УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации,
Первый заместитель Министра
здравоохранения Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
24 июня 2003 г.
Дата введения - 30 июня 2003 г.
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств глюфосинат аммония и его метаболита в воде, семенах и масле подсолнечника газохроматографическим методом
Методические указания
МУК 4.1.1451-03
1. Вводная часть
Фирма-производитель: Авентис КропСайенс (Германия).
Торговое название: Баста, Либерти.
Действующее вещество: глюфосинат аммоний.
Аммоний DL-гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфинат (ИЮПАК).
Эмпирическая формула: C5H15N2O4P.
Молекулярная масса: 198,2.
Кристаллический порошок со слабым специфическим запахом.
Температура плавления: 215 °C.
Давление паров при 20 °C: менее 0,1 мПа.
Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow logP < 0,1.
Растворимость (г/л) при 20 °C: вода - 1370, ацетон - 0,16, этанол - 0,65, этилацетат - 0,14, толуол - 0,14, гексан - 0,2.
Вещество стабильно при нормальных условиях хранения, не гидролизуется в умеренно кислых и щелочных средах.
Достаточно быстро разрушается в воде и почве: DT50 в воде = 2 - 30 дней, DT50 в почве = 3 - 20 дней.
Гигиенические нормативы: ОДУ в воде - 0,01 мг/дм3; в семенах и масле подсолнечника - 0,4 мг/кг.
Область применения препарата
Глюфосинат аммоний (I) - неселективный контактный гербицид с ограниченной системностью, передвигающийся только внутри обработанных листьев. В процессе поступления в растение вещество диссоциирует и в клетках присутствует только глюфосинат свободная кислота (II). Гербицид используется для уничтожения однолетних и многолетних широколистных и злаковых сорняков в парах, посадках плодовых и цитрусовых культур, ягодных кустарниках и виноградниках путем направленного опрыскивания в период активного роста сорных растений, а также на овощных культурах при довсходовом применении препарата. Глюфосинат аммоний применяется также для десикации ботвы картофеля, подсолнечника, клещевины, люцерны и сеникации яровой пшеницы. Выпускается в виде водного раствора и эмульгирующего концентрата.
Проходит перерегистрацию в России и странах СНГ под торговым названием Баста (водный раствор, 150 г/л) в качестве десиканта на посевах подсолнечника при норме расхода препарата до 2,0 л/га (по д.в. до 0,3 кг/га) и однократной обработке в фазе начала естественного созревания семян при 70 - 80 % побуревших корзинок.
Глюфосинат аммоний в воде и растениях подвергается разрушению, в результате чего образуется 3-метилфосфино-пропионовая кислота (III).
Глюфосинат свободная кислота
DL-гомоаланин-4-ил-(метил)-фосфиновая кислота (ИЮПАК)
Эмпирическая формула: C5H12NO4P.
Молекулярная масса: 181,1.
Метаболит глюфосинат аммония.
3-метилфосфино-пропионовая кислота (ИЮПАК).
Эмпирическая формула: С4Н9О4Р.
Молекулярная масса: 152,1.
2. Методика определения остаточных количеств глюфосинат аммония и его метаболита в воде, семенах и масле подсолнечника газохроматографическим методом
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Метод основан на газохроматографическом определении глюфосинат аммония и его метаболита на неподвижной фазе FFAP с использованием термоионного детектора (ТИД) после экстракции веществ из воды анионообменной смолой, из семян и масла - водой и очистки экстрактов на анионообменной смоле Дауэкс-1´8, дериватизации веществ с помощью триметилортоацетата в кислой среде и последующей очистки полученных производных на колонке с силикагелем. В результате дериватизации глюфосинат аммония превращается в метил-4-(метоксиме-тил)фосфинил-2-ацетамидобутират (IV), а метаболит - в метил-3-(мето-ксиметил)фосфинилпропионат (V).
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
2.1.2. Избирательность метода
В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании подсолнечника.
2.1.3. Метрологическая характеристика метода
Таблица
Метрологическая характеристика метода
|
Метрологические параметры, Р = 0,95, п = 20 |
||||||
|
предел обнаружения, мг/дм3, мг/кг |
диапазон определяемых концентраций, мг/дм3, мг/кг |
среднее значение определения, % |
стандартное отклонение, S, % |
относительное отклонение, DS, % |
доверительный интервал среднего, % |
|
|
Глюфосинат аммоний |
||||||
|
Вода |
0,005 |
0,005 - 0,05 |
84,7 |
5,4 |
2,7 |
± 5,8 |
|
Семена |
0,2 |
0,2 - 2,0 |
88,4 |
4,8 |
2,4 |
± 5,0 |
|
Масло |
0,2 |
0,2 - 2,0 |
87,6 |
4,8 |
2,4 |
± 5,1 |
|
3-метилфосфино-пропионовая кислота |
||||||
|
Вода |
0,005 |
0,005 - 0,05 |
85,3 |
4,8 |
2,4 |
± 5,1 |
|
Семена |
0,2 |
0,2 - 2,0 |
89,6 |
5,1 |
2,6 |
± 5,4 |
|
Масло |
0,2 |
0,2 - 2,0 |
86,7 |
5,6 |
2,8 |
± 5,9 |
2.2. Реактивы, растворы и материалы
Глюфосинат аммоний /I/ с содержанием д.в. 99,2 % (Авентис КропСайенс, Германия)
Глюфосинат свободная кислота /II/ с содержанием д.в. 99,9 % (Авентис КропСайенс, Германия)
3-метилфосфино-пропионовая кислота (III) с содержанием д.в. 97,9 % (Авентис КропСайенс, Германия)
Метил-4-(метоксиметил)фосфино-2-ацетамидобутират /IV/ с содержанием д.в. 98,9 % (Авентис КропСайенс, Германия)
Метил-3-(метоксиметил)фосфино-пропионат/V/ с содержанием д.в. 98,8 % (Авентис КропСайенс, Германия)
Аммиак водный (28 - 30 % NH3), чда ГОСТ 3760-79
Вода дистиллированная или деионизованная ГОСТ 7602-72
н-Гексан, ч ТУ 6-09-3375-78
Кальция хлорид, хч ГОСТ 4161-77
Кислота муравьиная (98 %), хч ГОСТ 5848-73
Кислота уксусная, ледяная, хч ГОСТ 61-75
Метилацетат, ч ТУ 6-09-09-300-87
Натрия гидроксид, хч ГОСТ 4328-77
Натрия сульфат, безводный, хч ГОСТ 4166-76
Спирт метиловый, хч ГОСТ 6995-77
Толуол, хч ГОСТ 5789-78
Триметилортоацетат (98 %) /Мерк, Германия/
Элюенты для колоночной хроматографии: смеси метилацетат - метанол (95:5 и 8:2, по объему)
Алюминия оксид для хроматографии нейтральный, I степени активности (8 - 10 мкм) /Серва, Германия/
Анионообменная смола Дауэкс 1´8 (СГ-форма, 100 - 200 меш.) /Супелко, США/
Азот газообразный, осч ГОСТ 9293-74
Водород, получаемый из генератора водорода ГОСТ 3023-80
Воздух из баллона ГОСТ 9.010-80
Вата хлопковая
Насадки для колонки Газ-хром Q с 2 % FFAP (0,15 - 0,2 мм)
Силикагель для адсорбционной хроматографии (Серва, Германия) 1 степени активности или силикагель КСК (60 - 100 меш.)
Стекловата
Фильтры бумажные «синяя лента» ТУ 6-09-1678-77
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Хроматограф газовый «Кристалл 2000 М» с ТИД на фосфорсодержащие вещества (с пределом детектирования по фосфору в метафосе не выше 1,7 ´ 10-14 г/см3)
Колонка хроматографическая, стеклянная, 1000 ´ 3 мм, неподвижная фаза - 2 % FFAP на Газ-хром Q (0,15 - 0,20 мм)
Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф ТУ 64-1-2850
Баня ультразвуковая, модель D-50 (Branson Instr. Co., США)
Весы аналитические типа ВЛР-200 ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос ГОСТ 10696-75
Встряхиватель механический ТУ 64-1-1081-73
Иономер ЭВ-74 или аналогичный ГОСТ 22261-76
Кофемолка, модель ИП-30 ГОСТ 23511-70
Плитка электрическая ГОСТ 14919-83Е
Ротационный испаритель тип ИР-1М ТУ 25-11-917-76
Центрифуга МРТУ 42-219-69
Воронка Бюхнера ГОСТ 0147-73
Воронки делительные, вместимостью 250 мл ГОСТ 25336-82
Воронки для фильтрования, стеклянные ГОСТ 8613-75
Колба Бунзена ГОСТ 5614-75
Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 100 мл ГОСТ 9737-70
Колбы конические с притертыми пробками, вместимостью 250 мл
Колбы мерные, вместимостью 100 и 1000 мл ГОСТ 1770-74
Колбы грушевидные, вместимостью 100 и 250 мл ГОСТ 25336-82
Пипетки мерные, вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл ГОСТ 20292-74Е
Пробирки градуированные с притертыми пробками, вместимостью 5 мл
ГОСТ 10515-75
Холодильник обратный ГОСТ 9737-70
Цилиндры мерные, вместимостью 50, 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74Е
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).
Отобранные пробы семян хранят в стеклянной таре в холодильнике не более суток. Для длительного хранения семена досушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной таре при комнатной температуре. Перед анализом семена измельчают на кофемолке. Масло хранят в холодильнике.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Перед началом работы метилацетат сушат над хлористым кальцием и перегоняют. Метанол перегоняют.
2.5.2. Подготовка и кондиционирование колонки
Готовую насадку (2 % FFAP на Газ-хром Q) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °C в течение 8 - 10 ч.
2.5.3. Приготовление 10 %-го раствора муравьиной кислоты
В мерную колбу вместимостью 1 л, содержащую 200 - 300 мл деионизованной воды, добавляют 100 мл муравьиной кислоты (98 %), перемешивают и доводят до метки деионизованной водой.
2.5.4. Приготовление 1 М раствора гидроксида натрия
40 г NaOH переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют 500 - 600 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения осадка, охлаждают раствор до комнатной температуры и доводят водой до метки.
2.5.5. Приготовление 0,015 М раствора водного аммиака
Переносят 10 мл водного аммиака (содержит 28 - 30 % NH3) в мерную колбу на 1 л, добавляют 500 мл деионизованной воды, перемешивают и доводят водой до метки.
2.5.6. Приготовление стандартных растворов
Отвешивают 139 мг метил-4-(метоксиметил)фосфинил-2-ацетамидобутирата (IV) и 100 мг метил-3-(метоксиметил)фосфинилпропионата (V) в отдельные мерные 100 мл колбы и вещества растворяют в метаноле. Концентрация этих веществ в растворах составляет 1 мг/мл в пересчете на эквивалент глюфосинат свободной кислоты (II). Основные стандартные растворы IV и V хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
Отбирают по 1 мл основных стандартных растворов IV и V, переносят в мерную колбу на 100 мл, добавляют 50 мл метилацетата, перемешивают и доводят метилацетатом до метки. Полученный раствор содержит IV и V в концентрации 10 мкг/мл в пересчете на эквивалент II. Раствор хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
Из полученного смесевого раствора готовят рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 мкг/мл путем соответствующего последовательного разбавления метилацетатом. Все растворы хранят в холодильнике не более одного месяца.
2.5.7. Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора IV и V с концентрацией 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ · с от концентрации IV и V в растворе в мкг/мл (в эквивалентах II).
2.5.8. Приготовление растворов для фортификации
Отвешивают 109 мг глюфосинат аммония (I) в мерную колбу на 100 мл, добавляют 60 - 70 мл 0,015 М раствора водного аммиака, перемешивают до полного растворения вещества и доводят объем этим же растворителем до метки. Концентрация I в растворе (А) составляет 1 мг/мл в пересчете на эквивалент II. Раствор хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
Отвешивают 84 мг III в мерную колбу емкостью 100 мл, добавляют 60 - 70 мл 0,015 М раствора водного аммиака, перемешивают до полного растворения вещества и доводят объем этим же растворителем до метки. Концентрация III в растворе (B) составляет 1 мг/мл в пересчете на эквивалент II. Раствор хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
Переносят в мерную колбу на 100 мл по 1 мл растворов A и B и доливают 0,015 М раствор водного аммиака до метки. Концентрация I и III в растворе (С) составляет 10 мкг/мл в пересчете на эквивалент II. Раствор хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
Переносят в мерную колбу на 100 мл по 1 мл растворов A и B и доливают ацетонитрил до метки. Концентрация I и III в растворе (D) составляет 10 мкг/мл в пересчете на эквивалент II. Раствор хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
Раствор C используют для добавления в пробы семян, а раствор D в пробы масла при изучении полноты открывания глюфосинат аммония и его метаболита в элементах урожая подсолнечника.
2.5.9. Подготовка анионообменной смолы и колонки
Заливают 100 г анионообменной смолы Дауэкс 1´8 (Cl--форма) / 100 - 200 меш./ 1 л 1 М раствора гидроксида натрия и перемешивают суспензию в течение 2 мин. После 30-минутного стояния суспензию фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Смолу на фильтре промывают деионизованной водой до тех пор, пока pH фильтрата не снизится до 5,5 - 7. Обычно для приготовления 100 г смолы расходуют 3 - 5 л воды.
В нижнюю часть стеклянной колонки (1,2´25 см) помещают тампон из стекловаты и в колонку (при открытом кране) медленно выливают суспензию смолы в воде таким образом, чтобы высота столбика сорбента составила 12 см. Колонку промывают 30 мл деионизованной воды со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
2.5.10. Подготовка колонки с силикагелем
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,2 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают около 5 мл метилацетата. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 10 мл метилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 10 мл метилацетата со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
2.6. Описание определения
2.6.1. Экстракция глюфосинат аммония и метаболита
2.6.1.1. Вода. Образец воды объемом 100 мл вносят в подготовленную колонку с анионообменной смолой (п. 2.5.9) и пропускают через колонку со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 50 мл деионизованной воды и затем элюируют глюфосинат аммония и метаболит 80 мл 10 %-й муравьиной кислоты с указанной выше скоростью.
Элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 55 °C в грушевидной колбе емкостью 100 мл. К остатку приливают 10 мл деионизованной воды и раствор упаривают досуха. Дальнейшие дериватизацию и очистку проводят по пп. 2.6.3 и 2.6.4.
2.6.1.2. Семена. Навеску (10 г) измельченного материала помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, добавляют 80 мл деионизованной воды и 20 мл гексана и суспензию перемешивают в течение 30 мин на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают 50 мл деионизованной воды. Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку емкостью 200 мл, которую помещают в холодильник на 15 мин. Отбирают нижнюю водную фазу в мерный цилиндр емкостью 250 мл и доводят деионизованной водой до объема 200 мл. Отбирают аликвоту раствора (100 мл), эквивалентную 5 г растительного материала, в центрифужную пробирку и центрифугируют при 10000g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость используют для дальнейшей очистки по п. 2.6.2.
2.6.1.3. Масло. Навеску (5 г) масла помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 20 мл гексана, перемешивают и добавляют 80 мл деионизованной воды. Эмульсию перемешивают в течение 30 мин на аппарате для встряхивания и затем переносят в делительную воронку. Коническую колбу ополаскивают 10 мл деионизованной воды и переносят в делительную воронку. Пропускают нижнюю водную фазу через стеклянный фильтр с тампоном из хлопковой ваты в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 55 °C. Дальнейшие дериватизацию и очистку проводят по п.п. 2.6.3 и 2.6.4.
2.6.2. Очистка на колонке с анионообменной смолой
Аликвоту водного экстракта (из п. 2.6.1.2) вносят в подготовленную колонку с анионообменной смолой (п. 2.5.9) и раствор пропускают со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 50 мл деионизованной воды и затем элюируют глюфосинат аммоний и его метаболит 80 мл 10 %-ной муравьиной кислоты с указанной выше скоростью. Элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 55 °C в грушевидной колбе емкостью 100 мл. К остатку приливают 10 мл деионизованной воды и раствор упаривают досуха.
2.6.3. Дериватизация
К сухому остатку (из п.п. 2.6.1.1, 2.6.1.3 и 2.6.2) приливают 3 мл ледяной уксусной кислоты, перемешивают и колбу помещают в УЗ-баню на 1 мин. Затем в колбу добавляют 12 мл триметилортоацетата и несколько стеклянных кипелок и снова подвергают УЗ-обработке в течение минуты. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 4,5 ч на электроплитке. К охлажденной реакционной смеси трижды добавляют по 15 мл толуола и каждый раз упаривают содержимое на роторном испарителе при температуре 45 °C до объема 1 - 2 мл. Дальнейшую очистку дериватов проводят по п. 2.6.4.
Примечание: При проведении дериватизации посуда и реактивы должны быть сухими.
2.6.4. Очистка на колонке с силикагелем
К раствору дериватов глюфосинат аммония и метаболита (из п. 2.6.3) добавляют 2 мл метилацетата и количественно переносят пипеткой в колонку с силикагелем (п. 2.5.10). Колбу промывают 2 мл метилацетата и переносят их в колонку. Дают растворителю стечь до верхнего слоя сорбента и затем промывают колонку 30 мл смеси метил - ацетат - метанол (95:5, по объему), которые отбрасывают. Дериваты глюфосинат аммония и метаболита элюируют с колонки 50 мл смеси метилацетат - метанол (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Элюат упаривают на роторном испарителе при температуре 40 °C до объема 0,5 - 1 мл. Раствор переносят в градуированную пробирку, колбу промывают 1 мл метилацетата, который также переносят в пробирку. Доводят метилацетатом объем в пробирке до 2 мл и анализируют на содержание дериватов по п. 2.7.
Примечание: При использовании новой партии сорбента или растворителей проводится проверка хроматографического поведения дериватов глюфосинат аммония и его метаболита на колонке.
2.7. Условия хроматографирования
Газовый хроматограф «Кристалл 2000 М» с термоионным детектором на фосфорсодержащие вещества с пределом детектирования (по фосфору в метафосе) не выше 1,7 ´ 10-14 г/см3.
Колонка стеклянная, спиральная 1000´3 мм; неподвижная фаза 2 % FFAP на Газ-хром Q (0,15 - 0,2 мм).
Температура колонки программированная. Начальная температура - 165 °C, выдержка - 5 мин; нагрев колонки по 13 °C в минуту до температуры 230 °C, выдержка - 15 мин.
Температура инжектора - 230 °C, детектора - 320 °C.
Скорость потока газа-носителя (азот) - 30 мл/мин.
Расход водорода - 15 мл/мин.
Расход воздуха - 200 мл/мин.
Объем вводимой пробы - 2 мкл.
Время удерживания метил-4-(метоксиметил)фосфинил-2-ацетамидобутирата - 13 мин.
Время удерживания метил-3-(метоксиметил)фосфинилпропионата - 2 мин 50 с.
Предел детектирования - 1 нг.
Линейный диапазон детектирования - 1 - 10 нг.
Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 5,0 мкг/мл, разбавляют метилацетатом.
Альтернативная фаза: 1 % ХЕ-60 + 1 % SF-96 на Хромосорбе W-HP, длина колонки 1 м. Температурный режим, как указано выше. Время удерживания метил-3-(метоксиметил)фосфинилпропионата - 2 мин 30 с, метил-4-(метоксиметил)-фосфинил-2-ацетамидобутирата- 12 мин 10 с.
2.8. Обработка результатов анализа
Содержание глюфосинат аммония (в эквивалентах глюфосинат свободной кислоты) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
где
Х - содержание глюфосинат аммония в пробе, мг/дм3, мг/кг;
Н1 - площадь пика образца, мВ · с;
Н0 - площадь пика стандарта, мВ · с;
А - концентрация стандартного раствора деривата (в эквивалентах глюфосинат свободной кислоты), мкг/мл;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
т - масса анализируемого образца, мл или г (для воды - 100 мл, для семян и масла - 5 г).
Содержание 3-метилфосфино-пропионовой кислоты (в эквивалентах глюфосинат свободной кислоты) рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
где
X - содержание 3-метилфосфино-пропионовой кислоты в пробе, мг/дм3, мг/кг;
Н1 - площадь пика образца, мВ*с;
Н0 - площадь пика стандарта, мВ*с;
А - концентрация стандартного раствора деривата (в эквивалентах глюфосинат свободной кислоты), мкг/мл;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
т - масса анализируемого образца, мл или г (для воды - 100 мл, для семян и масла - 5 г).
3. Требования техники безопасности
Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
4. Контроль погрешности измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95 «ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».
5. Разработчики
Л.В. Дубовая, Т.Н. Талалакина, А.М. Макеев.
ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.
СОДЕРЖАНИЕ