ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
	НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ	ГОСТ Р 54635- 2011

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

Метод определения витамина А

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом № 184-ФЗ «О техническом регулировании» от 27 декабря 2002 г., а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 36 «Функциональные пищевые продукты»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2011 г. № 784-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

Содержание

ГОСТ Р 54635-2011

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ

Метод определения витамина А

Дата введения - 2013-01-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на функциональные пищевые продукты и устанавливает метод определения массовой доли витамина А в виде ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой доли витамина А составляет от 0,5 до 10,0 млн^-1.

Примечание - Настоящий стандарт допускается распространять на пищевые продукты при условии соблюдения диапазона измерений.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 8.563-2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы)измерений

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ Р 52062-2003 Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ Р 52179-2003 Маргарины, жиры для кулинарии, кондитерской, хлебопекарной и молочной промышленности. Правила приемки и методы контроля

ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 27025-86 Реактивы. Общие указания по проведению испытаний

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытании

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р 52349, а также следующий термин с соответствующим определением:

3.1 содержание витамина А: Массовая доля ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в миллионных долях (млн^-1).

4 Сущность метода

Определение витамина А в экстракте, полученном из анализируемой пробы, проводят разделением методом ВЭЖХ с последующим фотометрическим или флуориметрическим детектированием. При необходимости экстракт получают после щелочного гидролиза анализируемой пробы.

Количественный анализ проводят методом внешнего стандарта с использованием площади или высоты пиков ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола.

5 Требования безопасности

5.1 Условия безопасного проведения работ

При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования пожарной безопасности, установленные ГОСТ 12.1.004, электробезопасности - ГОСТ Р 12.1.019, техники безопасности при работе с реактивами - ГОСТ 12.1.007, а также требования, изложенные в технической документации на спектрофотометр, хроматограф, другие приборы и оборудование.

Помещение, в котором проводят испытания, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Контроль за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны следует проводить в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005.

При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться [1].

5.2 Требования к квалификации оператора

К выполнению испытаний и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием по профессиям: химик, инженер-химик, техник, лаборант, с опытом работы в химической лаборатории. Первое применение метода в лаборатории следует проводить под наблюдением квалифицированного специалиста в области ВЭЖХ.

6 Условия выполнения испытания

6.1 Общие условия

Испытания проводят в нормальных лабораторных условиях: температура окружающей среды - (25 ± 5) °С; относительная влажность - (65 ± 15) %; частота переменного тока - (50 ± 5) Гц; напряжение в сети - (220 ± 10) В.

При приготовлении и хранении растворов следует выполнять требования ГОСТ 27025, ГОСТ 4517.

Для предотвращения разрушения витамина А анализ испытуемого материала и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, пирогаллола), предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

6.2 Условия фотометрических измерений

Условия фотометрических измерений приведены в таблице 1.

Таблица 1 -Условия фотометрических измерений

Витамин А	Растворитель	Длина волны, нм	Удельный коэффициент поглощения
Ретинол	Этанол	325	1832
Ретинола ацетат	Этанол	328	1550
Ретинола пальмитат	2-пропанол	328	975

6.3 Условия хроматографического анализа

Температура хроматографической колонки: 25 °С или температура окружающей среды.

Скорость потока подвижной фазы: 0,7 см³/мин (ориентировочное значение).

Объем вводимой пробы: 50 ∙ 10^-3 см³.

Подвижная фаза: смесь ацетонитрила, метилового спирта, метилена хлористого в объемном соотношении 50:45:5.

Проверку оптимальности условий хроматографического разделения осуществляют путем хроматографического анализа смешанного раствора ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола с массовой концентрацией каждого вещества не менее 0,4 мкг/см³. Данный смешанный раствор готовят из основных растворов ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола по аналогии с методикой приготовления рабочих растворов по 8.1.2. Эффективность хроматографического разделения признается удовлетворительной, если коэффициент разделения соседних пиков ретинола, ацетата ретинола, пальмитата ретинола составляет не менее 1,3. В противном случае для достижения требуемой эффективности разделения экспериментальным путем подбирают скорость потока подвижной фазы или проводят испытания других колонок.

7 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

7.1 Для определения содержания массовой доли витамина А применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:

- весы по ГОСТ Р 53228, обеспечивающие точность взвешивания с пределами допускаемой абсолютной погрешности ± 0,1 мг;

- спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 190 до 1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1 %;

- кюветы кварцевые с длиной оптического пути 1 см;

- хроматограф высокоэффективный жидкостный, включающий следующие элементы: насос; устройство для ввода проб; флуориметрический детектор (длины волн, нм: возбуждения - 325 нм, эмиссии - 470 нм) или спектрофотометрический детектор (длина волны детектирования - 325 нм) с уровнем шумов не более 10^-4 единиц оптической плотности и относительной погрешностью измерений не более 10 %; колонку аналитическую для ВЭЖХ диаметром 0,30 - 0,46 см, длиной 10 - 25 см, заполненную октадецилсиликагелем с размером частиц 5 мкм; регистрирующее устройство - интегратор или самописец, позволяющий проводить измерение площади (или высоты) пика с погрешностью не более 1 %; программное обеспечение для обработки полученных результатов измерений;

- фильтры для фильтрования подвижной фазы и анализируемых растворов (например, с размером пор 0,45 мкм);

- микрошприц типа «Гамильтон» вместимостью 0,1 см³ для ввода проб в жидкостный хроматограф;

- пипетки градуированные 1(2,3)-1(2)-1-0,5(1,2,5,10,25) по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более ± 1 %;

- цилиндры 1-50(100,250)-1(2) по ГОСТ 1770;

- колбы мерные 2-50(100,250,500,1000)-2 по ГОСТ 1770;

- пробирки мерные с притертыми пробками П-2-5(10,15,20,25)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770;

- стаканы В(Н)-1-50(100,150,250)ТХС по ГОСТ 25336;

- колбы круглодонные К-1-100(250,500)-29/32ТС по ГОСТ 25336;

- воронки В-36(56)-80ХС, В-75-110(140)ХС, В-100-150ХС по ГОСТ 25336;

- линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427;

- встряхиватель для колб и пробирок с диапазоном частот колебаний платформ 100 - 150 колебаний в минуту;

- центрифуга, обеспечивающая 4 - 6 тыс. об/мин;

- баня водяная с регулятором нагрева, поддерживающая температуру от 40 ° до 100 °С;

- баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 дм³;

- испаритель ротационный с диапазоном рабочего давления от 7 мм рт. от. до 760 мм рт. от. (от 9 ∙ 10² Па до 10 ∙ 10⁴ Па) или насос водоструйный по ГОСТ 25336;

- холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;

- термометр лабораторный жидкостный диапазоном температур от 0 °С до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С по ГОСТ 28498;

- баллон с газообразным азотом по ГОСТ 9293, ос. ч., и по [1];

- бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026;

- плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919;

- мельница лабораторная электрическая;

- холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы и материалы:

- спирт этиловый абсолютный (C₂H₅OH) массовой долей основного вещества не менее 99,9 %;

- спирт этиловый ректификованный (C₂H₅OH) массовой долей основного вещества не менее 96 % или по ГОСТ Р 51652, ГОСТ 18300;

- спирт метиловый (CН₃OH) массовой долей основного вещества не менее 99,9 %;

- ацетонитрил (CH₃CN) массовой долей основного вещества не менее 99,8 %;

- метилен хлористый (CH₂С1₂) массовой долей основного вещества не менее 99,8 %;

- н-гексан (C₆H₁₄) массовой долей основного вещества не менее 99 %;

- этилацетан (C₄H₈O₂) массовой долей основного вещества не менее 99 % или по ГОСТ 8981;

- пропанол-2 (C₃H₈O) массовой долей основного вещества не менее 99 %;

- эфир петролейный, перегнанный при температуре (50 ± 10) °С, очищенный от перекисей;

- эфир диэтиловый, очищенный от перекисей, содержащий 0,1 % пирогаллола, по [2];

- калия гидроокись (KOH) по ГОСТ 24363, х. ч. или ч. д. а., раствор KOH массовой долей 50 %;

- натрий сернокислый (Na₂SO₄) безводный массовой долей основного вещества не менее 99,5 % или по ГОСТ 4166, х. ч.;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;

- кислоту аскорбиновую (C₆H₈O₆) по [3] или [4], х. ч.;

- гидрохинон (C₆H₆O₂) массовой долей основного вещества не менее 99 % или по ГОСТ 19627;

- пирогаллол (C₆H₆O₃) массовой долей основного вещества не менее 99 %;

- бутилгидрокситолуол (C₁₅H₂₄O) массовой долей основного вещества не менее 99 %;

- ретинол М(C₂₀H₃₀O) = 286,5 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90 %;

- ретинола ацетат М(C₂₂H₃₂O₂) = 328,5 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90 % или по [5];

- ретинола пальмитат М(C₃₆H₆₀O₂) = 524,9 г/моль, массовой долей основного вещества не менее 90 % или по [6].

7.3 Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

8 Подготовка к выполнению измерений

8.1 Приготовление растворов

8.1.1 Основные стандартные растворы

Растворяют около 50 мг ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в 50 см³ абсолютного этилового спирта. Массовая концентрация ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в растворе составляет примерно 1,0 мг/см³. Далее 2 см³ раствора ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) с помощью пипетки помещают в мерную колбу объемом 50 см³ и доводят до метки спиртом этиловым абсолютным. Массовая концентрация соединений в полученных основных стандартных растворах составляет примерно 40 мкг/см³.

8.1.2 Градуировочные растворы

Из основных стандартных растворов готовят не менее четырех градуировочных растворов ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата) в диапазоне массовых концентраций 0,4 - 4,0 мкг/см³ путем точного разведения основных стандартных растворов спиртом этиловым абсолютным в мерной колбе вместимостью 50 см³.

Определение массовой концентрации ретинола (или ретинола ацетата, или ретинола пальмитата), c (мкг/см³) проводят после измерения оптической плотности градуировочных растворов в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см на спектрофотометре при оптимальной длине волны и вычисляют по формуле

(1)

где A - значение оптической плотности градуировочного раствора;

 - значение оптической плотности градуировочного раствора в абсолютном этиловом спирте или 2-пропаноле массовой концентрации 1 г в 100 см³ при толщине поглощающего слоя 1 см, приведенное в таблице 1;

10⁴коэффициент пересчета;

K - коэффициент, учитывающий поглощение сопутствующих компонентов при измерении A, вычисляемый по формуле

(2)

где S_ст - площадь пика стандартного вещества при проведении ВЭЖХ анализа, mAU ∙ с (AU ∙ с);

S_общ - сумма площадей пиков сопутствующих компонентов при проведении ВЭЖХ анализа стандартного вещества, mAU ∙ с (AU ∙ с).

Все растворы входе приготовления и анализа тщательно защищают от воздействия ультрафиолетового излучения. Растворы ретинола хранят при температуре ниже 4 °С в течение 2 мес. Свежеприготовленные растворы ретинола ацетата или ретинола пальмитата используют для измерений в течение 2 - 3 ч при комнатной температуре.

8.2 Отбор и подготовка проб

8.2.1 Отбор проб проводят по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 26809, ГОСТ Р 52062, ГОСТ Р 52179.

8.2.2 Крупные частицы средней пробы, выделенной методом квартования из лабораторной пробы, измельчают с использованием подходящего оборудования (например, лабораторной мельницы) до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.

8.2.3 Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды 1 % и менее, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

2 - 5 г анализируемой пробы переносят в мерную колбу вместимостью 25 см³, растворяют в 10 - 15 см³ н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Раствор доводят до метки н-гексаном. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения н-гексаном. Затем аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте.

8.2.4 Пищевые продукты на масложировой основе с массовой долей воды не более 20 %, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

2 - 5 г анализируемой пробы растворяют при интенсивном перемешивании в 10 - 15 см³ н-гексана, используя ультразвуковую баню для ускорения растворения. Удаляют избыток воды добавлением безводного сульфата натрия. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр для отделения нерастворившегося осадка. Колбу промывают дважды 5 см³ н-гексана. Фильтраты собирают в мерную колбу вместимостью 25 см³. Раствор доводят до метки н-гексаном. Затем аликвоту гексанового раствора упаривают в токе азота и сухой остаток перерастворяют в элюенте.

8.2.5 Другие пищевые продукты, обогащенные ацетатом ретинола или пальмитатом ретинола

Для проведения щелочного гидролиза 1 - 30 г анализируемой пробы сухого или жидкого материала помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 - 500 см³. К сухому материалу добавляют 5 - 20 см³ воды и нагревают на водяной бане при температуре 60 °С - 70°С при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 50 - 150 см³ этилового ректификованного спирта (или метилового спирта), 0,2 - 1,0 г антиоксиданта (аскорбиновой кислоты, гидрохинона, бутилгидрокситолуола), 4 - 40 см³ 50 %-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 15 - 45 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 80 °С - 100 °С.

Рекомендуемые соотношения испытуемого материала и реактивов приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Рекомендуемые соотношения испытуемого материала и реактивов

Массовая доля витамина А, млн-1	Навеска испытуемого материала, г	Объем этанола, см3	Объем 50 %-ного раствора КОН, см3
От 0,1 - 1,0 включ.	15 - 30	100	40
Св. 1,0 - 5,0 включ.	5 - 15	60	20
Св. 5,0 - 10,0 включ.	1 - 5	30	4

При проведении щелочного гидролиза при комнатной температуре в течение не менее 16 ч используют вышеуказанные соотношения материала и реактивов.

Если после охлаждения на поверхности смеси остается слой масла или жира, то объем добавленного раствора КОН и время проведения щелочного гидролиза увеличивают.

После окончания гидролиза содержимое колбы быстро охлаждают до (20 ± 5) °С и количественно переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают водой, объем которой равен объему добавленного этилового спирта (или метилового), и воду сливают в туже воронку. Витамин А экстрагируют диэтиловым (или петролейным) эфиром, н-гексаном, н-гексаном с добавкой диэтилового (или петролейного) эфира в объемном соотношении 1:1 в течение двух минут. Для учета возможной неполной экстракции витамина А следует использовать метод добавок стандартов.

Экстракцию повторяют три-четыре раза порциями экстрагента 50 - 100 см³. Объединенный экстракт отмывают от щелочи три-четыре раза порциями воды 50 - 150 см³ до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге).

Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2 - 5 г безводного сульфата натрия. Далее экстракт упаривают досуха, используя роторный испаритель при температуре не выше 50 °С и затем перерастворяют в элюенте. При необходимости раствор можно использовать для последующего разведения.

Раствор, полученный по 8.2.3 (8.2.4, 8.2.5), анализируют методом ВЭЖХ. Массу анализируемой пробы и объем растворителя подбирают таким образом, чтобы концентрация определяемых веществ в анализируемом растворе находилась в диапазоне от 0,4 до 4,0 мкг/см³.

8.3 Подготовка жидкостного хроматографа

Подготовку жидкостного хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонку промывают элюентом.

8.4 Построение градуировочной зависимости

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования. Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов, приготовленных по 8.1.2.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» - «массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см³». Для каждого анализируемого градуировочного раствора проводят два параллельных измерения и находят среднеарифметическое значение. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и значениями времени удерживания не должно превышать 5 % от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых массовых концентраций витамина А.

Коэффициент градуировочного графика k_гр, мкг/см³/(mAU ∙ с) или мкг/см³/(AU ∙ с) определяют как среднеарифметическое значение коэффициентов k_i,, вычисляемых по формуле

(3)

где С_i - массовая концентрация стандартных веществ в i-м градуировочном растворе, мкг/см³;

S_i - площадь (высота) аналитического сигнала при анализе i-го градуировочного раствора, mAU ∙ с (AU ∙ с) или высота пика, мм.

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверной аппроксимации R² ≥ 0,997.

Градуировка проводится в следующих случаях: на этапе освоения метода, при изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

9 Выполнение измерений

В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов. В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора. Концентрацию витамина А (C_гр) в растворе, используемом для градуировки, уточняют вдень его использования по 8.1.2.

Для идентификации пиков сопоставляют время удерживания ретинола (или ретинола ацетата или ретинола пальмитата) испытуемого раствора и раствора стандарта, а также добавляют к испытуемому раствору раствор стандарта с близким содержанием витамина А.

10 Обработка и оформление результатов

Массовую долю витамина А X, млн^-1, вычисляют по формулам:

(4)

где k_гр - коэффициент градуировочного графика по 8.4;

S_o6p - среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов испытуемого раствора, mAU ∙ с (AU ∙ с) или высота пика, мм;

V - объем разведения, см³;

m - масса анализируемой пробы, г.

С использованием градуировочного раствора

(5)

где C_гр - массовая концентрация градуировочного раствора, мкг/см³;

V - объем разведения, см³;

S_o6p - среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов испытуемого раствора, mAU ∙ с (AU ∙ с) или высота пика, мм;

m - масса анализируемой пробы, г;

S_rp - среднеарифметическое значение результатов измерений площади (высоты) пика анализируемого компонента для двух параллельных хроматографических анализов градуировочного раствора, mAU ∙ с (AU ∙ с) или высота пика, мм.

Результат вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы.

Расхождение между результатами двух параллельных измерений X₁, X₂ (в процентах от среднего значения X_ср ), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, не должно превышать r (предел повторяемости приведен в таблице 3) с доверительной вероятностью P = 95 %.

При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение X_ср.

Границы относительной погрешности определения массовой доли витамина А (± δ), в процентах от результата испытания, и при доверительной вероятности 95 % не должны превышать значений, указанных в таблице 3.

Результат определения витамина А представляют в следующем виде:

(6)

где Х_ср - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, млн-¹;

Δ - значение границы абсолютной погрешности определений, млн^-1, вычисляемое по формуле

(7)

Результаты испытаний заносят в протокол, в котором указывают:

- ссылку на настоящий стандарт;

- вид, происхождение и название пробы;

- способ и дату отбора пробы;

- дату поступления и испытания пробы;

- результаты исследования;

- причины отклонений в процедуре определения от установленных условий.

11 Метрологические характеристики метода

11.1 Повторяемость

Каждую пробу анализируют дважды, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Расхождение между результатами двух параллельных измерений (X₁, X₂), выполненными одним оператором с использованием идентичных реактивов и оборудования и в минимально возможный промежуток времени, считают удовлетворительным, если |X₁ - X₂| ≤ 0,01 ∙ r ∙ X_ср , где X_ср - среднеарифметическое значение, r - предел повторяемости (расхождение между двумя параллельными определениями, выполненными в условиях повторяемости). Значение r приведено в таблице 3.

При превышении предела повторяемости (сходимости) испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.2 Воспроизводимость

Пробу делят на две равные части. Расхождение между результатами двух определений (X₁, X₂), выполненных разными операторами в разное время с использованием различных реактивов и оборудования, считают удовлетворительным, если |X₁ - X₂| ≤ 0,01R ∙ X, где X - среднеарифметическое значение, R - предел воспроизводимости (расхождение между двумя определениями, выполненными в условиях воспроизводимости). Значение R приведено в таблице 3.

Таблица 3 - Метрологические характеристики

Метрологическая характеристика (Р = 0,95)	Диапазон измерений массовой доли, млн 1
	От 0,5 до 5,0 включ.	Св. 5,0 до 10,0 включ.
Стандартное отклонение повторяемости sr, %	5,4	4,3
Предел повторяемости r, %	15	12
Стандартное отклонение воспроизводимости sR, %	8,9	7,1
Предел воспроизводимости R, %	25	20
Границы относительной погрешности (± δ), %	20	15
Предел обнаружения, млн-1	0,1

При превышении предела воспроизводимости испытание повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

11.3 Контроль погрешности результатов испытаний

Контроль погрешности (точности) результатов испытаний проводят методом добавок. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют стандарт витамина А в количестве, составляющем 50 % - 150 % от исходного содержания компонента в пробе, и проводят испытания в соответствии с настоящим стандартом.

Результаты испытаний признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой доли витамина А в добавке не превышает норматива контроля погрешности K_доб, млн^-1:

(8)

где X_доб - среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы с добавкой, млн^-1;

X_ср - среднеарифметическое значение результатов двух испытаний пробы без внесения добавки, млн^-1;

c_доб - массовая доля добавки, млн^-1.

При проведении внутрилабораторного контроля значение K_доб вычисляют (при доверительной вероятности 90 %) по формуле

(9)

где δ - значение границы относительной погрешности определения массовой доли витамина А, указанное в таблице 3.

При проведении внешнего контроля значение K_доб вычисляют (при доверительной вероятности 95 %) по формуле

(10)

11.4 Контроль стабильности результатов измерений при реализации методики в лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя метод контроля стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (пункт 6.2.3) с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений должны быть предусмотрены в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025 (подраздел 4.2) и ГОСТ Р 8.563 (пункт 7.1.1).

Библиография

[1]	ПВ 10-115-96	Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением
[2]	ГФ СССР X, ст. 34	Эфир медицинский
[3]	ГФСССРХ, ст. 6	Кислота аскорбиновая (витамин С)
[4]	ФС 42-2668-95	Кислота аскорбиновая (витамин С)
[5]	ГФ СССР X, ст. 578	Ретинола ацетат
[6]	ФС 42-2229-84	Ретинола пальмитат