4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Контроль сыворотки крови
крупного рогатого скота на присутствие
посторонних вирусов и микоплазм
Методические указания
МУК 4.2.2123-06
1. Разработаны: ФГУН «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича» Роспотребнадзора (Н.В. Шалунова, З.Е. Бердникова, Е.М. Петручук).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 2 от 11.07.06).
3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 августа 2006 г.
4. Введены взамен: РД 42-28-14-88 «Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм».
УТВЕРЖДАЮ
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации
Г.Г. Онищенко
17 августа 2006 г.
Дата введения: с момента утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на присутствие посторонних вирусов и микоплазм
Методические указания
МУК 4.2.2123-06
1. Область применения
1.1. Методические указания устанавливают методы контроля коммерческой сыворотки крови крупного рогатого скота (далее - сыворотка) на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. Сыворотка широко применяется при культивировании органов и тканей животных, используемых для приготовления профилактических и диагностических иммунобиологических препаратов и в научных исследованиях. Сыворотка является одним из компонентов питательных сред, используемых для культивирования первичных и перевиваемых клеточных культур.
1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, выпускающих и контролирующих медицинские иммунобиологические профилактические препараты.
1.3. Методические указания также могут использоваться организациями, зарегистрированными в Российской Федерации, выпускающими и контролирующими медицинские иммунобиологические профилактические препараты, и специалистами научных лабораторий.
2. Общие положения
Контроль сыворотки на присутствие посторонних вирусов предусматривает использование первично-трипсинизированных и перевиваемых клеточных культур, являющихся высокочувствительными и доступными для выявления наиболее часто встречающихся вирусов-контаминантов. В этих культурах хорошо размножаются с развитием цитопатических изменений вирусы парагриппа, инфекционного ринотрахеита, диареи и аденовирусы. Продолжительность контроля 28 сут.
Контроль сыворотки на присутствие микоплазм предусматривает проведение двух методов:
1. Микробиологический метод. Метод основан на выявлении роста микоплазм при внесении испытуемой сыворотки в питательные среды. Продолжительность контроля 21 сут.
2. Метод индикаторной клеточной культуры (цитохимический метод).
Метод основан на выявлении ДНК микоплазм, окрашенных флюорохромом Hoechst - 33258 на индикаторной клеточной культуре Vero.
Продолжительность контроля 3 - 5 сут.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, оборудование, реактивы и материалы
3.1. При выполнении контроля должны быть применены следующие средства измерений, оборудование и вспомогательные устройства:
весы аптечные от 1 до 20 г, погрешность
± 20 мг ТУ 64-1-2834-80
колбы стеклянные, конические,
вместимостью 50 мл, 100 мл ГОСТ 25336-82Е
стакан химический вместимостью 1000 мл ГОСТ 25336-82Е
пипетки градуированные от 1,0 до 10,0 мл ГОСТ 29227-91
пробирки бактериологические
вместимостью от 10,0 до 20,0 мл ГОСТ 25336-82Е
стакан химический, вместимостью
1000 мл ГОСТ 25336-82Е
флаконы для культивирования из
нейтрального стекла (матрасы) ГОСТ 5636-70
флаконы, вместимостью 100, 500 мл МРТУ 5031-32
мешалка магнитная МРТУ 64-1-1503-67
микроскоп биологический (любой модели)
микроскоп люминесцентный серии ЛЮМАМ
ножницы медицинские ГОСТ 21239-93
пинцеты анатомические ТУ 64-1-37-78
пробки резиновые ТУ 38.006269-95
стекла предметные ТУ 9464-001-33016370-95
чашки Петри (однократного применения) ТУ 64-2-19-79
воронка стеклянная ГОСТ 25336-82Е
камера Горяева ТУ 9443-001-11856833-94
термостат на температуру 37 °С с погрешностью
измерения не более ±1 °С
холодильник с температурой от 4 до 10 °С
вместимостью 1000 мл
холодильник с температурой минус (20 ± 4) °С
центрифуга ЦЛС-3 МРТУ 42.1778-65 (495)
3.2. При выполнении контроля должны быть применены следующие реактивы и материалы:
бензилпенициллина натриевая соль ФСП 42-0048-1083-01
стрептомицина сульфат ФС 42-3726-99
версена раствор ФСП 42-0196-3274-02
вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
гидролизат сердца крупного рогатого скота
дрожжи хлебопекарные прессованные ГОСТ 171-81
глицерин, чда ГОСТ 6259-75
масло иммерсионное кедровое (чистое) ТУ 81-05-79-75
мясная вода ТУ 42.14.271-82
натрия гидроокись ГОСТ 4228-77
натрия хлорид ГОСТ 4233-77
раствор Хенкса ФСП 42-0343-3541-02
спирт этиловый ректификованный 96° ГОСТ 18300-87
питательная среда ДМЕМ ФСП 42-0343-3544-02
сыворотка крови крупного рогатого скота,
жидкая для культур клеток
(предварительно отконтролированная на
присутствие посторонних вирусов и микоплазм) ФСП 42-0196-4672-03
тестикулы эмбрионов быка (получают на
мясокомбинате, срок хранения не более 1 сут.
при температуре от 4 до 10 °С)
трипсин (0,25 %-й раствор) ФСП 42-0343-3805-03
хлороформ ГОСТ 20015-88
бумага фильтровальная ГОСТ 12026-761
вата медицинская гигроскопическая ТУ 8195-01116673801-99
марля медицинская ГОСТ 9412-93,
ТУ 9390-0119-34576906-95.
4. Требования безопасности
Работу с микроорганизмами 3 и 4 групп проводят в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».
5. Условия проведения контроля
Подготовительные операции и испытания на присутствие посторонних вирусов и микоплазм проводят в чистых помещениях класса А/В (GMP) с ламинарным потоком воздуха при соблюдении правил асептики, при температуре (20 ± 2) °С и относительной влажности 60 - 70 %.
6. Контроль сыворотки на присутствие посторонних вирусов
При выполнении контроля используют два вида клеточных культур: первично-трипсинизированные-тестикулы эмбрионов быка (ТБ) 4 - 6-месячного возраста и перевиваемые - почки быка (МДВК) или любые другие перевиваемые клеточные культуры почки крупного рогатого скота, в которые вносят исследуемые сыворотки. Принцип метода основан на появлении цитопатического действия (ЦПД) или гемадсорбции под действием вирусов-контаминантов.
6.1. Подготовка к выполнению контроля
При подготовке к выполнению контроля сыворотки на присутствие посторонних вирусов должны быть выполнены следующие операции:
6.1.1. Приготовление первично-трипсинизированной клеточной культуры тестикулов эмбрионов быка (ТБ).
6.1.2. Доставляют тестикулы эмбрионов быков 4 - 6-месячного возраста с перевязанной мошонкой с мясокомбината в любом стерильном сосуде с 250 - 270 мл раствора Хенкса с 500 ед/мл бензилпенициллина калиевой или натриевой соли.
6.1.3. Обжигают кожу мошонки над пламенем горелки и обрабатывают тампоном со спиртом.
6.1.4. Срезают ножницами кожу с кончика мошонки и, подтягивая тестикулы за семенные канатики, извлекают их.
6.1.5. Помещают тестикулы в стерильную чашку Петри и удаляют ножницами белочную оболочку.
6.1.6. Переносят тестикулы в чашку Петри с 30 - 35 мл раствора Хенкса с 100 ед/мл антибиотика.
6.1.7. Разрезают тестикулы вдоль и вылущивают ножницами содержимое в раствор Хенкса.
6.1.8. Промывают ткань тестикулов до просветления жидкости 2 - 3 раза в растворе Хенкса с 500 ед/мл антибиотика.
6.1.9. Помещают ткань тестикулов в колбу вместимостью 500 мл с перемешивающим стержнем, прилагаемым к магнитной мешалке.
6.1.10. Нагревают 0,2 %-й раствор трипсина до температуры (20 ± 2) °С и наливают 100 - 150 мл в колбу. Колбу ставят на магнитную мешалку и включают ее. Скорость вращения перемешивающего стержня должна быть такой, чтобы жидкость не пенилась и стержень не ударялся о стенки колбы.
Перемешивание проводят 5 - 6 мин.
6.1.11. Сливают надосадочную жидкость после первого цикла трипсинизации в колбу для отходов.
6.1.12. Проводят 4 - 5 циклов трипсинизации.
6.1.13. Сливают надосадочную жидкость после каждого цикла во флаконы вместимостью 100 мл.
6.1.14. Помещают флаконы в центрифугу и осаждают клетки при скорости 1000 - 1500 об/мин в течение 10 - 15 мин.
6.1.15. Вынимают флаконы из центрифуги, сливают надосадочную жидкость в сосуд для отходов.
6.1.16. Добавляют в каждый флакон к осадку клеток по 10 - 15 мл среды 0,5 %-го гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса.
6.1.17. Объединяют полученные суспензии клеток в один флакон и отбирают пипеткой (0,5 ± 0,01) мл.
6.1.18. Добавляют к 0,5 мл этой суспензии 0,5 мл 0,1 %-го раствора метиленового синего и подсчитывают окрашенные клетки в камере Горяева при увеличении 70´. Для точности результатов подсчет проводят в нескольких пробах. Количество клеток в 1 мл подсчитывают по формуле:
X - концентрация клеток в 1 мл исходной суспензии;
а - среднее число клеток в нескольких пробах;
0,9 - объем камеры Горяева в мм3;
1000 - число мм3 в 1 см3;
2 - коэффициент разведения суспензии добавленным объемом краски.
6.1.19. Разводят суспензию клеток средой ДМЕМ во флаконе по п. 6.1.17 с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 4 - 5 ´ 105 клеток/мл.
6.1.20. Вносят в каждый из 2 флаконов вместимостью 1000 мл по 100 - 120 мл разведенной суспензии клеток и добавляют 10 % сыворотки, предварительно отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм.
6.2. Культивирование и подготовка перевиваемой клеточной культуры почки быка (МДВК)
6.2.1. Готовят во флаконе вместимостью 100 мл 50 мл смеси, состоящей из равных объемов 0,02 %-го раствора версена и 0,25 %-го раствора трипсина и нагревают ее до температуры (20 ± 2) °С.
6.2.2. Просматривают флаконы с МДВК вместимостью 1000 мл под микроскопом при увеличении 70´ и отбирают с полным монослоем клеток.
6.2.3. Сливают питательную среду из флаконов в сосуд для отходов и добавляют смесь версена и трипсина.
6.2.4. Оставляют клетки в смеси версена и трипсина при температуре (20 ± 2) °С и наблюдают за ними визуально.
6.2.5. Когда начнется «набухание» и слабое «отслоение» клеток от стекла (обычно через 15 - 20 мин), сливают смесь версена и трипсина в сосуд для отходов.
6.2.6. Флаконы с клеточной культурой помещают при температуре (37 ± 1) °С на 30 - 35 мин.
6.2.7. Добавляют во флаконы по 50 мл среды ДМЕМ и встряхивают их так, чтобы все клетки отделились от стекла.
6.2.8. Подсчитывают клетки в камере Горяева, как указано в п. 5.1.18.
6.2.9. Разводят клетки средой ДМЕМ с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 2 ´ 105 клеток/мл.
6.2.10. Вносят в каждый из 2 флаконов по 100 - 120 мл разведенной суспензии клеток и добавляют 10 % сыворотки, предварительно отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм.
6.2.11. Через 5 - 6 сут. просматривают флаконы под световым микроскопом и отбирают с полным монослоем клеток.
6.3. Выполнение контроля сыворотки на присутствие посторонних вирусов
При выполнении контроля сыворотки на присутствие посторонних вирусов должны быть выполнены следующие операции:
6.3.1. Отбирают по 1 флакону с клеточными культурами ТБ и МДВК для проверки испытуемой сыворотки и по 1 флакону с теми же культурами в качестве контрольных.
6.3.2. Сливают питательную среду из флаконов в сосуд для отходов.
6.3.3. Монослой клеток ТБ и МДВК промывают 3 раза средой ДМЕМ без сыворотки.
6.3.4. Вносят пипеткой в каждый из двух флаконов вместимостью 1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл испытуемой сыворотки так, чтобы разведение в среде не превышало 1 : 4 из расчета не менее 3 см2 площади на 1 мл сыворотки.
Одновременно вносят пипеткой в каждый из двух контрольных флаконов вместимостью 1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл сыворотки, ранее отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм.
6.3.5. Инкубируют клеточные культуры ТБ и МДВК при температуре (20 ± 2) °С (60 ± 5) мин.
6.3.6. Сливают сыворотку и добавляют в опытные и контрольные флаконы с культурами ТБ и МДВК по 75 мл среды ДМЕМ.
Инкубируют при температуре (37 ± 1) °С 14 сут.
6.3.7. С целью обнаружения цитопатогенного действия (ЦПД) просматривают опытные и контрольные клеточные культуры под микроскопом на 2, 5, 7, 10 и 14 сут.
6.3.8. Если в опытных и контрольных клеточных культурах не будет наблюдаться ЦПД, через 14 сут. их трижды замораживают при температуре минус (20 ± 2) °С и размораживают при температуре (37 ± 2) °С.
6.3.9. После размораживания культуры флаконы встряхивают, отбирают из каждого флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл суспензии и вносят во флаконы с клетками того же вида. Два флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК оставляют для контроля.
6.3.10. Вносят в опытные и контрольные клеточные культуры ТБ и МДВК по 75 мл среды ДМЕМ.
6.3.11. Клеточные культуры инкубируют при температуре (37 ± 2) °С в течение 14 сут.
Если в течение 14 сут. в опытных и контрольных клеточных культурах не наблюдается ЦПД, их проверяют на наличие гемадсорбирующих вирусов.
6.3.12. Сливают из флаконов питательную среду и промывают культуры 3 раза раствором Хенкса.
6.3.13. Добавляют в опытные и контрольные клеточные культуры по 50 мл 0,25 %-й взвеси куриных эритроцитов и эритроцитов морской свинки и инкубируют их при температуре (37 ± 2) °С.
6.3.14. Через 30 - 35 мин эритроциты из флаконов удаляют, а монослой промывают раствором Хенкса и просматривают под микроскопом при увеличении 70х.
6.4. Учет результатов
6.4.1. Если в клеточных культурах при первичной инокуляции сыворотки и в пассаже не выявлено ЦПД и не отмечено гемадсорбции, сыворотка признается пригодной.
6.4.2. Если при исследовании наблюдается ЦПД или отмечается гемадсорбция в испытуемых клеточных культурах при отсутствии в контроле, сыворотку бракуют.
6.4.3. Если ЦПД или гемадсорбция появились в контрольных и в опытных клеточных культурах, допускается однократный переконтроль сыворотки.
7. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм
7.1. Микробиологический метод контроля сыворотки на присутствие микоплазм
Обнаружение микоплазм микробиологическим методом предусматривает внесение исследуемой сыворотки в бульонную питательную среду, инкубирование в течение 7 сут. и последующий высев на питательную среду, содержащую 0,3 % агара.
7.2. Чувствительность микробиологического метода
Микробиологический метод контроля сыворотки позволяет обнаруживать одну и более колоний микоплазм в объеме не более 100 мл сыворотки.
7.3. Приготовление бульонной среды
7.3.1. Для приготовления 1 л среды к 200 мл триптического гидролизата бычьего сердца (содержание сухих веществ 8 - 10 %) добавляют 400 мл мясного экстракта 1 : 2 (содержание сухих веществ 3,0 - 3,5 %), экстракт хлебопекарных дрожжей из расчета 1,5 г сухих веществ на 1 л среды, и 5,0 г хлорида натрия.
7.3.2. С помощью 10 %-го раствора NaOH устанавливают значение рН бульонной среды от 8,0 до 8,2.
7.3.3. Среду нагревают до кипения, кипятят 2 - 3 мин, фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
7.3.4. Разливают по 300 - 305 мл во флаконы, закрытые ватно-марлевыми или резиновыми пробками и завальцованные алюминиевыми колпачками, и стерилизуют автоклавированием при температуре 110 °С 30 мин. С помощью 5 %-го раствора соляной кислоты устанавливают рН от 7,8 до 8,0.
7.3.5. Для приготовления среды, содержащей 0,3 % агара, дополнительно вносят 3,0 г агара.
Готовые среды хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 4 мес.
7.4. Стерильность питательной среды
7.4.1. Для испытания на стерильность отбирают не менее 2 % от количества емкостей в серии. Определение проводят путем визуального просмотра каждого флакона с питательной средой после выдерживания в течение 44 - 48 ч при температуре (37 ± 1) °С и 14 сут. при температуре 20 - 25 °С.
7.4.2. В случае пророста хотя бы в одном флаконе бракуют всю серию. Далее питательная среда не используется.
7.5. Определение ростовых свойств среды, содержащей 0,3 % агара
Каждую серию приготовленной среды проверяют на ростовые свойства, используя тест-штамм Mycoplasma arginini G 230 (ОСО 42-28-378-05).
Среду считают чувствительной и признают годной, если результаты ее испытания соответствуют Инструкции по применению ОСО 42-28-378-05.
7.6. Подготовка сред для контроля
7.6.1. Перед употреблением полужидкую среду, содержащую 0,3 % агара, разогревают в водяной бане до полного расплавления агара и охлаждают до температуры 40 - 45 °С.
7.6.2. Добавляют 15 - 20 % нормальной сыворотки крови лошади без консерванта, предварительно проверенной на стерильность и присутствие микоплазм, и 100 ед/мл бензилпенициллина натриевой соли.
7.6.3. Разливают по 10 мл в бактериологические пробирки и закрывают ватно-марлевыми пробками. Хранят среду при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.
7.7. Выполнение контроля сыворотки на присутствие микоплазм микробиологическим методом
При выполнении контроля сыворотки микробиологическим методом должны быть выполнены следующие операции:
7.7.1. Вносят (300 ± 2) мл бульонной среды во флакон вместимостью 500 мл. Флакон закрывают ватно-марлевой пробкой.
7.7.2. Вносят (100 ± 2) мл исследуемой сыворотки в (300 ± 2) мл бульонной среды. Смесь инкубируют 7 сут при температуре (37 ± 1) °С и относительной влажности 80 - 90 %.
7.7.3. Отбирают 10 пробирок со средой, содержащей 0,3 % агара, и вносят в каждую пробирку по (1,0 ± 0,1) мл смеси исследуемой сыворотки и бульонной среды. Посев проводят прокалыванием всего столбика питательной среды, содержащейся в пробирке, концом пипетки вместимостью 1,0 мл, выпуская равномерно ее содержимое, начиная от дна до поверхности.
7.7.4. Инкубируют посевы 14 сут. при температуре (37 ± 1) °С и относительной влажности 80 - 90 %.
7.8. Учет результатов
7.8.1. Учет результатов проводят путем визуального просмотра засеянных пробирок в проходящем свете на 4, 7, 10, 14 сут.
7.8.2. Сыворотка считается свободной от микоплазм, если через 14 сут. не обнаруживают роста микоплазм ни в одной из засеянных пробирок.
7.8.3. В случае получения сомнительных результатов проводят повторный контроль.
7.8.4. При повторном контроле, при наличии роста микоплазм хотя бы в одной пробирке, сыворотка считается контаминированной микоплазмами.
8. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры (цитохимический метод)
Метод обнаружения микоплазм с использованием индикаторной клеточной культуры Vero основан на внесении испытуемой сыворотки в клеточную культуру и обработку препарата специфическим флюоресцирующим красителем Hoechst-33258, окрашивающим ДНК клеток и микоплазм. Возможно применение другого флюорохрома, аттестованного в ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Клеточную культуру Vero (или другую чувствительную к микоплазмам) получают из банка клеток, аттестованного в соответствии с требованиями ВОЗ в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
8.1. Подготовка к выполнению контроля на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры
При подготовке к выполнению контроля сыворотки на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры должны быть выполнены следующие операции: приготовление основного и рабочего раствора красителя Hoechst-33258, подготовка люминесцентного микроскопа, подготовка предметных стекол.
8.1.1. Приготовление основного и рабочего раствора Hoechst-33258
Соблюдая стерильность, 5 мг концентрата Hoechst-33258 растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды (основной раствор).
Для получения рабочего раствора добавляют концентрат красителя в раствор Хенкса без индикатора в соотношении 1:9 и используют для окраски препаратов немедленно.
8.1.2. Подготовка люминесцентного микроскопа
Используют для анализа препаратов фильтры: ФС1-4, СС15-2, БС8-2. Просматривают препараты при увеличении ок. 10´, об. 90´ масляная иммерсия, или об. 70´ или об. 85´ водная иммерсия.
8.1.3. Подготовка предметных стекол
Промывают стекла в проточной водопроводной воде в течение 10 - 15 мин. Помещают стекла в сосуд с дистиллированной водой и кипятят 5 - 7 мин. После охлаждения до температуры 20 - 22 °С извлекают стекла с помощью пинцета и помещают в чашку Петри. Протирают каждое стекло стерильной салфеткой и помещают на 1 сут. в смесь Никифорова, состоящую из равных объемов 96° этилового спирта и эфира для наркоза. Извлекают стекла с помощью пинцета из смеси Никифорова и протирают каждое стекло стерильной салфеткой. Стерилизуют стекла (30 ± 2) мин при температуре (120 ± 2) °С.
8.2. Выполнение контроля сыворотки на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры
При проведении испытания на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры выполняют следующие операции:
8.2.1. Вносят 1 мл испытуемого материала в чашку Петри диаметром 90 мм, содержащую стерильное предметное стекло и 20 - 23 мл суспензии клеточной культуры Vero в концентрации 105 кл/мл.
8.2.2. Инкубируют чашку Петри с клеточной культурой Vera в течение 3 - 5 сут. при температуре (37 ± 1) °С в анаэробных условиях до формирования 50 - 70 % монослоя. Образование монослоя наблюдают в световом микроскопе при увеличении ок. 10´, об. 20´.
8.2.3. Сливают культуральную жидкость, промывают препарат питательной средой или буфером (рН 7,2 - 7,4).
8.2.4. Помещают предметное стекло на 30 - 35 мин в 96° этиловый спирт.
Сливают спирт и высушивают препарат на воздухе.
8.2.5. Добавляют рабочий раствор красителя Hoechst-33258 и окрашивают в темноте при температуре (37 ± 1) °С в течение 30 - 35 мин.
8.2.6. Сливают краситель, промывают препарат стерильной дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
8.3. Учет результатов
Учет результатов испытания на присутствие микоплазм методом окрашивания ДНК флюорохромом Hoechst-33258 на индикаторной культуре клеток Vero проводят путем просмотра препаратов в люминесцентном микроскопе.
Микоплазмы выглядят, как однородно окрашенные тела сферической формы, имеющие вид отдельных, парных, цепочечных или нитевидных образований яркого зеленоватого свечения. Диаметр обычно находится в пределах 0,1 - 0,3 микрона.
Микоплазмы в виде ярко светящейся зернистости на фоне темной цитоплазмы выявляют по периферии клеток и в межклеточном пространстве.
Условно интенсивность контаминации микоплазмами обозначают знаками креста:
1 крест - единичные микоплазмы в препарате;
2 креста - небольшие скопления микоплазм в поле зрения;
3 креста - отдельные микоплазмы и скопления в 20 - 50 % клеток;
4 креста - максимальное количество микоплазм в виде скоплений в межклеточном пространстве в каждом поле зрения.
В качестве положительных контрольных образцов используют заведомо контаминированные микоплазмами клеточные культуры.
Отрицательными контрольными образцами служат клеточные культуры, в которых описанные выше светящиеся образования не выявлены.
Обнаружение микоплазм в препаратах на индикаторной клеточной культуре Vero свидетельствует о контаминации испытуемого материала микоплазмами.
В случае получения сомнительных результатов следует проводить повторный контроль.
Окончательный ответ о присутствии микоплазм в сыворотке будет учитывать результаты двух методов: микробиологического и метода индикаторной клеточной культуры.
В случае обнаружения микоплазм хотя бы одним методом сыворотка считается контаминированной и бракуется.
Приложение
Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на присутствие посторонних вирусов
|
Результаты контроля |
||
|
ЦПД |
Гемадсорбция |
|
|
Первично-трипсинизированная клеточная культура ТБ |
не обнаружено |
не обнаружено |
|
Перевиваемая клеточная культура МДВК |
не обнаружено |
не обнаружено |
Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на присутствие микоплазм
|
Результаты контроля |
|
|
Микробиологический (посев на питательные среды) |
Отсутствие роста |
|
Цитохимический |
Отсутствие люминесцентного свечения в индикаторной клеточной культуре Vero |
СОДЕРЖАНИЕ