4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение массовых концентраций
химических соединений и элементов
в биологических средах

Сборник методических указаний
по методам контроля
МУК 4.1.3037-12; 4.1.3040-12; 4.1.3041-12

Москва 2013

1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (Т.С. Уланова, Н.В. Зайцева, Е.В. Стенно, Г.А. Вейхман, М.А. Баканина, Ю.В. Шардакова, Т.Д. Карнажицкая, А.В. Кислицина).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 7 сентября 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение массовой концентрации бенз(а)пирена
в моче методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

1. Область применения и общие положения

Свидетельство об аттестации от 30.11.2010 № 223.1.0273/01.00258/2010.

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации бенз(а)пирена в моче в диапазоне 0,01 - 4,00 мкг/дм³.

1.2. Методические указания предназначены для использования органами и организациями Роспотребнадзора, а также иными организациями, деятельность которых связана с вопросами гигиены окружающей среды.

1.3. Бенз(а)пирен

Молекулярная масса 252,32.

Бенз(а)пирен (3,4-бензпирен) - светло-желтые кристаллы, температура плавления 175,0 - 180,5 °С, температура кипения 456 °С, плотность 1,351 - 1,282 г/см³. Растворим в ацетонитриле, этаноле, метаноле, гексане, метиленхлориде и других органических растворителях [1]. Растворимость бенз(а)пирена в пресной воде 0,11 мкг/дм³, в соленой воде - 0.13 мкг/дм³ [2]. Присутствует в атмосферном воздухе, природной воде, растениях, копченых продуктах как загрязнитель.

Краткая токсикологическая характеристика

Бенз(а)пирен - вещество 1-го класса опасности. Обладает мутагенным, канцерогенным, эмбриотоксическим и тератогенным эффектами [3].

2. Погрешность измерений

Погрешность измерений, соответствует характеристикам, приведенным в табл. 1.

Таблица 1

Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, воспроизводимости

3. Метод измерений

Измерение концентрации бенз(а)пирена в моче основан на концентрировании 3,4-бенз(а)пирена из мочи методом твердофазной экстракции на полимерном сорбенте Oasis HLB, экстракции с сорбента метиленхлоридом и анализе экстракта на жидкостном хроматографе с использованием флуориметрического детектора.

Определению не мешают ароматические углеводороды, фенол, стирол, полиядерные ароматические углеводороды.

Диапазон измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в моче - 0,01 - 4,00 мкг/дм³. Средняя полнота извлечения свободного бенз(а)-пирена из мочи составляет 92 %.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

4.3. Вспомогательные устройства, материалы

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов иных производителей с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5. Требования безопасности и охраны окружающей среды

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.1.005-88.

5.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают меры безопасности, указанные в руководстве по правилам эксплуатации прибора, правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009, противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и имеют средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83, обучение и инструктаж по безопасности труда проводится в соответствии с ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

5.5. При выполнении измерений на приборе соблюдают правила, указанные в руководстве по правилам эксплуатации жидкостного хроматографа.

6. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоившие метод анализа и получившие удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры выполнения измерений.

7. Условия измерений

7.1. Подготовку и проведение измерений проводят при следующих условиях:

- температура воздуха (20 ± 5) °С, влажность не более 80 %;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.

7.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией прибора.

8. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

8.1. Подготовка посуды

Используемую стеклянную посуду замачивают на 1 ч в хромовой смеси, промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают в сушильном шкафу при температуре 105 °С, ополаскивают ацетонитрилом.

8.2. Приготовление растворов

8.2.1. Элюент для хроматографии. Смесь ацетонитрила с дистиллированной водой в соотношении 60:40 % (объемная доля). Состав элюента задают на двух каналах насоса.

8.2.2. Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 дм³ насыпают 50 г калия двухромовокислого, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм³ концентрированной серной кислоты.

8.2.3. Раствор метиленхлорида в ацетонитриле 1:10 (объемная доля). В мерную колбу объемом 25 см³ вносят 2,27 см³ ацетонитрила, доводят метиленхлоридом до метки и перемешивают содержимое колбы. Срок хранения раствора 5 дней.

8.2.4. Раствор ацетонитрила в воде 50 %-й (объемная доля). В мерную колбу объемом 25 см³ вносят 12,5 см³ ацетонитрила, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают содержимое колбы. Срок хранения раствора 5 дней.

8.2.5. Исходный раствор бенз(а)пирена № 1, концентрация 1 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 1,0 см³ ГСО бенз(а)пирена с концентрацией 100 мкг/см³ и доводят ацетонитрилом до метки. Срок хранения раствора 60 дней при хранении в темном месте при температуре 4 - 6 °С.

8.2.6. Раствор бенз(а)пирена № 2, концентрация 0,025 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 2,5 см³ раствора бенз(а)пирена № 1 и доводят ацетонитрилом до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

8.2.7. Раствор для идентификации бенз(а)пирена, концентрация 0,005 мкг/см³. В мерную колбу вместимостью 25 см³ вносят 5 см³ раствора бенз(а)пирена № 2 для градуировки и доводят содержимое колбы ацетонитрилом до метки. Используют свежеприготовленный раствор.

8.3. Подготовка хроматографической колонки

8.3.1. Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюент со скоростью 1,5 см³/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

8.3.2. Проводят холостую разгонку с установлением ступеней градиента: от 0 до 2,5 мин - 60 % ацетонитрила, от 2,5 до 12 мин - повышение до 90 % ацетонитрила, от 12 до 20 мин - повышение до 100 % ацетонитрила, от 20 до 22,5 мин - 100 % ацетонитрила, от 22,5 до 23 мин - снижение до 60 % ацетонитрила, от 23 до 28 мин - 60 % ацетонитрила.

8.4. Установление градуировочной характеристики

8.4.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме (единицы оптической плотности, е.о.п.) от массовой концентрации бенз(а)пирена (мкг/дм³), устанавливают на градуировочных растворах бенз(а)пирена в ацетонитриле методом абсолютной градуировки. Градуировочную характеристику устанавливают по результатам измерений 6 серий по 5 концентрациям вещества в каждой серии.

8.4.2. Градуировочные растворы готовят в мерных колбах вместимостью 25 см³. Для этого в каждую колбу вносят растворы бенз(а)пирена для градуировки № 1 и 2 в соответствии с табл. 2, доводят до метки ацетонитрилом и перемешивают.

Таблица 2

Градуировочные растворы бенз(а)пирена в ацетонитриле

8.4.3. Анализируют градуировочные растворы в количестве 20 мм³ на жидкостном хроматографе в условиях:

- колонка 4,6×150 мм, заполненная сорбентом Zorbax Eclipse XDB С₁₈;

- градиент: 2,5 мин подача подвижной фазы (60 % ацетонитрила и 40 % воды), увеличение ацетонитрила с 60 до 90 % от 2,5 до 12 мин, увеличение ацетонитрила с 90 до 100 % от 12 до 20 мин, подача 100 % ацетонитрила от 20 до 22,5 мин, снижение ацетонитрила до 60 % в течение 0,5 мин, подача 60 % ацетонитрила до уравновешивания колонки (5 мин);

- скорость движения элюента                              1,5 см³/мин;

- температура термостата колонки                      28 °С;

- флуориметрический детектор:

длина волны возбуждения                            265 нм;

длина волны эмиссии                                   412 нм;

- время удерживания бенз(а)пирена:                  12,5 ± 0,05 мин.

Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

 где

С_i - массовая концентрация бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм³;

S_i - среднее значение трех измерений площади пика бенз(а)пирена i-й концентрации, усл. ед.;

п - количество градуировочных смесей (n = 5).

8.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация бенз(а)пирена соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

|X - С| ≤ 0,10 ∙ С, где

С - заданная массовая концентрация бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм³;

X - результат измерения массовой концентрации бенз(а)пирена в градуировочном растворе, мкг/дм³.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

8.5. Отбор проб

Отбирают пробу мочи объемом не менее 20 см³ в стеклянную тару с плотно закрывающейся крышкой. Срок хранения проб в холодильнике 8 ч.

9. Выполнение измерений

Выполняют два параллельных измерения образца мочи. В коническую пробирку с завинчивающейся крышкой переносят 10,0 см³ мочи и центрифугируют со скоростью 2000 об./мин в течение 5 мин. Отбирают 1,0 см³ верхнего слоя и проводят твердофазную экстракцию, последовательно пропуская под вакуумом через картридж с сорбентом Oasis HLB 1cc 1 см³ раствора метиленхлорида в ацетонитриле (1:10), 1 см³ дистиллированной воды, 1 см³ анализируемой мочи, промывают картридж с нанесенной пробой 1 см³ дистиллированной воды, 0,2 см³ 50 %-го раствора ацетонитрила в воде. Высушивают картридж в токе воздуха с помощью вакуумного насоса и пропускают через сорбент 1 см³ метиленхлорида, собирая экстракт в виалу. Скорость потока во время экстракции не должна превышать 1 см³/мин. Полученный экстракт высушивают в токе воздуха, растворяют сухой остаток в 1,0 см³ ацетонитрила, фильтруют раствор через капроновый фильтр, используя медицинский шприц «Луер», в стеклянную виалу, и анализируют в количестве 20 мм³ на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 8.4.3.

Идентификацию бенз(а)пирена проводят путем сравнения времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и стандартном растворе.

10. Обработка (вычисление) результатов измерений

10.1. Массовую концентрацию бенз(а)пирена в моче (мкг/дм³) вычисляют по формуле:

X = S₁ ∙ К ∙ 1,087, где

X - массовая концентрация бенз(а)пирена в анализируемой пробе, мкг/дм³;

S₁ - площадь пика бенз(а)пирена на хроматограмме, усл. ед.;

К - градуировочный коэффициент;

1,087 - коэффициент, учитывающий степень экстракции бенз(а)пирена из мочи, равную 92 %. Рассчитывается как отношение площадей пиков бенз(а)пирена до и после экстракции из мочи.

10.2. За результат измерения  принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости Х₁, Х₂ (параллельных определений), для которых выполняется условие:

                                     где (1)

r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 3.

При невыполнении условия (1) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

 где                          (2)

CR_0,95(4) - критический диапазон. CR_0,95(4) = 11 %.

При невыполнении условия (2) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Дополнительно выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению условия (1).

Таблица 3

Пределы повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, воспроизводимости при вероятности P = 0,95

10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости:

 где                                           (3)

 и  - результаты измерений массовой концентрации бенз(а)пирена, полученные в разных лабораториях - средние арифметические двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие (1), мкг/дм³.

При выполнении условия (3) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.

11. Оформление результатов измерений

Результат измерений в документах, предусматривающих его использование, может быть представлен в виде:

 мкг/дм³, Р = 0,95, где

Δ - характеристика погрешности, мкг/дм³, при Р = 0,95, значение Δ рассчитывают по формуле:

 где

Значение δ приведено в табл. 1.

12. Процедуры обеспечения достоверности измерений

Обеспечение достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и РМГ 76-2004 ГСИ.

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

12.1. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок

Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к (мкг/дм³) рассчитывают по формуле:

 где

 - результат измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/дм³;

 - результат измерений массовой концентрации бенз(а)пирена в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (1), мкг/дм³;

С_д - величина введенной добавки, мкг/дм³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

 где

 - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики измерений, соответствующие массовой концентрации бенз(а)пирена в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно, мкг/дм³.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики измерений в лаборатории устанавливать на основе выражения: Δ_л = 0,84 ∙ Δ с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

К_к ≤ К.                                                               (4)

При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

12.2. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле внутрилабораторной прецизионности

Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб мочи.

При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного  и повторного ) массовой концентрации бенз(а)пирена в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

                                                (5)

Значение предела внутрилабораторной прецизионности (R_л, %) не превышает 20 %.

13. Разработчики

Уланова Т.С., Зайцева Н.В., Карнажицкая Т.Д., Кислицина А.В. (ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора).

Приложение 1
(справочное)

Библиография

1. Химическая энциклопедия /Под. ред. И.Л. Кнунянц. М.: «Советская энциклопедия», 1988. Т. 1.

2. Майстренко В.Н., Клюев Н.А. Эколого-аналитический мониторинг стойких органических загрязнителей. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2004. 323 с.

3. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности. Т. 1. Органические вещества. Л.: Химия, 1976. 590 с.

Приложение 2
(справочное)

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие документы.

ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия Ч. 1 Метрологические и технические требования. Испытания».

ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия».

ГОСТ 6709-72 «Вода дистиллированная. Технические условия».

ГОСТ 14262-78 «Кислота серная. Технические условия».

ГОСТ 4220-75 «Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия».

ГОСТ 7328-2001 «Гири. Общие технические условия».

ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

ГОСТ 29227-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные». Ч. 1. Общие требования.

ГОСТ Р ИСО 7886-1-2009 «Шприцы инъекционные однократного применения стерильные».

ГОСТ 12.0.004-90 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда».

ГОСТ 12.1.004-91 «ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования».

ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».

СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

ГОСТ 12.1.007-76 «ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».

ГОСТ 12.1.019-2009 «ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

ГОСТ 12.4.009-83 «ССБТ. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

РМГ 76-2004 ГСИ «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

ТУ 9443-001-245.23530-97 «Центрифуга ЦЛМН-Р10-01-«Элекон».

ТУ 16.534.743-83 «Сушильный шкаф ШСС-80».

ТУ 6-09-14-2167-84 «Ацетонитрил».

ТУ 2631-013-44493179-98 «Метилен хлористый для жидкостной хроматографии».

Примечание. При использовании настоящих методических указаний целесообразно проверить действие ссылочных стандартов на территории Российской Федерации по соответствующем) указателю стандартов, составленному на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный документ заменен (изменен), то при пользовании настоящими методическими указаниями следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.