Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

Сборник
методических документов, необходимых
для обеспечения применения
Федерального закона от 12 июня 2008 г. № 88-ФЗ
«Технический регламент на молоко
и молочную продукцию»

Часть 3

В сборник включены методические документы, содержащие правила и методы исследований (испытаний) и измерений, а также правила отбора образцов для проведения исследований (испытаний) и измерений, в соответствии с постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко от 08.12.2008 № 67.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
левомицетина (Хлорамфеникола,
Хлормицетина) в продуктах животного
происхождения методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии и
иммуноферментного анализа

Методические указания
МУК 4.1.1912-04

1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, В.К. Кирничная, Т.В. Киселева, Н.Г. Орлова, Н.Р. Ефимочкина, Н.В. Барбер), Московским государственным университетом им. М.В. Ломоносова (А.М. Егоров, А.Ю. Колосова, Ж.В. Самсонова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 марта 2004 г.

4. Введены в действие 1 мая 2004 г.

5. Введены впервые.

4.3. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств левомицетина
(Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах
животного происхождения методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
и иммуноферментного анализа

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения:

I - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);

II - иммуноферментного анализа (ИФА).

2. Общие положения

Среди ряда веществ, которые могут контаминировать продовольственное сырье и пищевые продукты, важное место занимают ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных, так и в качестве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными препаратами, используемыми в ветеринарии, остаются антибиотики. Известно большое число антибиотиков, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животных, характером метаболизма и т.д.

Систематическое поступление в организм человека антибиотиков с продуктами питания крайне вредно, поскольку они могут оказывать нежелательные эффекты, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.

Хлорамфеникол (далее - ХАФ) является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. В отличие от многих антибиотиков ХАФ обладает довольно простым химическим строением.

Формула хлорамфеникола

Хлорамфеникол малорастворим в воде, но хорошо в спирте. Установлено, что ХАФ медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов.

В настоящее время для определения ХАФ в продуктах питания применяют ряд методов, в их числе микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Для арбитражных исследований вводятся хроматографические методы, в частности ВЭЖХ, позволяющий раздельно определять как ХАФ, так и его метаболиты.

Количественный метод определения ХАФ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сельскохозяйственных продуктах, отличается низким пределом обнаружения (0,01 мг/кг), хорошей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 0,15 - 0,21) и надежностью.

Для скрининговых целей в мире широко применяют методы иммунохимического анализа, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность и точность. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными (предел обнаружения - 0,00008 мг/кг).

Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 содержание левомицетина в продуктах животного происхождения не допускается.

3. Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб аналогичен для обоих методов исследования.

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 7202.0-74 «Мясо птицы». ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».

Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками или укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят на холоде, а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание -4 - -10 °С, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.

К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны хранить при указанной выше температуре не более двух недель со времени отбора среднего образца.

4. Определение остаточных количеств левомицетина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении хлорамфеникола экстракцией этилацетатом, последовательной промывке экстракта разбавленным раствором щелочи и кислоты, обезжиривании петролейным эфиром и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.

4.2. Аппаратура, материалы, реактивы

4.3. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.

4.4. Подготовка к испытанию

4.4.1. Приготовление растворов

Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 см³ и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 см³ помещают 0,25 см³ полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.

4.5. Проведение испытания методом ВЭЖХ

4.5.1. Подготовка образца для определения левомицетина в молоке

Смешивают 25 см³ молока с 12 г безводного сульфата натрия и экстрагируют (3 раза по 15 см³ этилацетата). Полученную смесь центрифугируют 15 мин со скоростью 4000 об./мин и декантируют. Этилацетатный слой промывают последовательно 5 см³ насыщенного раствора NaCl с добавлением в него 0,2 см³ 10 % NaOH; 5 см³ насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 см³ 10 % СН₃СООН; 5 см³ насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см³ смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 см³ петролейным эфиром. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см³). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см³ метанола.

4.5.2. Подготовка образца для определения левомицетина в мясе

Гомогенизируют 10 г мяса с 15 см³ фосфатного буфера (0,025 М КН₂РO₄ + 0,025 М Na₂HPO₄) pH = 6,88 и экстрагируют 3 раза по 30 см³ этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин при 4000 об./мин и декантируют этилацетатный слой, промывают последовательно 5 см³ насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 мл 10 %-ного NaOH; 5 мл насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 мл 10 %-ного СН₃СООН и 5 см³ насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см³ смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 см³ петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см³). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см³ метанола.

4.5.3. Подготовка образца для определения левомицетина в яйцах

Перетирают 10 г гомогената яйца с 5 г Na₂SO₄ приливают 40 см³ этилацетата и 5 см³ 1Н H₂SO₄ перемешивают и центрифугируют 5 - 10 мин при 4000 об./мин, этилацетатный слой декантируют, водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 см³ этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные этилацетатные слои промывают последовательно 10 см³ 2-процентного раствора Nа₂СО₃ насыщенного NaCl; 10 см³ насыщенного раствором NaCl.

4.6. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)

В жидкостной хроматограф с колонкой (Ультрасфер ODS, С₁₈) 5 мкм (250×4,6 мм), УФ детектором при λ = 278 нм, используя элюент ацетонитрил-вода-дециламин (40:60:0,1), вводят 5 мкл стандартного раствора (10 нг/мкл) левомицетина. В тех же условиях вводят метанольный экстракт образца (молока, мяса, яиц).

4.7. Подтверждение наличия левомицетина в образцах

Для подтверждения наличия левомицетина к 50 мкл метанольного экстракта приливают 50 мкл 10 %-ного раствора КОН и нагревают 20 мин при 70 °С, 10 мкл полученного раствора вводят в тех же условиях в колонку жидкостного хроматографа. На полученной хроматограмме пик с временем удерживания левомицетина отсутствует. Это подтверждает наличие левомицетина в образце.

4.8. Обработка результатов

4.8.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

Таблица 1

Метрологические характеристики метода определения хлорамфеникола в продуктах питания животного происхождения (молоке, мясе, яйцах)

4.8.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 4.8.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.

5. Определение хлорамфеникола (левомицетина) в продуктах животного происхождения (молоке, мясе, яйцах) методом иммуноферментного анализа

5.1. Принцип метода ИФА

В основу метода количественного определения ХАФ в продуктах питания положен принцип твердофазного конкурентного ИФА на полистироловых планшетах. Принцип метода основан на конкуренции свободного ХАФ из измеряемой пробы и ХАФ, предварительно иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к ХАФ антител. После отделения несвязавшихся реагентов количество антител, прореагировавших с иммобилизованным антигеном, определяют с помощью антивидовых антител, меченых пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата вторичных антител выявляют с помощью субстрат-хромогенной смеси. Количество определяемого антибиотика, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта ферментативной реакции.

Пределы обнаружения метода - 0,000012 - 0,00008 мг/кг.

5.2. Аппаратура, материалы, реактивы

5.3. Характеристика наборов для иммуноферментного определения левомицетина (хлорамфеникола)

5.3.1. Состав набора ИФА-ХАФ:

5.3.2. Состав набора «Ридаскрин Левомицетин»

Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированных антителами «захвата» - 1 шт.

Комплект стандартных растворов левомицетина со следующими концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5 нг/см³ буферном растворе по 1,3 мл - 6 шт.

Конъюгат левомицетина с пероксидазой - 0,7 см³.

Антитела к левомицетину - 0,7 см³.

Субстрат, содержит пероксид карбамида - 7 см³.

Хромоген, содержит тетраметилбензидин - 7 см³.

Стоп-реагент, содержит 1 N серную кислоту - 14 см³.

Буфер 1, для разбавления стандартных растворов левомицетина, конъюгата, антител, растворов образцов и буфера 2 - 100 см³.

Буфер 2, для разбавления стандартных образцов при анализе молока - 1 см³.

Наборы рассчитаны на проведение анализа в 2-х повторностях 41 исследуемых образцов и 6 калибровочных проб (всего 96 определений на один планшет).

5.3.3. Аналитические характеристики наборов

5.3.3.1. Набор ИФА-ХАФ

Специфичность. Использование высоко аффинных антител к ХАФ обеспечивает высокую специфичность анализа. Процент перекрестной реакции с сукцинатом ХАФ составляет 25 %, с дезацилированным ХАФ, являющимся одним из метаболитов антибиотика, - менее 1 %, с антибиотиками других групп - менее 1 %.

Чувствительность. Минимальная концентрация ХАФ, определяемая с помощью набора, составляет 0,00008 мг/кг (дм³).

Воспроизводимость. Коэффициент вариации результатов определений концентраций ХАФ с помощью набора не превышает 12 %.

Тест на открытие. Процент открытия составляет 70 - 130 %.

Линейность. Линейность составляет 90 - 110 %.

Диапазон определяемых концентраций 0,0001 - 0,1мг/кг (дм³).

Проверка набора. При параллельном определении концентрации хлорамфеникола в продуктах питания животного происхождения с помощью набора ИФА-ХАФ и метода ВЭЖХ коэффициент корреляции составляет 0,975.

5.3.3.2. Набор «Ридаскрин Левомицетин»

Чувствительность (пределы обнаружения) - 0,000012 - 0,00005 мг/кг(дм³).

Извлекаемость - > 80 %.

Перекрестная чувствительность: левомицетин - 100 %, левомицетин основной - 0,5 %, тиамфеникол - менее 0,05 %. Нет чувствительности к тетрациклинам, гентамицину, ампициллину и флорфениколу.

5.4. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Все компоненты наборов, за исключением о-фенилендиамина, в используемых концентрациях не токсичны. О-Фенилендиамин обладает канцерогенным действием. Поэтому в случае попадания веществ на кожные или слизистые покровы следует немедленно тщательно смыть его большим количеством воды. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

5.5. Проведение испытаний с применением набора ИФА-ХАФ

Все разведения реагентов и расчеты представлены для проведения анализа на 1 планшете.

Построение калибровочной кривой необходимо проводить для каждого планшета.

5.5.1. Приготовление реагентов

5.5.1.1. Приготовление фосфатно-солевого буфера, содержащего детергент (ФСБТ)

Содержимое двух флаконов с фосфатно-солевым буферным раствором количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 400 см³ дистиллированной водой. Полученный буфер может храниться закрытым в течение 5 дней при температуре не выше 2 - 8 °С.

5.5.1.2. Приготовление буфера 1

Содержимое флакона с концентратом буфера количественно перенести в стакан и довести общий объем раствора до 50 см³ ФСБТ. Полученный буфер может храниться в течение 5 дней при температуре 2 - 8 °С.

5.5.1.3. Приготовление образцов для анализа

Молоко. Пробу молока развести перед анализом в 100 раз буфером 1.

Мясо. Встряхивают 3 г измельченной ткани (фарша) с 6 см³ этил-ацетата в течение 5 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин. Упаривают досуха 1 см³ верхней фазы. Осадок перемешивают с 3 см³ ФСБТ и центрифугируют при 3000 g в течение 5 мин. Супернатант отбирают и разводят в 50 раз ФСБТ.

Яйца. Взвешивают по 3 г смешанного (гомогенизированного) содержимого яйца в реакционную посуду и проводят дальнейшую пробоподготовку, как описано для образцов мяса.

5.5.1.4. Приготовление калибровочных проб (КП)

Калибровочные пробы готовятся заново при каждом определении.

Молоко. Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/см³) по следующей схеме.

1. Приготовить 5 см³ раствора ХАФ в ФСБТ с концентрацией 0,01 мг/см³ (5 см³ раствора содержат 0,05 см³ стандартного раствора ХАФ в метаноле).

2. Приготовить 1 см³ калибровочной пробы 6 (КП 6) в буфере 1 с концентрацией 100 нг/см³ (1 см³ раствора содержит 0,01 см³ раствора, приготовленного на стадии 1).

3. Последующие калибровочные пробы готовят по схеме из КП 6 с использованием буфера 1:

Мясо (яйца). Калибровочные пробы готовятся из стандартного раствора ХАФ в метаноле (1 мг/см³) по вышеприведенной схеме. На всех стадиях используется буфер ФСБТ.

5.5.1.5. Приготовление рабочего раствора антител

Рабочий раствор антител готовится непосредственно перед использованием.

Содержимое одного флакона с лиофилизированными антителами растворить в 6 см³ ФСБТ. Полученный раствор хранению не подлежит.

5.5.1.6. Приготовление рабочего раствора конъюгата

Рабочий раствор конъюгата готовится непосредственно перед использованием.

Содержимое одного флакона с конъюгатом количественно перенести в стакан и довести общий объем до 15 см³ ФСБТ - при анализе образцов молока и до 30 см³ - при анализе образцов мяса и яиц. Полученный раствор хранению не подлежит.

5.5.1.7. Приготовление субстратно-хромогенной смеси

Субстратно-хромогенную смесь готовят непосредственно перед использованием.

Для приготовления раствора применять только химически чистую посуду.

В 11,25 см³ дистиллированной воды растворить 1 таблетку о-фенилендиамина, тщательно перемешивая и избегая попаданий света. К полученному раствору количественно добавить 1,25 см³ концентрата субстратного буферного раствора. Субстратно-хромогенная смесь, подготовленная к работе, хранению не подлежит.

5.5.2. Процедура анализа

Внесение реагентов следует проводить согласно схеме:

5.5.2.1. В два ряда лунок планшета внести калибровочные пробы (КП), приготовленные по п. 5.5.1.4, по 0,05 см³, начиная с минимальной концентрации. Рекомендуется не вносить калибровочные пробы в крайние ряды планшета во избежание влияния краевого эффекта. При разнице более 0,1 единицы оптической плотности в результатах параллельных проб на крайних рядах учитывать результат крайнего ряда не следует.

В оставшиеся лунки внести в дубликатах исследуемые образцы в объеме 0,05 см³.

Процедуру внесения образцов следует выполнять как можно быстрее. Вся операция не должна превышать 12 - 15 мин.

5.5.2.2. Во все лунки планшета внести по 0,05 см³ рабочего раствора антител, приготовленного по п. 5.5.1.5. Антитела вносить в лунки планшета в той же последовательности, что и калибровочные пробы и исследуемые образцы.

5.5.2.3. Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1,5 ч в термостате.

5.5.2.4. Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 см³ промывочного буферного раствора, оставить на 1 - 2 мин, а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 4 раза. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.

5.5.2.5. Во все лунки планшета внести по 0,1 см³ рабочего раствора конъюгата, приготовленного по п. 5.5.1.6.

5.5.2.6. Плотно закрыть планшет крышкой и выдержать при температуре 37 °С в течение 1 ч в термостате.

5.5.2.7. Содержимое лунок удалить стряхиванием. Затем провести отмывку. Для этого в каждую лунку планшета внести по 0,35 см³ промывочного буферного раствора, оставить на 1 - 2 мин, а затем удалить содержимое лунок стряхиванием. Процедуру повторить 5 раз. После этого тщательно удалить остатки влаги из лунок, несколько раз вытряхнув планшет о марлевую салфетку или фильтровальную бумагу.

5.5.2.8. Во все лунки планшета внести по 0,1 см³ раствора субстратно-хромогенной смеси и выдержать планшет при комнатной температуре 18 - 25 °С в темном месте в течение 30 - 35 мин при анализе образцов молока и 7 - 10 мин - при анализе образцов мяса или яиц.

5.5.2.9. Внести во все лунки планшета по 0,35 см³ стоп-реагента (раствора серной кислоты).

5.5.2.10. Измерить оптическую плотность в лунках планшета при длине волны 490 нм. Окраска планшета стабильна в течение 1 ч в темноте.

5.5.3. Учет результатов

Построить калибровочную кривую зависимости оптической плотности от концентрации ХАФ в калибровочных пробах (следует использовать логарифмический масштаб для оси абсцисс). Соединить кривой (по лекалу) полученные точки. Образец калибровочной кривой приведен ниже.

Рассчитать средние арифметические значения показателей оптической плотности испытуемых образцов и по калибровочной кривой определить в них концентрацию ХАФ, учитывая фактор разбавления, который равен 100, для всех образцов.

5.5.4. Условия хранения и эксплуатации набора

Набор реагентов ИФА-ХАФ должен храниться при температуре 2 - 8 °С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до 25 °С не более 5 суток. Срок годности набора - 12 мес. Компоненты набора перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре 18 - 25 °С не менее 30 мин. Раствор антител, конъюгата и субстратно-хромогенная смесь хранению не подлежат. Промывочный буферный раствор может храниться после разведения при температуре 2 - 8 °С в течение 5 дней. При вскрытии и растворении лиофилизированных компонентов набора необходимо следить, чтобы на пробках не осталось сухого вещества.

5.6. Проведение испытаний с применением набора «Ридаскрин Левомицетин»

5.6.1. Подготовка проб

Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике, в темном месте.

5.6.1.1. Молоко

Пробу молока объемом 5 см³ охладить до 8 °С, перенести в стеклянную центрифужную пробирку, центрифугировать при 4 - 12 °С в течение 15 мин при 3000 g. Удалить верхний слой жира и перенести аликвоту обезжиренного молока в новую чистую пробирку. Для анализа использовать 0,05 см³ раствора на 1 лунку планшета. Фактор разбавления - 1. Предел обнаружения - 0,00005 мг/кг. Предел количественного обнаружения - 0,00015 мг/кг.

Примечание: для приготовления стандартных растворов для измерения проб молока использовать буфер 2.

5.6.1.2. Исследования сухого молока

Приготовить растворы:

• осадителя 1 - 0,36 М раствор ферроцианида (II) калия × 3 Н₂O - 1,52 г растворить в 10 см³ дистиллированной воды;

• осадителя 2 - 1,04 М раствор сульфата цинка × 7 Н₂O - (2,99 г растворить в 10 см³ дистиллированной воды).

Взвесить в центрифужной стеклянной пробирке 2 г сухого молока, добавить 10 см³ дистиллированной воды и встряхивать пробирку до растворения пробы. Добавить в пробирку по 1 см³ осадителя 1 и осадителя 2. Пробы тщательно перемешать на вортексе, и центрифугировать при 4 - 12 °С в течение 10 мин при 3000 g. Перед центрифугированием пробы охладить до 8 °С, перенести 3,6 см³ супернатанта (что соответствует 0,6 г сухого молока) в чистую пробирку. Добавить в пробирку 6 см³ этилацетата и экстрагировать встряхиванием в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 - 25 °С) в течение 10 мин при 3000 g.

Перенести 4 см³ эфирного экстракта (соответствует 0,4 г сухого молока) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 0,4 см³ буфера I и тщательно перемешать на вортексе. Для анализа используют 0,05 см³ раствора на 1 лунку планшета.

5.6.1.3. Мясо

Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г в гомогенизаторе. Взвесить в стеклянной центрифужной пробирке 3 г гомогената, смешать с 3 см³ дистиллированной воды и добавить 6 см³ этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси «вверх-вниз» в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 - 25 °С) в течение 10 мин при 3000 g.

Перенести 4 см³ эфирного экстракта (соответствует 2 г пробы) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха на микроиспарителе при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 см³ смеси изооктана с хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно перемешать на вортексе. Добавить к раствору 0,5 см³ буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение 1 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 - 25 °С) в течение 10 мин при 3000 g или более высоком ускорении.

Для анализа использовать 0,05 см³ раствора (водный верхний слой*) на 1 лунку планшета.

__________

* В случае образования пены или геля в межфазовой зоне при недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку на 5 мин в водяную баню при температуре 80 °С и затем еще раз центрифугировать

5.6.1.4. Яйца

Гомогенизировать пробу массой не менее 100 г смешанного содержимого яйца в гомогенизаторе. Взвесить в стеклянной центрифужной пробирке 2 г гомогената, смешать с 12 см³ этилацетата. Интенсивно встряхивать пробирку по оси «вверх-вниз» в течение 10 мин. Центрифугировать при комнатной температуре (20 - 25 °С) в течение 10 мин при 3000 g.

Перенести 6 см³ эфирного экстракта (соответствует 1 г пробы) в новую чистую пробирку и испарить экстракт досуха при 60 °С в слабом токе азота. Растворить сухой остаток в 1 см³ смеси изооктана с хлороформом в соотношении 2:3 и тщательно перемешать на вортексе.

Добавить к раствору 1 см³ буфера 1 и интенсивно перемешивать на вортексе в течение одной минуты. Центрифугировать при комнатной температуре (20 - 25 °С) в течение 10 мин при 3000 g или более высоком ускорении.

Для анализа использовать 0,05 см³ раствора (водный верхний слой*) на лунку планшета.

__________

* В случае образования пены или геля в межфазовой зоне при недостаточном объеме водной фазы поместить пробирку на 5 мин в водяную баню при температуре 80 °С и затем еще раз центрифугировать

5.6.2. Ход анализа

5.6.2.1. Предварительная подготовка

Перед использованием набора довести температуру всех реагентов до комнатной температуры (20 - 25 °С). Немедленно после использования охладить все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8 °С.

В процессе выполнения анализа не допускать высыхания лунок планшета.

На всех стадиях инкубации избегать воздействия прямого солнечного света. При инкубации планшета закрыть его непрозрачным экраном.

5.6.2.2. Приготовление раствора конъюгата

Перед разбавлением концентрированного раствора конъюгата осторожно встряхнуть содержимое флакона. Для приготовления рабочего раствора конъюгата разбавить концентрат конъюгата буферным раствором 1, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешать 0,2 см³ концентрата конъюгата с 2 мл буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов по 8 лунок).

5.6.2.3. Приготовление раствора антител

Перед разбавлением концентрата антител осторожно встряхнуть содержимое флакона. Для приготовления рабочего раствора антител разбавить концентрат буферным раствором 1, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, смешать 0,2 см³ концентрата антител с 2 см³ буфера 1 - данного разведения достаточно для 4-х стрипов).

5.6.2.4. Приготовление буферного раствора 2 (только для проб молока)

Для приготовления готового буферного раствора 2, использующегося при исследовании проб молока, разбавить концентрат буфера 2 в 9 см³ буферного раствора 1 и энергично перемешать с помощью встряхивателя типа «вортекс», периодически подогревая раствор до 40 °С. Мутность раствора не влияет на результат определения, однако осадок на дне флакона после перемешивания должен равномерно распределяться в объеме раствора.

5.6.2.5. Подготовка микротитровального планшета

Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов.

Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с осушителем, закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8 °С.

5.6.2.6. Приготовление стандартных растворов

Для приготовления рабочих стандартных растворов левомицетина концентрированные растворы, входящие в состав набора, следует разбавить буфером 1 (или буфером 2) в указанной пропорции. Для разбавления использовать только стеклянную посуду.

После разбавления тщательно перемешивать готовые растворы.

Для каждой серии исследований следует готовить свежие стандартные растворы.

Стандарт 1:0,05 см³ концентрата 1 + 0,45 см³ буферного раствора 1* 0 нг/дм³

Стандарт 2:0,05 см³ концентрата 2 + 0,45 см³ буферного раствора 1* 50 нг/дм³

Стандарт 3:0,05 см³ концентрата 3 + 0,45 см³ буферного раствора 1* 150 нг/дм³

Стандарт 4:0,05 см³ концентрата 4 + 0,45 см³ буферного раствора 1* 450 нг/дм³

Стандарт 5:0,05 см³ концентрата 5 + 0,45 см³ буферного раствора 1* 1350 нг/дм³

Стандарт 6:0,05 см³ концентрата 6 + 0,45 см³ буферного раствора 1* 4050 нг/дм³

_________

* При исследовании образцов молока для разведения стандартов использовать буферный раствор 2

5.6.3. Процедура анализа

Вставить в рамку планшета стрипы (лунки) в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в двух повторностях. Записать координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на рис. 1.

Рис. 1. Пример формы записи координат лунок перед
выполнением анализа (С - стандарты, П - пробы).

5.6.3.1. Добавить по 0,05 см³ стандартных растворов и растворов исследуемых образцов в соответствующие пары лунок.

5.6.3.2. Добавить по 0,05 см³ разбавленного раствора конъюгата в каждую лунку.

5.6.3.3. Добавить в каждую лунку по 0,05 см³ готового разбавленного раствора антител. Перемешать вручную, избегая попадания смеси в соседние лунки, и оставить на инкубацию в течение 2 ч при комнатной температуре (20 - 25 °С).

5.6.3.4. Вылить жидкость из лунок, перевернуть рамку планшета и выбить капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполнить лунки 0,25 см³ дистиллированной воды и снова вылить воду. Выбить капли воды, как описано выше. Повторить процедуру промывки лунок водой еще два раза.

5.6.3.5. Добавить по 0,05 см³ раствора субстрата и по 0,05 см³ раствора хромогена в каждую лунку. Перемешать вручную, соблюдая осторожность, и инкубировать при комнатной температуре (20 - 25 °С) в течение 30 мин в темноте.

5.6.3.6. Добавить в каждую лунку по 0,1 см³ раствора стоп-реагента и хорошо перемешать вручную. В течение 60 мин после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм (нулевое считывание по воздуху).

5.6.4. Определение количества левомицетина в исследованных пробах

Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов, и соответствующим значениям концентрации левомицетина в нг/кг строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 50 - 1350 нг/кг (см. рис. 2).

Рис. 2. Калибровочная кривая, полученная для набора
реагентов «Ридаскрин Левомицетин».

Концентрация левомицетина в растворах исследуемых образцов в нг/кг (или нг/дм³) определяется по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.

Для того чтобы вычислить концентрацию левомицетина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации левомицетина, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления (см. п. 5.5.1.1 - 5.5.1.4). Результат исследования выражают в мг/кг или мг/дм³.

При выполнении пробоподготовки по п.п. 5.5.1.3 и 5.5.1.4 холостые пробы могут показывать положительный результат на уровне 2-й стандартной пробы. При расчете концентрации левомицетина в исследуемых пробах рекомендуется учитывать фоновый сигнал с помощью постановки холостого опыта. Для этого в каждой серии анализов необходимо выполнять испарение 4 см³ чистого этилацетата и далее следовать процедуре, описанной в п. 5.5.3. Измеренный фоновый сигнал далее следует вычитать на стадии обработки результатов

5.7. Обработка результатов

5.7.1. 3а окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

Таблица 2

Метрологические характеристики иммуноферментного метода определения хлорамфеникола в продуктах питания животного происхождения (молоке, мясе, яйцах)

5.7.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования по п. 5.6.1, то повторно проводят два новых параллельных определения.

Содержание