ГОСТ Р 52173-2003

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически
модифицированных источников (ГМИ)
растительного происхождения

ГОССТАНДАРТ РОССИИ
Москва

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Научно-исследовательским институтом питания РАМН (ГУ НИИ питания РАМН), Центром «Биоинженерия» РАН

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»

2 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. № 402-ст

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Содержание

ГОСТ Р 52173-2003

СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного
происхождения

Дата введения 2005-01-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые сырье и продукты (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения.

Метод основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими праймерами.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентилляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия.

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

3 Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 генетически модифицированные источники пищи: Продукты (компоненты), используемые человеком в пищу в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов.

3.2 генетически модифицированный организм: Организм или несколько организмов, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии или содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинацию генов.

3.3 генная инженерия: Совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

4 Аппаратура, материалы и реактивы

4.1 Амплификатор типа «Терцик МС-2» под микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см³ со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [1].

4.2 Прибор для горизонтального электрофореза типа «Mini-Sub Cell GT System» с комплектом кювет и гребенок [2].

4.3 Источник напряжения типа «Power Рас 300» с диапазоном регулируемого напряжения 50 - 300 В [3].

4.4 Видеосистема типа «Gel Doc 2000™», предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминисцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300 - 400 нм, чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию) [4].

4.5 Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.

4.6 Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °С.

4.7 Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 12000 мин^-1) [5].

4.8 Термостат типа «TERMO 24-15» под микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 см³, диапазон температур от 15 °С до 120 °С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5 °С [6].

4.9 Аппарат для встряхивания типа «Вортекс», скорость вращения 250 - 3000 мин^-1.

4.10 Печь микроволновая (мощностью не менее 400 Вт).

4.11 Весы лабораторные общего назначения высокого класса точности (условное обозначение ) с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

4.12 Баня водяная [7].

4.13 pH-метр с набором электродов, с погрешностью ± 0,1 pH.

4.14 Дозаторы с переменным объемом дозирования:

0,2 - 2,0 мм³, шагом 0,01 мм³, точностью ± 1,2 %;

0,5 - 10,0 мм³, шагом 0,01 мм³, точностью ± 0,8 %;

2 - 20 мм³, шагом 0,01 мм³, точностью ± 0,8 %;

20 - 200 мм³, шагом 0,1 мм³, точностью ± 0,6 %;

100 - 1000 мм³, шагом 1 мм³, точностью ± 3 %;

2 - 10 см³, шагом 0,1 см³, точностью ± 0,5 %.

4.15 Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 см³.

4.16 Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000 мм³; 10 см³.

4.17 Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25; 50; 100; 200; 1000 см³ по ГОСТ 12738.

4.18 Цилиндры стеклянные мерные лабораторные на 25; 100; 1000 см³ по ГОСТ 1770.

4.19 Пестик тефлоновый или стеклянная палочка по ГОСТ 21400 под размер микроцентрифужной пробирки вместимостью 1,5 см³.

4.20 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21 Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч.

4.22 Кислота борная по ГОСТ 9656, х. ч.

4.23 Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х. ч. [8].

4.24 Гексадецилтриметиламмониум бромид [9].

4.25 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.

4.26 Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.

4.27 Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х. ч.

4.28 Спирт изопропиловый, х. ч. [10].

4.29 Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.

4.30 Хлороформ по ГОСТ 20015, х. ч.

4.31 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.32 Вода деионизированная [11].

4.33 Трис (оксиметил) аминометан, х. ч. [12].

4.34 2-меркаптоэтанол, х. ч. [13].

4.35 Этидий бромистый, х. ч. [14].

4.36 Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА) [15].

4.37 Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70 °С - 72 °С [16].

4.38 ПЦР буфер [17].

4.39 Агароза для электрофореза (тип II) [18].

4.40 Маркер молекулярной массы ДНК [19].

4.41 Стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0) [20].

4.42 Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-5) [21].

4.43 Нуклеотиды:

2'-дезоксиаденозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ) [22];

2'-дезоксицитидин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ) [23];

2'-дезоксигуанозин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ) [24];

2'-дезокситимидин-5' трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ) [25];

4.44 Праймеры на промотор 35S [26]:

35S-1 5'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС А 3';

35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3'.

4.45 Праймеры на терминатор nos [27]:

nos-1 5'GAA ТСС TGT TGC CGG TCT TG 3';

nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5 Отбор проб

Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья и пищевых продуктов.

6 Подготовка к проведению анализа

6.1 Приготовление растворов

6.1.1 Приготовление раствора концентрацией с (Трис-НС1)=1 моль/дм³

В мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 см³ помещают 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана по 4.33, [12] растворяют в приблизительно 80 см³ деионизированной воды по 4.32, [11]. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят pH раствора до 7,5, затем доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.2 Приготовление раствора концентрацией с (NaCl) = 5 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 29,22 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в приблизительно 80 см³ деионизированной воды, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.3 Приготовление раствора концентрацией с (NaOH) = 30 %

В колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 50 см³ помещают 3 г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, растворяют в 7 см³ деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.4 Приготовление раствора концентрацией с (ЭДТА) = 0,5 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 14,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты по 4.23, [8], растворяют в приблизительно 80 см³ деионизированной воды. Раствором гидроокиси натрия, приготовленным по 6.1.3, доводят pH раствора до 8,0, деионизированной водой доводят до метки и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.5 Приготовление лизирующего буфера

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см³ помещают 0,5 г бромида гексадецилтриметиламмония, растворяют в 10 см³ деионизированной воды, добавляют автоматическим микродозатором 2,5 см³ раствора Трис-HCl, приготовленного по 6.1.1, 7 см³ раствора хлористого натрия, приготовленного по 6.1.2, 1 см³ раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.4, доводят деионизированной водой до метки, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес. В случае выпадения осадка при хранении раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате по 4.8, [6] при температуре 65 °С до полного растворения.

Непосредственно перед использованием в приготовленный раствор добавляют автоматическим микродозатором меркаптоэтанол по 4.34, [13] из расчета 4 мм³ на 1 см³ лизирующего буфера и перемешивают.

6.1.6 Приготовление хлороформа, насыщенного водой

В колбу вместимостью 200 см³ вносят цилиндром по ГОСТ 1770 100 см³ хлороформа по ГОСТ 20015, добавляют 20 см³ деионизированной воды по ГОСТ 6709, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч для насыщения.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.7 Приготовление 70 %-ного раствора этилового ректификованного спирта

В колбу вместимостью 200 см³ вносят цилиндром 70 см³ 96 %-ного этилового ректификованного спирта по ГОСТ Р 51652, добавляют 26 см³ деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.8 Приготовление раствора концентрацией с (БСА) = 20 мкг/см³

В пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см³ помещают 0,002 г сухого БСА по 4.36, [15], добавляют 1 см³ деионизированной воды, перемешивают до полного растворения. Отбирают 10 мм³ приготовленного раствора и переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см³, добавляют 1 см³ деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °С - не более 1 мес.

6.1.9 Приготовление смеси нуклеотидов концентрацией с = 4 ммоль/дм³

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,2 см³ вносят 96 мм³ деионизированной воды, 1 мм³ АТФ (концентрацией 100 ммоль/дм³) по 4.43, [22], 1 мм³ ГТФ (концентрацией 100 ммоль/дм³) по 4.43, [24], 1 мм³ ЦТФ (концентрацией 100 ммоль/дм³) по 4.43, [23], 1 мм³ ТТФ (концентрацией 100 ммоль/дм³) по 4.43, [25], смесь перемешивают.

Срок хранения при температуре минус 20 °С - не более одного года.

6.1.10 Приготовление 1∙ТВЕ буфера для электрофореза

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты по ГОСТ 9656 и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают до полного растворения.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.1.11 Приготовление раствора концентрацией с (C₂₁H₂₀N₃Br) = 10 мг/см³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 г бромистого этидия по 4.35, [14], растворяют и доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 12 мес.

6.1.12 Приготовление 2 %-ного агарозного геля

6.1.12.1 В плоскодонную стеклянную колбу вместимостью не менее 200 см³ помещают 1 г агарозы по 4.39, [18], добавляют 50 см³ буфера 1∙ТВЕ, приготовленного по 6.1.10, тщательно перемешивают взбалтыванием. Колбу со смесью нагревают в микроволновой печи по 4.10 или на водяной бане при температуре 100 °С и кипятят до полного расплавления агарозы.

6.1.12.2 Расплавленную агарозу, приготовленную по 6.1.12.1, охлаждают при комнатной температуре до 50 °С, автоматическим микродозатором добавляют 5 мм³ раствора бромистого этидия, приготовленного по 6.1.11, тщательно перемешивают круговыми движениями.

6.1.12.3 Однородную смесь, полученную по 6.1.12.2, разливают в кюветы для электрофореза и с помощью гребенки формируют карманы. Через 15 - 30 мин после остывания геля гребенку удаляют.

Допускается хранение геля в 1∙ТВЕ буфере для электрофореза, приготовленного по 6.1.10, в холодильнике при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 7 сут.

6.2 Подготовка пробы

6.2.1 Две навески анализируемого продукта, навеску стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0) по 4.41, [20] и навеску стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-5) по 4.42, [21] массой от 70 до 80 мг каждая помещают в четыре микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 1,5 см³. С помощью дозатора добавляют в каждую по 200 мм³ лизирующего буфера с меркаптоэтанолом по 6.1.5 и немедленно тефлоновым пестиком растирают смесь до получения однородной массы. В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 600 мм³ лизирующего буфера с меркаптоэтанолом. Смесь тщательно перемешивают тефлоновым пестиком, не допуская образования комков. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа «Вортекс».

6.2.2 Приготовленные по 6.2.1 смеси помещают в термостат, инкубируют при температуре 65 °С 40 - 60 мин, после чего повторно перемешивают 30 с на аппарате для встряхивания и центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф по 4.7, [5] при частоте вращения 12000 - 13000 мин-¹.

6.2.3 Надосадочную жидкость приготовленных по 6.2.2 смесей переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см³, не захватывая частицы суспензии из осадка. Затем в каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 400 мм³ хлороформа, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с до образования суспензии. Полученные суспензии центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 12000 мин^-1 при комнатной температуре.

6.2.4 Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.3, из четырех пробирок переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см³, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом и центрифугирование по 6.2.3 повторяют дважды.

6.2.5 Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.4, переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см³, добавляют в каждую из них по 600 мм³ изопропилового спирта по 4.28, [10], предварительно охлажденного в морозильной камере до температуры минус 20 °С, и перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с.

Полученные смеси помещают в морозильную камеру температурой минус 20 °С не менее чем на 30 мин для образования осадка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

На данном этапе допускается хранение полученных смесей до 12 ч в морозильной камере при температуре минус 20 °С.

6.2.6 Смеси, приготовленные по 6.2.5, центрифугируют 6 мин при частоте вращения 12000 мин^-1 при комнатной температуре. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость. Каждый осадок 2 - 3 раза промывают 200 мм³ 70 %-ного этилового ректификованного спирта, приготовленного по 6.1.7, каждый раз перемешивая осадки на аппарате для встряхивания 15 - 20 с и центрифугируя их на микроцентрифуге 6 мин при частоте вращения 12000 мин^-1. Тщательно (до последней капли) удаляют надосадочную жидкость.

6.2.7 Осадки, приготовленные по 6.2.6, растворяют в 50 - 100 мм³ деионизированной воды и получают раствор ДНК.

Растворы ДНК, приготовленные по 6.2.7, непосредственно используют для проведения ПЦР или хранят при температуре минус 20 °С сроком до одного года в морозильной камере.

6.3 Приготовление реакционных смесей № 1 и № 2

6.3.1 Приготовление реакционной смеси № 1 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см³, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 мм³ деионизированной воды, 52,5 мм³ 10∙буфера для ПЦР с хлоридом магния по 4.38, [17], 26 мм³ смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм³ праймера на промотор 35S-l (концентрацией 20 мкмоль/дм³) по 4.44, [26], 13 мм³ праймера на промотор 35S-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм³) по 4.44, [26], 2,5 мм³ фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм³) по 4.37, [16], 52,5 мм³ раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.2 Приготовление реакционной смеси № 2 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см³, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 мм³ деионизированной воды, 52,5 мм³ 10∙буфера для ПЦР с хлоридом магния, 26 мм³ смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм³ праймера на терминатор nos-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм³) по 4.45, [27], 13 мм³ праймера на терминатор nos-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм³) по 4.45, [27], 2,5 мм³ фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм³), 52,5 мм³ раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.3 Реакционные смеси № 1 и № 2, приготовленные по 6.3.1 и 6.3.2, центрифугируют на настольной микроцентрифуге 30 с при частоте вращения 3000 мин^-1. Реакционную смесь № 1 разливают по 90 мм³ в пять микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см³ (или 0,5 см³ в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционную смесь № 2 разливают по 90 мм³ в пять других микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см³ (или 0,5 см³ в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционные смеси № 1 и № 2 готовят непосредственно перед проведением ПЦР.

7 Проведение анализа

7.1 В первые две пробирки с реакционной смесью № 1 и в первые две пробирки с реакционной смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1.1 - 6.2.1.7, по 2 мм³ в каждую.

В третью пробирку с реакционной смесью № 1 и в третью пробирку с реакционной смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0), по 2 мм³ в каждую.

В четвертую пробирку с реакционной смесью № 1 и в четвертую пробирку с реакционной смесью № 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-5), по 2 мм³ в каждую.

В пятую пробирку с реакционной смесью № 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью № 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 мм³ в каждую - холостой опыт.

7.2 В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле (20 - 40 мм³) вазелинового масла по ГОСТ 3164.

7.3 Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos - в таблице 2.

Таблица 1- Условия амплификации для 35S промотора

Стадия	Тип амплификатора
	Crocodile II	Gene Amp 2400	Progene	Trio	Терцик МС-2
Денатурация	2 мин/98 °С	3 мин/94 °С	3 мин/95 °С	2 мин/96 °С	3 мин/94 °С
Амплификация	8 с/95 °С	20 с/94 °С	36 с/95 °С	30 с/95 °С	20 с/94 °С
	30 с/54 °С	40 с/54 °С	72 с/54 °С	40 с/54 °С	40 с/54 °С
	40 с/72 °С	60 с/72 °С	84 с/72 °С	40 с/72 °С	60 с/72 °С
Количество циклов	40	40	40	40	40
Конечное удлинение	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С
Фаза остывания	1 мин/30 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С
Скорость нагрева	1 °С/с	0,77 °С/с	1,5 °С/с	1 °С/с	0,77 °С/с
Скорость остывания	1 °С/с	3,15 °С/с	1,5 °С/с	1 °С/с	3,15 °С/с

Таблица 2 - Условия амплификации для терминатора nos

Стадия	Тип амплификатора
	Crocodile II	Gene Amp 2400	Progene	Trio	Терцик МС-2
Денатурация	3 мин/95 °С	3 мин/94 °С	3 мин/95 °С	2 мин/98 °С	3 мин/94 °С
Амплификация	20 с/95 °С	20 с/94 °С	36 с/95 °С	30 с/95 °С	20 с/94 °С
	40 с/54 °С	40 с/54 °С	72 с/54 °С	40 с/54 °С	40 с/54 °С
	40 с/72 °С	60 с/72 °С	84 с/72 °С	40 с/72 °С	60 с/72 °С
Количество циклов	40	40	40	40	40
Конечное удлинение	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С
Фаза остывания	1 мин/30 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С
Скорость нагрева	1 °С/с	0,77 °С/с	1,5 °С/с	1 °С/с	0,77 °С/с
Скорость остывания	1 °С/с	3,15 °С/с	1,5 °С/с	1 °С/с	3,15 °С/с

7.4 По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 мм³ смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.

7.5 В отдельный карман геля вносят 8 мм³ маркера молекулярной массы ДНК по 4.40, [19].

7.6 Гель помещают в камеру прибора по 4.2, [2] для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1∙ТБЕ.

Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.

7.7 Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].

7.8 Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях А и Б.

8 Обработка результатов анализа

8.1 В пробе со стандартом ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-5), содержащего промотор 35S] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п. н.). В пробе со стандартом без ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0)] и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п. н.).

8.2 В пробе со стандартом ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-5), содержащего терминатор nos] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п. н. В пробе со стандартом без ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения состава (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0)] и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п. н.

8.3 Интерпретация результатов

8.3.1 Отсутствие в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п. н. и 180 п. н. свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.

8.3.2 Обнаружение в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п. н. и 180 п. н., или одного из них, свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.

8.3.3 В случае обнаружения в одной из параллельно анализируемых проб и отсутствия в другой из параллельно анализируемых проб ПЦР-продуктов необходимо повторить весь анализ с еще одной навеской анализируемого продукта.

8.3.4 Обнаружение в отрицательных контролях ПЦР-продуктов размером 195 п. н. и 180 п. н. свидетельствует о получении ложноположительного результата. Это возможно при загрязнении ГМИ оборудования и/или реактивов. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и дозаторов раствором соляной кислоты (1 моль/дм³), заменить реактивы на свежеприготовленные, повторить амплификацию.

8.3.5 Отсутствие в положительном контроле ПЦР-продуктов размером 195 п. н. и 180 п. н. свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Это возможно в случае потери активности одного из компонентов реакционной смеси для ПЦР. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить амплификацию.

9 Контроль результатов идентификации

Для контроля результатов идентификации используют положительный контроль - раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-5), и два отрицательных контроля - холостой опыт и раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0).

10 Требования безопасности

10.1 При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007. При работе с раствором бромистого этидия и окрашенным гелем необходимо работать в резиновых перчатках

10.2 Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточновытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

10.3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. При работе с УФ-излучением необходимо пользоваться защитным экраном и защитными очками.

Приложение А
(обязательное)
Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных
источников: рекомбинантная ДНК (промотор 35S)

1, 2 - анализируемые пробы; 3 - маркер молекулярной массы 100 п. н.;
 4- стандартный образец состава генетически модифицированного источника
пищи растительного происхождения; 5 - стандартный образец состава
генетически не модифицированного источника пищи растительного
происхождения; 6 - холостой опыт

Приложение Б
(обязательное)
Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных
источников: рекомбинантная ДНК (терминатор nos)

1 - маркер молекулярной массы 100 п. н.; 2, 3 - анализируемые пробы;
4 - стандартный образец состава генетически модифицированного источника
пищи растительного происхождения; 5 - стандартный образец состава генетически не
модифицированного источника пищи растительного происхождения; 6 - холостой опыт

Приложение В
(справочное)
Библиография

[1]	ТУ 9642-001-4648062-98	Амплификатор «Терцик МС-2»
[2]	«Био-Рад Лаборатория», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 170-4406	Камера для электрофореза «Mini-Sub Cell GT System»
[3]	«Био-Рад Лаборатория», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 900-7980	Источник напряжения «Power Рас 300»
[4]	«Био-Рад Лаборатория», «Bio-Rad Laboratories» (США), кат. № 170-86-16	Видеосистема «Gel Doc 2000™ Gel Documentation System»
[5]	ТУ 9452-007-18240041-00	Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф «ТЭТА», 12000 мин-1
[6]	ТУ 9452-001-18240041-99	Термостат «TERMO 24-15»
[7]	ТУ 46-22-603-75	Баня водяная с электрическим или огневым подогревом
[8]	ТУ 113-04-146-84	Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)
[9]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Н 5882	Гексадецилтриметиламмониум бромид [C19H42NBr]
[10]	ТУ 6-09-402-85	Спирт изопропиловый [СН3СНОН СН3]
[11]	ОСТ 11.029.003-80	Вода деионизированная
[12]	ТУ 6-09-4292-76	Трис (оксиметил)аминометан [NH2C(CH2OH)3]
[13]	ТУ 6-09-08-1024-81	2-меркаптоэтанол [C2H6OS]
[14]	ТУ 6-09-13-452-75	Этидий бромистый [C21H20N3Br]
[15]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № В 4287	Альбумин бычий сывороточный сухой
[16]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 1806	Фермент Taq-полимераза
[17]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Р 2192	Буфер для ПЦР с MgCl2
[18]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № А 6877	Агароза для электрофореза
[19]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Р 1473	ПЦР маркер 100 п. н.
[20]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Ника»), кат. № 53198	Стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-0)
[21]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Ника»), кат. № 44386	Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM № 410R SB-5)
[22]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 4788	2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ)
[23]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 4913	2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ)
[24]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Д 5038	2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ)
[25]	Корпорация «Сигма Алдрич» («Sigma»), кат. № Т 9656	2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ)
[26]	ЗАО «Синтол» Россия (http://www.syntol.ru)	Праймеры на промотор 35S: 35S-1 5'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС А 3'; 35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3'
[27]	ЗАО «Синтол» Россия (http://www.syntol.ru)	Праймеры на терминатор NOS: nos-1 5'GAA ТСС TGT TGC CGG TCT TG 3'; nos-2 5' TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'