аллергенным действием на организм.
ПДК в воздухе рабочей зоны - 1 мг/м3.
Характеристика метода
Метод основан на уменьшении количества (концентрации) окрашиваемого йодом крахмала за счёт гидролиза крахмала амилазой (до декстринов различной молекулярной массы).
Измерение производят при длине волны поглощения окрашенного йодом крахмала - 630 - 690 нм (красный светофильтр); оптимум - 660 нм. Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр АФА-ВП-10.
Нижний предел измерения содержания амилазы в анализируемом объёме - 25,0 мкг. Нижний предел измерения концентрации в воздухе при отборе 100 л воздуха - 0,5 мг/м3.
Диапазон измеряемых концентраций 0,5 - 5,0 мг/м3.
Суммарная погрешность измерения не превышает ±20 %.
Время выполнения измерения, включая отбор проб, не более 1,5 часов.
Определению мешают вещества, со светопоглощением в области 630 - 690 нм.
Приборы, аппаратура, посуда
- Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр), ГОСТ 12083, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 434 - 450 нм и 630 - 690 нм с погрешностью ±1 %. абс. (по коэффициенту пропускания) или 0,01 D (по оптической плотности) или спектрофотометр.
- Весы лабораторные ВЛА-200, ГОСТ 24104-88Е.
- Аспирационное устройство, модель 822, ТУ 64-1-862-72.
- Фильтродержатель, ТУ 96-72-05-77.
- Фильтр АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80.
- Прибор для измерения рН среды в диапазоне 0 - 14 с погрешностью измерения ±0,1 рН. рН - 211, ТУ 25-05-1689-74.
- Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева 37,0 ± 0,2 °С, ГОСТ 20790-75.
- Баня водяная, температура 100 °С,
- Мешалка магнитная, ТУ 25-11.834-80.
- Термометры с пределами измерения 0 - 55 °С и ценой деления не более 0,1 °С, ГОСТ 215.
- Холодильник бытовой. ГОСТ 16317-87.
- Стаканчики для взвешивания, ГОСТ 25336-82Е.
- Стаканы вместимостью от 100 до 1000 мл, ГОСТ 25336-82Е.
- Колбы типа Кн вместимостью от 50 до 1000 мл, ГОСТ 25336-82Е.
- Колбы мерные наливные 1 или 2-го исполнения вместимостью 100, 200, 250 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74Е.
- Воронки типа В, ГОСТ 25336-82Е.
- Дозаторы пипеточные П1, объем дозы 0,05 и 0,5 мл. ТУ 64-1-3329.
- Пипетки 1, 2 и 3-го исполнения вместимостью от 0,5 до 20 мл, ГОСТ 29227-91.
- Пробирки П1-21-200, или П1-16-150, или П2-19-180, или П2-16-150 (180), ГОСТ 25336-82Е.
- Бюретка типа 1; 1, 2 или 3-го исполнения. ГОСТ 29227-91.
- Эксикатор, ГОСТ 25336.
- Секундомер, ГОСТ 5072.
- Бумага фильтровальная лабораторная, ГОСТ 12026.
Реактивы, растворы и материалы
- Амилаза, амилолитическая активность 1200 ед., ГОСТ 20264.4-89.
- Крахмал растворимый, ГОСТ 10163.
- Ацетатный буферный раствор, рН 4,7, готовый, ГОСТ 4919.2;
возможно приготовление ацетатного буфера из составляющих (см. раздел «Подготовка к измерению», п. 7).
- Кислота соляная, концентрированная, уд. вес 1,18, 11,6 М/л, ГОСТ 3118-77.
- Йод, ГОСТ 4159-79.
- Калий йодистый.
- Вода дистиллированная. ГОСТ 6709.
Все реактивы должны быть марки х.ч. или ч.д.а.
Подготовка к измерению
1. Приготовление стандартного раствора амилазы, 50 мкг/мл.
5,0 мг препарата растворяют в небольшом количестве воды, при необходимости тщательно растирая стеклянной палочкой, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают (получают раствор с концентрацией амилазы 50 мкг/мл). Раствор хранят в течение суток при температуре от 2 до 6 °С.
2. Приготовление градуировочных растворов амилазы.
Градуировочную характеристику устанавливают с использованием градуировочных растворов (устойчивы в течение 2 часов), которые готовят разбавлением основного раствора амилазы согласно таблице.
Таблица
|
№ градуировочного раствора |
Объем стандартного раствора, мл |
Объем разбавляющего дистиллята, мл |
Конц-я амилазы, мкг/мл |
Содержание амилазы в объеме пробы (5 мл), взятой для анализа, мкг |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
1 |
0,0 |
10,0 |
0,0 |
0,0 |
|
2 |
1,0 |
9,0 |
5,0 |
25,0 |
|
3 |
1,5 |
8,5 |
7,5 |
37,5 |
|
4 |
2,5 |
7,5 |
12,5 |
62,5 |
|
5 |
5,0 |
5,0 |
25,0 |
125,0 |
|
6 |
7,5 |
2,5 |
37,5 |
187,5 |
|
7 |
10,0 |
0,0 |
50,0 |
250,0 |
3. Приготовление 1 %-го раствора крахмала (субстрат амилазы).
1,00 г крахмала, взятого с учетом влажности, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 25 мл воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу еще 25 мл воды, помещают колбу в кипящую водяную баню не менее чем на 10 - 15 мин., непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 мл ацетатного буферного раствора. Объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой. Содержимое колбы перемешивают. Раствор должен быть прозрачным.
Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.
4. Приготовление основного раствора йода, 2,5 мг/мл.
0,50 г йода и 5,00 г йодистого калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве дистиллированной воды.
Содержимое перемешивают на магнитной мешалке при плотно закрытой крышке бюксы. Раствор после полного растворения йода переносят в мерную колбу с притертой крышкой вместимостью 200 мл и объем доводят дистиллированной водой до метки.
Основной раствор йода хранят в течение 1 месяца в склянке из темного стекла с притертой пробкой.
5. Приготовление раствора соляной кислоты, 0,5 М/л.
В мерную колбу (100 мл) наливают примерно 50 мл дистиллята; перемешивая, доливают 4,3 мл концентрированной (11,6 М/л) соляной кислоты; доводят до метки дистиллятом. В герметичной посуде раствор может храниться год.
6. Приготовление рабочего раствора йода, 0,05 мг/мл.
2 мл основного раствора йода разводят раствором соляной кислоты концентрацией 0,5 М/л в мерной колбе вместимостью 100 мл. Перед употреблением рабочего раствора проверяют его оптическую плотность в диапазоне длин волн 434 - 350 (оптимум 442 нм) нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя. 5 мм.
Оптическая плотность (при длине волны 440 нм) рабочего раствора йода должна равняться 0,105 ± 0,01.
В случае отклонения её от этого значения добавляют в раствор несколько капель соляной кислоты или основного раствора йода.
7. Приготовление ацетатного буфера.
В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 2,72 г три гидрата ацетата натрия (мол. м. 136,09). Добавляют 25 мл дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения. Добавляют, перемешивая, дистиллированную воду до метки. Получают 0,2 М раствор ацетата натрия.
В мерную колбу вместимостью 100 мл наливают 25 мл дистиллированной воды. Добавляют, перемешивая, 1,28 г концентрированной уксусной кислоты. Добавляют, перемешивая, дистиллированную воду до метки. Получают 0,2 М уксусную кислоту.
В колбу, вмещающую 100 мл, наливают 54 мл 0,2 М ацетата натрия и затем 46 мл 0,2 М уксусной кислоты. Раствор перемешивают. Получают буферный раствор с рН 4,7.
Проведение измерений и построение градуировочного графика
Гидролиз крахмала.
В две пробирки, наливают по 10 мл раствора крахмала (субстрата) и прогревают в течение 5 - 10 минут в термостате или водяной бане с температурой 37 ± 0,2 °С. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую 5 мл дистиллированной воды (холостая проба), во вторую - 5 мл градуировочного раствора (концентрации указаны в таблице: опытная проба). Смеси быстро перемешивают и выдерживают в термостате 30 мин (по секундомеру).
Окрашивание йодом непрогидролизированного крахмала.
Затем из каждой пробирки поочередно отбирают по 0,05 мл раствора и переносят в пробирки с предварительно налитыми 5,0 мл рабочего раствора йода. Содержимое пробирок перемешивают.
Проведение оптических измерений.
Полученные растворы приобретают следующую окраску: контрольный раствор - синий цвет, опытный - фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизованного крахмала.
Через 5 - 10 мин после смешивания определяют оптическую плотность растворов фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630 - 690 нм (оптимум 660 нм) в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 5,0 мм.
Колориметрирование опытной и холостой проб ведут на фоне дистиллированной воды; определяют соответствующие оптические плотности Д0 и Дx.
Построение градуировочного графика.
Строят калибровочный график, где по оси абсцисс располагают содержание фермента в пробе (5-я графа в таблице), взятой для анализа, а по оси ординат - разность Дx - Д0; график строят по средним значениям разности оптических плотностей для каждой концентрации. На каждую концентрацию производят по 5 параллельных определений.
Проверку градуировочного графика проводят каждый раз при смене реактивов, оборудования или приборов, и не реже, чем 1 раз в месяц.
Определение концентрации амилазы в воздухе рабочей зоны
Отбор проб воздуха
Пробы воздуха с объемным расходом 10 л/мин аспирируют через фильтр АФА-ВП-10. Для определения 0,5 ПДК амилазы необходимо отобрать 100 л воздуха. Срок хранения отобранных проб в холодильнике до 1 суток.
Экстракция амилазы с фильтра.
Фильтр с отобранной пробой помещают в пробирку и приливают пипеткой 5,0 мл дистиллированной воды. Периодически встряхивая, выдерживают раствор в течение 5 мин и сливают в другую пробирку. Аналогичным образом проводят повторную экстракцию с фильтра и объединяют растворы. Общий объем элюата составляет 10,0 мл.
Проведение измерения.
Проведение измерений проводят точно так же, как и при установлении градуировочного графика, отбирая на анализ 5 мл из общего объема элюата. При этом находят значения Дx - Д0, соответствующие данному образцу воздуха.
Если значения оптической плотности выходят за пределы рабочей зоны градуировочного графика амилазы (Дx - Д0 = 0,050 ... 0,450), то опыт необходимо повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание ферментного препарата.
Определение содержания амилазы в анализируемой пробе.
Количественное определение содержания амилазы в пробе, взятой для анализа (объемом 5 мл), проводят по предварительно построенному калибровочному графику, определяя соответствие разности Дx - Д0 содержанию амилазы в пробе (5-я графа таблицы).
Вычисление содержания амилазы в воздухе рабочей зоны.
Концентрацию амилазы в воздухе (САВ) вычисляют по формуле:
а - содержание амилазы в объеме пробы, взятой для анализа (мкг);
б - объем пробы, взятой для анализа (мл);
в - общий объем элюата (мл);
V - объем воздуха (л), отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям (см. Приложение 1).
Приложение 1
Приведение объёма воздуха к стандартным условиям (температура 20 °С и давление 760 мм рт. ст.) проводят по формуле:
Vt - объём воздуха, отобранный для анализа, л;
Р - барометрическое давление, кПа (101,33 кПа = 760 мм рт. ст.);
t - температура воздуха в месте отбора пробы, °С.
Для удобства расчёта V20 следует пользоваться таблицей коэффициентов (приложение 2). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить Vt на соответствующий коэффициент.