4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток В. amyloliquefaciens
ВКПМ В-10291 - продуцента a-амилазы
в воздухе рабочей зоны и
атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания
МУК 4.2.2718-10

МУК 4.2.2721-10

Москва • 2011

1. Разработаны ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 4 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 4 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения
концентрации клеток В. amyloliquefaciens
ВКПМ В-10291 - продуцента a-амилазы в
атмосферном воздухе населенных мест

Методические указания

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 продуцента a-амилазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 500000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также лабораториями организаций, аккредитованными в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Биологическая характеристика Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 и его гигиенический норматив

Штамм В. amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 является продуцентом альфа-амилазы. Получен из штамма В. amyloliquefaciens ВКПМ В-5144 с помощью генетических методов, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.

Растет на агаризованных средах (МПА, LB-агар и др.) при 36 - 37 °C в течение 24 - 36 ч. На LB-агар колонии достигают максимального диаметра 6 - 7 см. Колонии округлые, розовато-кремового цвета, края ровные, поверхность колонии матовая, шероховатая, консистенция зернистая. На агаризованной среде с крахмалом штамм дает обильный рост и образование зон гидролиза вокруг колоний, желатин разжижает, восстанавливает лакмусовое молоко.

Устойчив к отдельным бета-лактамным антибиотикам, тетрациклину, полимиксину, рифампицину, сульфометаксозолу.

Клетки представляют собой грамположительные одиночные подвижные палочки размером 0,6 - 0,8´0,2 - 0,3 мкм, образующие споры, имеющие центральное положение и овальную форму.

Систематическое положение микроорганизма

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 5000 кл./м³, пометка A.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток микроорганизма в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 500000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений клеток микроорганизма на среду МПА и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

Дополнительный физиолого-биохимический метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на поверхность плотной питательной среды (МПБСА), содержащей крахмал, и подсчете зон гидролиза (просветления) вокруг колоний через 24 - 48 ч. При данном методе на одной чашке Петри после забора пробы может быть учтено не более 50 колоний на чашке, т.к. большее количество колоний на чашке образуют сливающиеся зоны гидролиза, что затрудняет подсчет колоний.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

5.2. Реактивы, растворы

Для приготовления солодового сусла 7 °Б солодовый экстракт растворяют в дистиллированной воде до 7 % содержания сахара с помощью ареометра.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».

6.2. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.3. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.4. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 ± 5) °C, атмосферном давлении 740 - 760 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 70 %.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток микроорганизма воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 100 л/мин на поверхность плотной питательной агаризованной среды. Время аспирации воздуха (5 - 15 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом МПА расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика линкомицина (рифампицина) из расчета 15 - 20 мкг/мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой 36 - 37 °C. Через 24 - 48 ч производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод).

При микробиологическом анализе воздуха производственных помещений дополнительными функционально-биохимическими методами пробы воздуха отбирают на чашки Петри с МПБСА. Затем чашки инкубируют в термостате при 36 - 37 °C в течение 24 - 48 ч и подсчитывают количество зон гидролиза (просветления) вокруг выросших колоний.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать в 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

 где

X - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество зон вокруг колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

Протокол №
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента В. amyloliquefaciens ВКПМ В-10291 в атмосферном воздухе населенных мест

1. Наименование и адрес испытательной лаборатории (центра), проводящей измерения, аттестат аккредитации лаборатории.

2. Юридический и фактический адрес организации-заказчика.

3. Идентификация используемого метода, методики, ссылки на методы, используемые испытательной лабораторией.

4. Описание состояния объекта исследования.

5. Дата получения объекта измерений и дата проведения анализа.

6. Место отбора пробы.

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель:

Руководитель:

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы РД 52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96 ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.