4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения
лабораторной диагностики чумы
для лабораторий территориального,
регионального и федерального уровней

Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2940-11

Методические указания
МУК 4.2.3398-16

Москва 2017

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.Ю. Попова, В.Ю. Смоленский, Е.Б. Ежлова, Ю.В. Демина, Н.Д. Пакскина), Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (В.В. Кутырев, С.А. Щербакова, И.Н. Шарова, Н.А. Осина, Е.С. Казакова, Г.А. Ерошенко).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 сентября 2016 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения
лабораторной диагностики чумы для лабораторий
территориального, регионального
и федерального уровней

Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2940-11

Внести следующие изменения и дополнения в МУК 4.2.2940-11:

1. В пункте 5 абзац десятый изложить в следующей редакции: «Для исследования от людей при подозрении на чуму отбирают:

- при всех формах чумы - мокроту, при её отсутствии - мазок из зева (слизистое отделяемое ротовой полости и глотки), кровь из вены, мочу.

Дополнительно забирают:

- при бубонной форме - содержимое бубона, отечную жидкость при наличии выраженного отека вокруг бубона, отделяемое вскрывшегося бубона и пунктат из его плотной периферической части;

- при целлюлярнокожной форме чумы - отделяемое язв, плотный инфильтрат, окружающий язву, содержимое фурункулов, везикул, пустул, геморрагических карбункулов;

- при наличии расстройств желудочно-кишечного тракта - фекалии;

- при менингиальных явлениях - спинномозговую жидкость;

При легочной форме чумы забирают и мокроту, и мазок со слизистой зева.».

2. В пункте 5 абзац двенадцатый изложить в следующей редакции: «У лиц, контактировавших с больным чумой и находившихся в одинаковых по риску заражения условиях, а также при подозрении на возможность воздушно-капельного или воздушно-пылевого пути заражения, исследуют мокроту, при ее отсутствии мазок из зева (слизистое отделяемое ротовой полости и глотки), кровь.».

3. В пункте 5 раздел «Правила отбора и транспортирования проб клинического материала» абзац третий и четвертый изложить в следующей редакции: «Мокроту собирают в специальные широкогорлые контейнеры с завинчивающейся крышкой. При затрудненном отхождении мокроты, больного просят откашляться, слизистое отделяемое верхних отделов бронхов вместе со слюной собирают в контейнер.

У больных с любой формой чумы забирают для исследования мазок из зева (слизистое отделяемое ротовой полости и глотки).».

4. В пункте 5 раздел «Правила отбора и транспортирования проб клинического материала» абзац седьмой исключить.

5. В п. 6.1.4 раздел «Исследование материала от больного чумой» изложить в следующей редакции:

«Объекты исследования клинического материала представлены в п. 5.

I этап (начало исследований):

- микроскопия мазков (приготовление, окраска фиксированных мазков анилиновыми красителями, иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими);

- выявление антигена FI иммунологическими методами: реакция объемной агломерации, реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации антител, иммуноферментный анализ, дот-иммуноферментный анализ, ИХ-тест и др. (моча, спинномозговая жидкость, пунктат бубона). С целью дифференциальной диагностики и в случае получения сомнительных результатов рекомендуется проведение исследования материала с диагностикумами на другие инфекции (туляремия и др.);

- выявление специфических антител в сыворотке крови больного - если больной с подозрением на чуму выявлен не в первые сутки от начала заболевания, а в более поздние сроки;

- выявление ДНК Y. pestis методом ПЦР;

- посев на жидкие и плотные питательные среды со стимуляторами роста чумного микроба (кровь, моча, спинномозговая жидкость, пунктат бубона);

- посев на плотные питательные среды со стимулятором роста чумного микроба и ингибиторами посторонней флоры (мокрота, мазок из зева, субстрат из вскрывшегося бубона, отделяемое язвы, моча, фекалии);

- проба с диагностическими бактериофагами (при посеве нативного материала на плотную питательную среду);

- определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом (при посеве крови, мочи, спинномозговой жидкости, пунктатов бубона, плотных частей карбункулов, везикул, пустул на плотную питательную среду);

- заражение лабораторных животных (морские свинки, белые мыши) внутрибрюшинно и подкожно (кровь, пунктат бубона, спинномозговая жидкость), подкожно и накожно (мокрота, мазок из зева, отделяемое вскрывшегося бубона, язвы, моча, фекалии).

II этап (2 - 6 ч от начала исследования):

- учет результатов ИХ, ПЦР, МФА, ИФА, РНГА и РАО;

- выдача предварительного положительного ответа на основании следующих результатов: наличия в мазках, окрашенных по Граму, биополярно окрашенных грамотрицателышх палочек; наличия специфического свечения в мазках, окрашенных иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими; выявления ДНК Y. pestis в ПЦР; выявления специфических антигенов чумного микроба в иммунологических реакциях.

III этап (18 - 48 ч от начала исследования):

- учет результатов пробы с чумными бактериофагами и чувствительности к антибактериальным препаратам в первичных посевах исследуемого материала;

- просмотр первичных посевов исследуемого материала на плотных питательных средах и в бульоне;

- бактериоскопия мазков, приготовленных из подозрительных колоний, выросших на плотных питательных средах, из бульона и окрашенных по Граму и иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими;

- отсев колоний чумного микроба на питательный агар для выделения и накопления чистой культуры и на питательный агар с добавлением дефибринированной крови (3 - 5 %) для определения продукции FI после инкубации при температуре 37 °С;

- постановка ИХ-тестов для экспресс-идентификации чумного микроба и ПЦР с материалом из подозрительных колоний (при достаточном количестве материала);

- подтверждение предварительного положительного ответа на основании следующих результатов: характерный рост на жидких и плотных питательных средах; наличие в мазках из колоний, выросших на средах, грамотрицательных палочек с биполярным окрашиванием; наличие специфического свечения при окраске мазка иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими; положительной пробы с бактериофагами (наличие лизиса чумными бактериофагами Л-413 С, Покровской и псевдотуберкулезным на первичных посевах исследуемого материала); положительного результата ИХ-теста для экспресс-идентификации чумного микроба и ПЦР с материалом из подозрительных колоний;

- предварительный результат чувствительности к антибактериальным препаратам (при посеве нативного материала) выдают после идентификации культуры, выросшей на среде с дисками антибиотиков, методами МФА, ИХА как культуры чумного микроба.

IV этап (48 - 72 ч от начала исследования) идентификация выделенной культуры на основании следующих признаков:

- специфичный характер роста на питательном агаре и в бульоне;

- характерные морфология и отношение к красителям микробных клеток в мазках, окрашенных по Грамму, и наличие специфического свечения клеток в мазке, окрашенном иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими;

- выявление специфических антигенов чумного микроба в ИХА;

- чувствительность выделенной культуры чумного микроба к диагностическим бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному;

- отсутствие подвижности в 0,4 %-м агаре при температуре 20 - 22 °С;

- наличие ферментативной активности по отношению к мочевине, глюкозе, рамнозе, лактозе, арабинозе, сахарозе, мальтозе, манниту, глицерину;

- способность выделенной культуры чумного микроба синтезировать видоспецифический капсульный антиген (FI) при температуре 37 °С;

- выявление ДНК Y. pestis методом ПЦР;

- чувствительность выделенной культуры чумного микроба к антибиотикам.

На IV этапе проводят вскрытие павших биопробных животных, посев органов и крови на плотные и в жидкие питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановку ПЦР с суспензиями органов.

V этап (3 - 5-е сутки от начала исследования):

- учет результатов идентификации культур;

- просмотр посевов материала от павших биопробных животных;

- вскрытие павших или выживших биопробных животных, посев органов и крови на плотные и в жидкие питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановка ПЦР с суспензиями органов;

- выдача окончательного положительного ответа на основании результатов идентификации выделенной культуры чумного микроба по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, чувствительности к чумным диагностическим бактериофагам, наличию специфических маркеров в ПЦР и специфических антигенов в иммунологических реакциях, наличию специфичного роста культуры от павших и умерщвленных биопробных животных.

При отсутствии культуры возбудителя на чашках и в бульоне с первичными посевами окончательный положительный ответ выдают на основании характерных свойств культуры, выделенной от биопробного животного.

В случае невозможности выделения культуры возбудителя на фоне применения антибактериальной терапии до забора материала на исследование, но при наличии у больного характерных для чумы клинических проявлений и эпидемиологического анамнеза, диагноз может быть поставлен на основании положительных результатов ПЦР.

VI этап (на 5 - 8-е сутки от начала исследования):

- вскрытие выживших биопробных животных, исследование суспензий их органов бактериоскопическим, бактериологическим и молекулярно-генетическими методами;

- выдача отрицательного ответа на основании следующих результатов: отсутствие специфического роста культуры в первичных посевах исследуемого материала и материала от биопробных животных на жидких и плотных питательных средах; отсутствие патологоанатомических изменений у последних; отрицательные результаты ПЦР; отрицательные результаты иммунологических реакций при исследовании нативного материала и органов павших или выживших биопробных животных;

- отсутствие в парных сыворотках больного увеличения титра специфических антител к чумному микробу.

Исследование материала от лиц, контактировавших с больным чумой и находившихся в одинаковых по риску заражения условиях, а также при подозрении на возможность воздушно-капельного или воздушно-пылевого пути заражения

Исследуемый материал - мазок из зева (слизистое отделяемое ротовой полости и глотки), кровь (для определения сероконверсии).

I этап (начало исследования):

- приготовление мазков, окраска по Граму, иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими;

- постановка полимеразной цепной реакции;

- посев на плотные селективные среды;

- постановка иммунологических реакций;

- заражение лабораторных животных подкожно.

II этап (2 - 6 ч от начала исследования):

- учет результатов МФА, ПЦР, ИФА, РНГА и РАО;

- выдача предварительного положительного ответа на основании обнаружения специфического свечения клеток при просмотре мазков, окрашенных иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими, положительных результатов ПЦР.

III этап (18 - 48 ч от начала исследования):

- учет первичных посевов исследуемого материала на плотных питательных средах;

- бактериоскопия мазков из подозрительных колоний (окраска по Граму и флуоресцирующими иммуноглобулинами);

- отсев подозрительных колоний на питательный агар для выделения и накопления чистой культуры и агар с содержанием дефибринированной крови (3 - 5 %) для определения продукции FI после инкубации при температуре 37 °С;

- при достаточном количестве колоний постановка ПЦР, ИХ-теста для экспресс-идентификации чумного микроба, пробы на чувствительность с диагностическими бактериофагами, определение чувствительности к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом;

- подтверждение предварительного положительного ответа на основании следующих признаков: наличие характерных по морфологии колоний в посевах на плотной среде; наличие в мазках из этих колоний грамотрицательных палочек с биполярным окрашиванием; специфическое свечение при окраске мазка иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими; выявление ДНК чумного микроба в ПЦР и специфических антигенов чумного микроба в ИХА.

IV этап (3 - 4-е сутки от начала исследования):

- проведение идентификации выделенной культуры;

- вскрытие павших биопробных животных, посев органов и крови на плотные и в жидкие питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановка ПЦР с суспензиями органов.

V этап (5 - 8-е сутки от начала исследования):

- просмотр посевов материала от павших биопробных животных;

- вскрытие выживших биопробных животных, исследование суспензий их органов бактериоскопическим, бактериологическим и молекулярно-генетическими методами;

- выдача окончательного положительного ответа на основании результатов идентификации выделенной культуры чумного микроба по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, чувствительности к чумным диагностическим бактериофагам, наличию специфических маркеров в ПЦР и специфических антигенов в иммунологических реакциях, наличию специфичного роста культур от павших и умерщвленных биопробных животных.

При отсутствии культуры возбудителя на чашках и в бульоне с первичными посевами окончательный положительный ответ выдают на основании характерных свойств культуры, выделенной от биопробного животного;

- выдача отрицательного ответа на основании следующих признаков: отсутствие специфически светящихся клеток в мазках, окрашенных иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими; отрицательные результаты ПЦР; отсутствие роста характерных для чумного микроба колоний на плотной среде и типичного роста в бульоне; отсутствие характерных для чумы изменений в органах биопробных животных и отсутствие специфического роста на плотной среде из посевов отпечатков их органов и специфических маркеров в иммунологических реакциях и ПЦР.

Исследование материала от трупа человека, погибшего от чумы

Исследования ведут по схеме, аналогичной схеме исследования материала от больного чумой.».

6. В пункте 6.5.1 абзац третий изложить в следующей редакции: «Штаммы возбудителя чумы, выделенные от людей и из объектов окружающей среды, идентифицированные в лабораториях Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, направляют в курирующий противочумный институт (Центр индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней) и по согласованию в Референс-центр по мониторингу за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями.».

В пункте 6.2.4 абзац третий изложить в следующей редакции: «Штаммы возбудителя чумы, выделенные от людей, из объектов окружающей среды и идентифицированные в лабораториях Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, направляют по согласованию в Референс-центр по мониторингу за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями (Национальный центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, осуществляющий функцию Государственной коллекции возбудителей особо опасных бактериальных инфекций I - II групп патогенности).».