4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения
лабораторной диагностики чумы
для лабораторий территориального,
регионального и федерального уровней

Методические указания
МУК 4.2.2940-11

Москва 2011

1. Разработаны Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (В.В. Кутырев, И.Н. Шарова, Н.А. Осина, Е.С. Казакова, Г.А. Ерошенко, Е.А. Плотникова, С.А. Пионтковский); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (А.Н. Куличенко, Т.В. Таран, О.В. Малецкая, А.В. Таран, А.П. Бейер); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (С.В. Балахонов, М.Ю. Шестопалов, Т.И. Иннокентьева, B.Т. Климов, Г.А. Воронова, С.А. Белькова, М.В. Афанасьев, В.Д. Брикман, C.А. Косилко, О.Д. Захлебная); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, С.А. Лебедева, В.И. Прометной, Л.М. Веркина, С.Ю. Водяницкая, А.Л. Трухачев, А.В. Тришина, Т.А. Арсеньева); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (В.В. Алексеев, А.В. Липницкий, В.А. Антонов, Д.В. Викторов); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Противочумный центр» Роспотребнадзора (В.Е. Безсмертный, С.М. Иванова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (А.И. Верещагин, В.В. Мордвинова); Федеральным бюджетным учреждением науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (И.А. Дятлов, А.П. Анисимов, М.В. Храмов, М.Е. Платонов, С.В. Дентовская, С.Ф. Бикетов, Н.И. Лунева); Федеральным государственным бюджетным учреждением «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России (И.В. Борисевич, Л.В. Саяпина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 2.06.2011 № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 июля 2011 г. и введены в действие с 14 июля 2011 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Порядок организации и проведения
лабораторной диагностики чумы для лабораторий
территориального, регионального и
федерального уровней

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики чумы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней, формы и методы их взаимодействия, номенклатуру и объем исследования, требования к лабораториям, специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований, материально-техническому обеспечению исследований, к биологической безопасности проведения работ.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор в Российской Федерации, специалистов противочумных учреждений, органов управления здравоохранением и лечебно-профилактических учреждений.

2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон от 3.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 29.10.2007 № 720 «О внесении изменений в пункт 5 «Положения о лицензировании деятельности, связанной с использованием возбудителей инфекционных заболеваний», утвержденного постановлением Правительства Российской Федерации от 22.01.2007 № 31».

2.3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.02.2009 № 11 «О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 10.04.2009 № 13745).

2.4. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 7.07.2009 № 415н «Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения» (Зарегистрирован в Минюсте Российской Федерации 9.07.2009 № 14292).

2.5. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.2008 № 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней».

2.6. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 8.03.2008 № 152 «О совершенствовании организации и проведения мероприятий по профилактике чумы».

2.7. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности» (Утв. постановлением Госкомсанэпиднадзора Российской Федерации от 28.08.1995 № 14).

2.8. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)» (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 15.04.2003 № 42 «О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.1285-03». Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 10.05.2003 № 4545).

2.9. СП 1.3.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами» (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 № 85 «О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03». Зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2003 №4558).

2.10. СП 3.4.2318-08 «Санитарная охрана территории Российской Федерации» (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 22.01.2008 №3 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 3.4.2318-08». Зарегистрировано в Минюсте России 3.04.2008 № 11459).

2.11. СП 3.1.7.2492-09 «Профилактика чумы» (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23.03.2009 № 18 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.7.2492-09». Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 7.04.2009 № 13699).

2.12. СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 9.12.2010 № 163. Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 17.02.2011 № 19871).

2.13. СанПиН 2.1.3.2630-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность» (Утв. постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 18.05.2010 № 58. Зарегистрировано в Минюсте Российской Федерации 9.08.2010 № 18094).

2.14. Международные медико-санитарные правила (2005 г.).

2.15. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (утв. главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.73 № 1045-73).

2.16. МУ 3.4.2126-06 «Организация и проведение мероприятий по профилактике чумы в пунктах пропуска через государственную границу Российской Федерации».

2.17. МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии».

2.18. МУ 3.1.3.2355-08 «Методические указания по организации и проведению эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации».

2.19. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».

2.20. МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевание инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения».

2.21. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности».

2.22. МУК 4.2.2495-09 «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чумы, сибирской язвы, холеры, туляремии, бруцеллеза, сапа и мелиоидоза) к антибактериальным препаратам».

3. Перечень сокращений

АБП - антибактериальные препараты.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ЛПУ - лечебно-профилактическое учреждение.

МУ - методические указания.

МУК - методические указания по контролю.

МФА - метод флуоресцирующих антител.

ООИ - особо опасные инфекции.

ПБА - патогенный биологический агент.

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

ПЧУ - противочумные учреждения.

ПЧС - противочумная станция.

НИПЧИ - научно-исследовательский противочумный институт.

РАО - реакция агломерации объёмная.

РА - реакция агглютинации.

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

РНАг - реакция нейтрализации антигена.

РНАт - реакция нейтрализации антител.

СанПиН - Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы.

СП - Санитарные правила.

ИХ-тест - иммунохроматографический тест.

pCad (pYV) - плазмида, определяющая кальцийзависимость при температуре 37 °С и синтез V-антигена (47 МДа) чумного микроба.

pFra (pYT) - плазмида, детерминирующая синтез фракции I и мышиного токсина (65 МДа).

pPstI (pYP) - плазмида пестициногенности (6 МДа).

pstI - ген пестицина I.

MLVA - мультилокусный анализ областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR).

FI - фракция I чумного микроба (капсульный антиген).

4. Общие положения

Характеристика болезни и возбудителя чумы

Чума - природно-очаговая особо опасная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя. Характеризуется интоксикацией, лихорадкой, поражением лимфатической системы, сепсисом и летальностью, уровень которой колеблется в значительных пределах от высокого (около 50 %) до низкого, в зависимости от клинической формы, срока заболевания и качества лечения.

Источники инфекции - больные животные и больной человек. Естественная инфицированность возбудителем чумы выявлена почти у 250 видов животных, среди которых имеются представители 8 отрядов класса Млекопитающих. Основными носителями возбудителя чумы в природных очагах в Евразии являются сурки, суслики, песчанки, полевки, пищухи, крысы. Переносчики возбудителя - эктопаразиты животных и человека (блохи, иксодовые и гамазовые клещи).

Чрезвычайную опасность для людей представляют больные чумой, дикие промысловые животные, а также вторично зараженные объекты окружающей среды, продукты и сырье животного происхождения (шкуры, кожа, шерсть).

Пути передачи возбудителя инфекции:

• трансмиссивный (при укусе блохами, клещами, заразившимися на больных грызунах, верблюде или человеке);

• контактно-бытовой (через кровь, выделения больного человека, зараженных животных);

• воздушно-капельный и воздушно-пылевой (при контакте с больными первичной или вторичной легочной формами чумы, при разборке почвы нор больных чумой грызунов, сырья животного происхождения, при авариях с разбрызгиванием материала, заражённого возбудителем чумы);

• пищевой (при употреблении в пищу инфицированного мяса и воды).

Патогенез и клиника болезни зависят от пути передачи инфекции, дозы возбудителя, его вирулентности и резистентности макроорганизма.

В соответствии с Международной статистической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем (Десятый пересмотр. Женева, 2003, МКБ-10), различают следующие формы болезни:

• А20.0 - бубонная чума (наиболее частая);

• А20.1 - целлюлярнокожная чума;

• А20.2 - легочная чума;

• А20.3 - чумной менингит;

• А20.7 - септическая чума;

• А20.8 - другие формы чумы, куда относятся: фарингеальная, кишечная;

• А20.9 - чума неуточненная.

Возбудитель чумы Yersinia pestis (семейство Enterobacteriaceae род Yersinia) - неподвижная мелкая (1 - 3×0,5 - 0,7 мкм) прямая или овоидная, грамотрицательная палочка, отличающаяся полиморфизмом (наряду с обычными палочками и короткими коккобациллами встречаются и более длинные клетки). Чумной микроб хорошо окрашивается всеми анилиновыми красителями. В мазках материала от больного, из органов грызунов и бульонных культур хорошо выявляется биполярное окрашивание клеток. В организме животных и людей, при культивировании на кровяном и сывороточном агаре при температуре 37 °С возбудитель чумы образует капсулу.

Факультативный анаэроб, хорошо растет на простых питательных средах, а также на синтетических средах с добавлением разных аминокислот. Для роста из небольших посевных доз на плотных питательных средах микроорганизм нуждается в добавлении стимуляторов роста, в частности сульфита натрия или гемолизированной крови. Оптимальные условия выращивания: температура 28 °С и pH от 7,0 до 7,2.

При выращивании чумного микроба в бульоне наблюдается порошковидный или рыхлый хлопьевидный осадок, легко распадающийся при встряхивании, сам бульон - прозрачен, что имеет диагностическое значение. Иногда образуется нежная пленка, которая в дальнейшем огрубевает, в «старых» культурах на нижней поверхности пленки могут появляться «свисающие» нити.

На пластинках питательного агара Y. pestis растет в виде прозрачного, сероватого, нежного влажного налета. Через 12 ч появляется начальный рост чумного микроба в виде «битого стекла», а через 18 - 24 ч - мелкие плоские полупрозрачные колонии с фестончатыми краями - «кружевные платочки», морфология которых имеет диагностическое значение. Через 24 - 48 ч «кружевные платочки» превращаются в типичные серовато-белые колонии с выпуклым более темным мелкозернистым или бугристым центром и плоским волнистым краем, напоминающим кружево (характерный для возбудителя чумы R-тип колоний). По мере старения колоний (48 - 72 ч) центр становится более грубым, непрозрачным, приобретает серовато-коричневатый оттенок. При выращивании при температуре 28 - 30 °С колонии относительно сухие, хорошо снимаются петлей; при температуре 37 °С - вязкие и труднее снимаются с поверхности агара. При выращивании на питательной среде с гемолизированной кровью «кружевная» зона может быть слабо выражена.

Вид Y. pestis представлен основным и неосновными подвидами, имеющими отличия по некоторым свойствам, которые используются при идентификации выделенных штаммов чумного микроба.

Штаммы неосновных подвидов характеризуются сниженной эпидемической активностью, среди них встречаются не вирулентные для людей.

Подавляющее большинство штаммов чумного микроба при выращивании на ЦДС (питательной среде для идентификации чумного и псевдотуберкулезного микробов по признаку ферментации мочевины и углеводов) при температуре 28 °С в течение 24 ч изменяют цвет столбика среды в красно-оранжевый (ферментация глюкозы), а скошенной части - в сине-зеленый (отсутствие ферментации мочевины). Вместе с тем существуют редкие штаммы возбудителя чумы, которые ферментируют мочевину и дают полное окрашивание питательной среды ЦДС в оранжевый цвет. Эти штаммы необходимо дифференцировать от возбудителя псевдотуберкулёза.

На пластинке желатина формируются сероватые плоские колонии с зернистым краем; в столбике желатина - рост на поверхности и в глубине по уколу, среда не разжижается.

На 3 %-м кровяном агаре Хоттингера чумной микроб вырастает в виде зернистых колоний с маленькой «кружевной» зоной или без нее.

Возбудитель чумы оксидазоотрицателен, каталазоположителен, ферментирует и окисляет до кислоты без газа D-глюкозу, не разжижает желатин, не расщепляет мочевину, как правило, не продуцирует индол, сероводород, не образует ацетилметилкарбинол. Синтезирует лецитиназу, РНК-азу, гемолизин, протеазу - активатор плазминогена, как правило, за исключением редких штаммов разных подвидов и всех штаммов неосновного подвида caucasica. Ферментирует мальтозу, маннит, галактозу, маннозу, левулезу, эскулин, декстрин. Не ферментирует лактозу, сахарозу, сорбит, целлобиозу, инозит, дульцит, сорбит. Отношение к рамнозе, арабинозе, мелибиозе, ксилозе, салицину вариабельное и в значительной степени связано с принадлежностью к неосновным подвидам. Возбудитель чумы дает положительную реакцию с метиловым красным, вариабелен по признаку ферментации глицерина.

Возбудитель чумы имеет ряд факторов вирулентности, которые важны для его переживания в грызунах и блохах. Большинство генов, кодирующих данные факторы вирулентности, локализованы на 3 плазмидах: pPst (pYP) (9,5 - 12 т. п. н.), pCad (pYV) (~70 - 75 т. п. н.) и pFra (pYT) (~100 - 130 т. п. н.). Плазмида pCad - плазмида вирулентности иерсиний является родоспецифической и содержит в своем составе вирулон Yop, кодирующий ключевые детерминанты патогенности трёх видов иерсиний. Две другие плазмиды pPst и pFra видоспецифичны. Низкомолекулярная плазмида pPst кодирует температуро-зависимый активатор плазминогена (Рlа), проявляющий фибринолитическую (при температуре 37 °С) и плазмокоагулазную (при температуре 28 °С) активности, и специфический бактериоцин (пестицин). Она отсутствует у всех штаммов неосновного подвида caucasica. Высокомолекулярная плазмида pFra содержит гены для синтеза протеинового капсульного антигена FI (cafI) и мышиного токсина (уmt). При обследовании очагов могут быть выделены штаммы возбудителя чумы, лишенные указанных плазмид.

На хромосоме чумного микроба расположена область пигментации (Pgm область), которая включает hms локус, кодирующий белки аккумуляции гемина (от англ. hemin storage) и остров высокой патогенности HPI (от англ. high pathogenicity island) с генами системы утилизации железа. Потеря острова патогенности HPI приводит к утрате штаммами Y. pestis вирулентности для лабораторных животных и человека, a Hms локуса - к снижению способности чумного микроба формировать блок преджелудка у блох и передаваться трансмиссивным путем.

Чумной микроб обладает комплексом антигенов, многие из которых относятся к факторам вирулентности. Из них протективной активностью обладают антигены FI и V (LcrV).

Чумной микроб достаточно устойчив к воздействию факторов окружающей среды. В гное бубона он сохраняется 20 - 30 суток, в трупах людей, верблюдов, грызунов - до 60 суток. Наиболее длительно возбудитель сохраняется в костном мозге. Микроб обладает психрофильностью - при понижении температуры увеличиваются сроки выживания бактерий. Хорошо переносит низкие температуры, замораживание (в замороженных трупах и блохах сохраняет жизнеспособность до года). Малоустойчив к высушиванию, нагреванию, действию ультрафиолетового облучения.

5. Действия специалистов лабораторий территориального
уровня (лечебно-профилактические учреждения,
ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте и
их филиалы) при подозрении на выявление больного чумой
в ходе эпидемиологического надзора

В лабораториях ЛПУ диагностические исследования материала от больных с подозрением на чуму не проводят.

В экстренных случаях при осуществлении эпидемиологического надзора и проведении противоэпидемических мероприятий по чуме допускается проведение лабораторных исследований клинического, секционного материала и проб объектов окружающей среды на чуму специалистами противочумного учреждения на базе лабораторий ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии», имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами II группы патогенности. Лаборатория ФБУЗ ЦГиЭ осуществляет прием и хранение проб, а также подготовку лаборатории к исследованиям на чуму: освобождение, дезинфекция, подготовка блока для работы с инфицированными животными, бактериологического бокса, другие организационные мероприятия по согласованию с противочумным учреждением.

В ЛПУ, куда согласно оперативному плану проведения противоэпидемических мероприятий в случае выявления больного с подозрением на чуму госпитализирован больной, осуществляют отбор проб клинического материала. Для лабораторного исследования отбирают пробы материала от:

• больных (умерших) людей с симптомами болезни, сходными с клиническими проявлениями всех форм чумы, особенно если в их анамнезе имеются данные о посещении природного очага чумы или проживании на его территории;

• лиц, контактировавших с больными легочной чумой;

• лиц, участвовавших (без защитной одежды) во вскрытии трупов людей и верблюдов, погибших от чумы;

• лиц, участвовавших в убое и разделке туши больного чумой верблюда, обработке мяса в процессе приготовления пищи, употреблявших в пищу мясо больных чумой животных.

Материал от больных забирают сразу при поступлении в лечебное учреждение до начала специфического лечения, а также спустя 3 суток после окончания лечения антибактериальными препаратами с интервалами между очередными исследованиями 24 ч до получения трех отрицательных результатов.

Материал от лиц, контактировавших с больными чумой или контаминированными возбудителем чумы объектами, исследуют при поступлении в стационар и по окончании профилактического лечения перед выпиской.

В случае невозможности получения материала в первые 2 ч после возникновения подозрения на чуму, лечение начинают по клиническим показаниям до забора материала.

Забор материала от больных и лиц, подозрительных на заражение или заболевание чумой, его упаковку проводят в защитной одежде медицинские работники стационара, куда госпитализирован больной, в присутствии и под руководством специалистов отделов особо опасных инфекционных болезней ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации или противочумных учреждений. В случае невозможности быстрого прибытия указанных специалистов, забор материала от больного осуществляют два медицинских работника, один из которых врач, подготовленный по вопросам диагностики особо опасных инфекций и обученный правилам биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности.

Секционный материал отбирают медицинские работники патологоанатомических отделений (или БСМЭ) в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям.

Взятый материал должен быть немедленно направлен на исследование в лабораторию Регионального центра по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности или Центра индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней или сохранен с соблюдением требований действующих санитарных правил по безопасности работы до прибытия специалиста. Материал сохраняют в холодильнике в контейнере в опечатанном виде.

Для исследования от людей при подозрении на чуму отбирают:

- при всех формах чумы - мокроту, при её отсутствии - мазок из зева (слизистое отделяемое ротовой полости и глотки), кровь из вены, мочу.

Дополнительно забирают:

- при бубонной форме - содержимое бубона, отечную жидкость при наличии выраженного отека вокруг бубона, отделяемое вскрывшегося бубона и пунктат из его плотной периферической части;

- при целлюлярнокожной форме чумы - отделяемое язв, плотный инфильтрат, окружающий язву, содержимое фурункулов, везикул, пустул, геморрагических карбункулов;

- при наличии расстройств желудочно-кишечного тракта - фекалии;

- при менингиальных явлениях - спинномозговую жидкость;

При легочной форме чумы забирают и мокроту, и мазок со слизистой зева.

В помещениях, где находятся больные легочной формой чумы, контрольному исследованию подлежат смывы с различных поверхностей и пробы воздуха.

У лиц, контактировавших с больным чумой и находившихся в одинаковых по риску заражения условиях, а также при подозрении на возможность воздушно-капельного или воздушно-пылевого пути заражения, исследуют мокроту, при ее отсутствии мазок из зева (слизистое отделяемое ротовой полости и глотки), кровь.

При вскрытии трупов людей, погибших от чумы или от болезней, подозрительных на чуму, для исследования отбирают:

• кусочки бубона и материал кожных поражений (пустул, везикул, карбункула, язвы, отека);

• образцы паховых, бедренных, подколенных, подмышечных, шейных, подчелюстных, околоушных, бифуркационных у корня легких, мезентериальных, особенно при отсутствии бубона, лимфатических узлов;

• кусочки печени, селезенки, легкого; при наличии некрозов берут некротизированную и прилегающую к ней ткань; при изменениях, характерных для пневмонии, тщательно исследуют кусочки легких из пораженных мест и регионарные лимфатические узлы (шейные, подчелюстные, бифуркационные в области корня легких);

• кровь из сердца или крупных сосудов;

• костный мозг с образцом трубчатой и губчатой костей;

• спинномозговую жидкость, мочу, экссудат плевральной полости, мокроту и др. (по клиническим показаниям).

В случае наличия признаков загнивания трупа отбирают образцы спинного и головного мозга.

(Измененная редакция. Изм. № 1)

Правила отбора и транспортирования проб клинического материала

Пунктат из бубона (везикул, пустул, карбункулов) берут шприцем емкостью не менее 5 мл. Кожу на участке, намеченном для прокола, обрабатывают 70 %-м спиртом, а затем смазывают 5 %-м раствором йода и вновь протирают 70 %-м спиртом. Иглу вводят с таким расчетом, чтобы ее острие достигло центральной части бубона, после чего, оттянув до отказа поршень, медленно вынимают иглу. Из-за расположения экссудата в чумном бубоне между плотными тканями количество его, попадающее в шприц, как правило, незначительно и часто заполняет только просвет иглы. После извлечения иглы из бубона через нее набирают в шприц 0,5 мл стерильного питательного бульона pH 7,2, содержимое переносят в стерильную пробирку с завинчивающейся пробкой. Бульон можно набрать в шприц и до начала пункции. В качестве метода, повышающего возможность выделения культуры чумного микроба, и в случае невозможности получить материал, в бубон вводят 0,3 - 0,5 мл стерильного 0,9 %-го раствора натрия хлорида или питательного бульона. При вскрывшемся бубоне забирают отдельно материал из периферической плотной части и отделяемое свища. Обе пробы исследуют раздельно.

Перед взятием отделяемого язвы, везикулы, пустулы, карбункула или отторгнутого струпа прединъекционной дезинфицирующей салфеткой осторожно очищают кожу вокруг пораженного места, при необходимости стерильной марлевой салфеткой удаляют некротические массы, гной. Прокатывая тампон по раневой поверхности от центра к периферии в течение 5 - 10 с абсорбируют материал на тампон. Тампон с материалом помещают в стерильную пробирку или в транспортную среду. При использовании шприца иглу вводят у края везикулы (пустулы) и затем продвигают к середине. У карбункулов и язв пунктируют плотный край.

Мокроту собирают в специальные широкогорлые контейнеры с завинчивающейся крышкой. При затрудненном отхождении мокроты, больного просят откашляться, слизистое отделяемое верхних отделов бронхов вместе со слюной собирают в контейнер.

У больных с любой формой чумы забирают для исследования мазок из зева (слизистое отделяемое ротовой полости и глотки).

Забор крови для исследований проводят с соблюдением правил асептики и мер индивидуальной защиты. Кровь забирают из локтевой вены в количестве 10 - 20 мл одноразовым шприцем, 5 мл засевают в 50 мл бульона. Оставшуюся часть крови распределяют в пробирки: для посевов на плотные питательные среды и постановки биологической пробы; для ПЦР-анализа (в пробирку с антикоагулянтом - 4 %-й раствор натрия цитрата в отношении 1:10 к объему крови или 6 %-й раствор ЭДТА в отношении 1:20 к объему крови); для получения сыворотки для иммуносерологических реакций.

У больных чумой с локализацией первичных бубонов в области головы и шеи дополнительно забирают на исследование слизистое отделяемое ротовой полости и глотки стерильным тампоном.

На доставляемые в лабораторию пробы заполняют направление (прилож. 1), в котором указывают: наименование и адрес учреждения, куда направляется проба (пробы); фамилию, имя, отчество, пол, возраст, больного (умершего); адрес места жительства; дату заболевания, дату обращения за медицинской помощью, дату госпитализации; предварительный диагноз; особенности эпидемиологического анамнеза; проводилась ли больному до взятия материала антибактериальная терапия (когда, какие использовались препараты, в какой дозе); вид материала, взятого для бактериологического исследования; цель исследования; дату и час забора материала; адрес, по которому следует сообщить результаты бактериологического исследования; наименование учреждения, должность, фамилию и инициалы лица, направляющего пробу (пробы); время доставки пробы; должность, фамилию и инициалы доставившего и принявшего пробы.

Направление заполняется в 2 экземплярах. Одно (или копия) - вкладывается в кейс (контейнер), второе передается с нарочным.

Материал транспортируют в лабораторию в сумке-холодильнике или контейнере с хладагентами. Если нет условий для хранения материала на холоде, время от момента взятия материала до начала исследования не должно превышать 5 - 6 ч.

Отходы медицинских учреждений обеззараживают в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами.

(Измененная редакция. Изм. № 1)

6. Порядок организации и проведения лабораторной
диагностики чумы для лабораторий регионального уровня

6.1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики
чумы для лабораторий Региональных центров по мониторингу
за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности
(противочумные учреждения, их подразделения -
противочумные отделения и сезонные формирования -
противоэпидемические отряды)

6.1.1. Требования к лабораториям Региональных центров
по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней
I - II групп патогенности

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов

Учреждения, на базе которых функционируют лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, выполняющие исследования на чуму, должны иметь лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей I - II групп патогенности (опасности).

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, выполняющие исследования на чуму, должны иметь санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими санитарными правилами о порядке выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных болезней человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами.

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности должны быть аккредитованы на техническую компетентность в установленном порядке в соответствии с действующей законодательной базой Российской Федерации.

Учет, хранение, передача и транспортирование выделенных штаммов возбудителя чумы должны осуществляться в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

Отходы бактериологических лабораторий обеззараживают в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами.

Утилизация отходов должна осуществляться в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами.

Организация исследований на всех этапах: отбор проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, алгоритм исследования, выдача результатов, взаимодействие с учреждениями Роспотребнадзора должны соответствовать требованиям действующих нормативных документов по профилактике и лабораторной диагностике чумы.

Требования к специалистам и персоналу,
участвующим в выполнении исследований на чуму

Исследования на чуму могут выполнять специалисты не моложе 18 лет, с высшим и средним медицинским, биологическим образованием, окончившие курсы подготовки по специальности «Бактериология» с основами безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I - II групп (первичной специализации по ООИ), имеющие допуск к работе с ПБА I - II групп на основании приказа руководителя учреждения. Специалисты, проводящие исследования на чуму, должны иметь необходимые профессиональные навыки (прилож. 2).

Специалисты, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных болезней, должны повышать квалификацию не реже одного раза в пять лет, и иметь сертификат специалиста.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала

Каждая лаборатория, выполняющая исследования на чуму, должна иметь пакет документов, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Документы должны быть согласованы с комиссией по контролю соблюдения требований биологической безопасности, специалистами по охране труда, противопожарным мероприятиям и утверждены руководителем учреждения. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным на зараженность или зараженным возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности (опасности), в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего контроля качества
лабораторных исследований

Контроль качества диагностических исследований на чуму в лабораториях Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности включает:

• проведение контроля качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, дисков с антибактериальными препаратами, дезинфицирующих средств, химических реактивов, дистиллированной воды;

• контроль эффективности мембранных фильтров;

• проведение своевременной поверки средств измерений, аттестации испытательного оборудования;

• контроль качества стерильности фильтровальных установок, лабораторной посуды;

• контроль качества стерилизации паровых и суховоздушных стерилизаторов;

• контроль температурного режима холодильников;

• контроль температурного режима термостатов;

• контроль работы бактерицидных ламп;

• проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;

• проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, контроль качества дезинфекции, контроль смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах.

Правила ведения документации

Ведение лабораторной документации, включая регистрационные и рабочие журналы, осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями действующих методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым
для выполнения диагностических исследований на чуму

Для проведения диагностических исследований на чуму в бактериологических лабораториях должны быть в наличии:

• питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 3);

• диагностические препараты, тест-системы, антибактериальные препараты, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 4, 5);

• химические реактивы (прилож. 6);

• приборы, оборудование (прилож. 7);

• расходные материалы (прилож. 8).

Питательные среды подлежат обязательному контролю согласно действующим МУ по контролю диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителя чумы с учётом особенностей известных его питательных потребностей.

6.1.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории противоэпидемических отрядов (сезонных формирований ПЧС) проводят:

• исследования проб, отобранных в ходе эпизоотологического обследования территории природного очага чумы;

• исследование материала от больных и умерших с подозрением на чуму;

• идентификацию выделенных штаммов возбудителя чумы.

Диагностические исследования материала осуществляют в следующем объеме:

а) посев на среды накопления и дифференциально-диагностические среды с целью выделения культуры возбудителя чумы;

б) заражение биопробных животных с целью выделения культуры возбудителя чумы;

в) выявление антигенов возбудителя чумы и антител к нему в системе иммуносерологических реакций;

г) идентификация выделенных штаммов по сокращенной схеме.

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности (ПЧС и ПЧО, ПЧЦ, НИПЧИ) проводят:

• исследования материала от больных и умерших с подозрением на чуму и лиц, контактировавших с ними;

• исследования объектов, через которые возможен занос возбудителей чумы, включая санитарно-опасные грузы, пищевые продукты, трупы мелких млекопитающих и их эктопаразиты, добытые на зараженном транспортном средстве или других объектах;

• исследования проб, отобранных в ходе эпизоотологического обследования территории природного очага чумы;

• идентификацию выделенных штаммов возбудителя чумы;

• проверку качества питательных сред и ингибиторов сопутствующей микрофлоры (за исключением противочумных отделений).

Диагностические исследования материала осуществляют в следующем объеме:

а) индикация возбудителя в нативном материале методами экспресс- и ускоренной диагностики (ПЦР, МФА, ИФА, РНГА и др.);

б) посев на среды накопления и дифференциально-диагностические с целью выделения чистой культуры возбудителя чумы;

в) постановка биологической пробы;

г) выявление антител к возбудителю чумы (ИХ-тесты, ИФА, РНГА и др.);

д) идентификация выделенных штаммов (в противочумных отделениях проводят по сокращенной схеме).

6.1.3. Порядок диагностических исследований на чуму в лабораториях
противоэпидемических отрядов Региональных центров по мониторингу
за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности

При проведении эпизоотологического обследования природных очагов чумы лабораторному исследованию подлежат грызуны, зайцеобразные, насекомоядные и наземные хищники, блохи грызунов и жилища человека, клещи; трупы мелких млекопитающих, остатки пищи из гнезд хищных птиц, материал от больных и павших верблюдов, эктопаразиты, снятые с диких и домашних животных. В отдельных случаях, предусмотренных соответствующими инструктивно-методическими документами и/или планами работы, исследуют материал от сайгаков, погадки хищных птиц, экскременты грызунов и хищников, пробы почвы.

Сбор, упаковку материала для исследования, доставку его в лабораторию осуществляют в соответствии с действующими методическими указаниями по организации и проведению эпидемиологического надзора в природных очагах чумы.

Схема исследования полевого материала

Лабораторное исследование полевого материала начинают сразу же после его поступления. Допускается кратковременное хранение материала (не более 20 ч) при температуре 4 - 6 °С (холодильник, ледник и др.).

От грызунов, отловленных живыми, после умерщвления на исследование берут кусочки паренхиматозных органов (печени, селезенки).

При обнаружении характерных для чумы патолого-анатомических изменений у животных кроме печени и селезенки обязательно исследуют:

• легкие;

• лимфатические узлы (паховые, аксилярные, глоточные, паратрахеальные, забрюшинные);

• кровь.

От трупов грызунов исследуют:

• кусочки паренхиматозных органов (печени, селезенки, легких);

• патологически измененные лимфатические узлы, участки органов и тканей;

• кровь из сердца;

• костный мозг (у крупных грызунов - из бедренной кости или грудины в месте соединения с хрящом ребра, у мелких - из бедренной кости) или головной мозг.

От туши прирезанного больного верблюда или трупа верблюда, павшего в результате заболевания, на исследование отбирают:

• кусочки паренхиматозных органов (печени, селезенки, легких, надпочечников и др.);

• кусочки лимфатических узлов (подчелюстных, шейных, брыжеечных и забрюшинных, предлопаточных, паховых, аксилярных);

• кровь из сердца;

• отечную жидкость из подкожной клетчатки;

• участки патологически измененных тканей и органов;

• костный мозг из трубчатой кости.

Объектами исследования также являются:

• блохи, счесанные с грызунов и собранные из гнездовой камеры, из ходов и устьев нор, в жилище человека и надворных постройках. По эпидпоказаниям блох счесывают с кошек и собак;

• клещи, счесанные с грызунов, собранные из нор и вокруг них, с поверхности земли, снятые с верблюдов и других сельскохозяйственных животных;

• вши, счесанные с грызунов.

Исследование материала проводят бактериоскопическим, бактериологическим и иммуносерологическими методами.

Для выявления чумного микроба используют высокопитательные среды (коммерческие или лабораторного изготовления) и диагностические препараты, зарегистрированные в установленном порядке. В качестве стимуляторов роста чумного микроба в питательную среду добавляют сульфит натрия в концентрации 1:4000 (1 мл 2,5 %-го раствора на 100 мл агара), гемолизированную кровь в концентрации 0,01 - 1,00 % согласно инструкции по применению препарата. В очагах, где циркулируют тиаминзависимые штаммы (подвид caucasica), в качестве стимулятора роста используют витамин В₁ в концентрации 0,0001 мг на 100 мл среды или питательную среду 199 (3 мл на 100 мл среды).

Для подавления роста посторонней микрофлоры используют генцианвиолет в концентрации 1:100000 - 1:800000. Рабочую дозу определяют для каждой серии препарата перед обследовательским сезоном и указывают в паспорте на рабочий раствор генцианвиолета.

Кроме того, для ингибирования посторонней микрофлоры могут быть использованы теллурит калия в концентрации 1:300000, дезоксихолат натрия - 1 мг %, фосфомицин - 50 - 100 мкг/мл.

До обнаружения эпизоотии на обследуемой территории у отловленных мелких млекопитающих после умерщвления бактериологическим методом исследуют печень и селезенку; Готовят суспензии органов зверьков одного вида, добытых в одной точке обследования. Для одной суспензии объединяют органы не более чем от 10 мелких зверьков или 5 сравнительно крупных (сурки, хори, суслики и т.д.).

При выделении первой культуры проводят индивидуальный посев органов (печень, селезенка) животных отпечатками их срезов на агаровые пластинки. На одну чашку агара допускается посев материала от 3 животных, при определении границ эпизоотии (когда дополнительно исследованию подлежит кровь из сердца) - от 2 животных. Оптимальным является дублирование посевов: отпечатками органов и посев из их суспензии.

Материал высевают на плотную питательную среду со стимулятором роста чумного микроба.

Суспензию после обеззараживания используют для обнаружения FI иммуносерологическими методами.

Грызунов с явно выраженными патолого-анатомическими изменениями, характерными для чумы, и трупы животных, найденных в полевых условиях, исследуют индивидуально. Из всех органов делают мазки-отпечатки и окрашивают их по Граму. Посев органов на питательные среды осуществляют как отпечатками, так и приготовленной суспензией. При исследовании трупов животных костный мозг засевают на отдельную чашку. Для посевов используют селективные питательные среды с ингибиторами роста посторонней флоры.

Суспензией органов заражают индивидуальную биопробу. После обеззараживания суспензию органов используют для обнаружения FI иммуносерологическими методами. Сгустки крови из сердца и крупных сосудов после инактивации исследуют на наличие специфических антител к чумному микробу.

При исследовании материала от верблюда суспензию каждого органа высевают на отдельную чашку Петри с селективной средой (в качестве ингибитора предпочтительнее использовать фосфомицин - 100 мкг/мл).

Блох, собранных с каждого грызуна или из одной норы, исследуют отдельно групповым способом, не более 20 - 30 экземпляров на одну пробу (пул). При обилии блох разрешается доводить количество их в одном посеве до 50 экземпляров. Допускается объединять в одну пробу блох с носителей одного вида с одного участка или из близлежащих гнезд. Эктопаразитов, собранных с трупов животных или животных с патолого-анатомическими изменениями, характерными для чумы, а также с целью определения процента зараженности блох исследуют индивидуально.

При исследовании иксодовых клещей в один посев берут не более трех пивших кровь самок, голодных - до 30 экземпляров, пивших нимф - до 15 экземпляров, голодных - до 50 экземпляров, пивших личинок -до 30 экземпляров, вшей - до 50 экземпляров.

Для посева суспензии эктопаразитов используют селективные питательные среды с ингибиторами роста посторонней флоры.

Объекты с посевами инкубируют при температуре 28 °С. Учет роста культур осуществляют через 24 - 48 ч (далее ежедневно в течение 5 суток от момента посева).

При выявлении типичных молодых колоний проводят отсев колоний на агаровые пластинки и скошенный агар для подтверждения чистоты культуры, её накопления и идентификации.

Первичную идентификацию выделенной культуры проводят сразу после выделения по следующим признакам:

• морфология роста на питательном агаре и в бульоне;

• бактериоскопия (морфология клетки, характер окраски по Граму);

• экспресс-идентификация чумного микроба с материалом из подозрительных колоний с использованием ИХ-теста;

• чувствительность к диагностическим бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному;

• подвижность в 0,4 %-м агаре при температуре 20 - 22 °С;

• характерный рост на питательной среде для дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов по признакам ферментации углеводов и мочевины ЦДС (отсутствие способности к ферментации мочевины и лактозы);

• ферментация рамнозы, арабинозы, глицерина.

Все штаммы возбудителя чумы, выделенные в лабораториях противоэпидемических отрядов, передают на соответствующие противочумные станции - в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности.

Исследование клинического (секционного) материала осуществляют в соответствии с пунктом 6.1.4 в объеме, регламентированном для противоэпидемических отрядов (пункт 6.1.2). Передачу материала и выделенной культуры в стационарную лабораторию Регионального центра по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности согласовывают с ПЧС.

6.1.4. Порядок диагностических исследований на чуму
в лабораториях Региональных центров по мониторингу
за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности

Схема исследования полевого материала

Исследование полевого материала при проведении эпизоотологического обследования природных очагов чумы и транспортных объектов осуществляют в соответствии с п. 6.1.3.

Дополнительно проводят:

• индикацию возбудителя в нативном материале методом ПЦР;

• постановку биологической пробы.

Идентификацию выделенных штаммов осуществляют по следующим тестам:

• морфология роста на питательном агаре и в бульоне;

• бактериоскопия (морфология клетки, характер окраски по Граму и иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими);

• экспресс-идентификация чумного микроба с материалом из подозрительных колоний с использованием ИХ-теста;

• чувствительность к диагностическим бактериофагам Л-413 С, Покровской, псевдотуберкулезному;

• подвижность в 0,4 %-м агаре при температуре 20 - 22 °С;

• ферментативная активность по отношению к мочевине, глюкозе, рамнозе, лактозе, арабинозе, сахарозе, мальтозе, манниту, глицерину;

• способность чумного микроба синтезировать видоспецифический капсульный антиген (FI);

• выявление ДНК Y. pestis методом ПЦР;

• чувствительность к антибиотикам диско-диффузионным методом.

Схема исследования клинического материала

Забор материала от человека осуществляют в соответствии с п. 5.

При исследовании материала от подозрительного на заражение чумой больного или трупа человека исследование каждой пробы (образца) следует проводить индивидуально - индивидуальная биологическая проба каждого образца, индивидуальный посев на питательные среды (на отдельную агаровую пластинку).

Исследование материала от больного чумой

Объекты исследования клинического материала представлены в п. 5.

I этап (начало исследований):

- микроскопия мазков (приготовление, окраска фиксированных мазков анилиновыми красителями, иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими);

- выявление антигена FI иммунологическими методами: реакция объемной агломерации, реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации антител, иммуноферментный анализ, дот-иммуноферментный анализ, ИХ-тест и др. (моча, спинномозговая жидкость, пунктат бубона). С целью дифференциальной диагностики и в случае получения сомнительных результатов рекомендуется проведение исследования материала с диагностикумами на другие инфекции (туляремия и др.);

- выявление специфических антител в сыворотке крови больного - если больной с подозрением на чуму выявлен не в первые сутки от начала заболевания, а в более поздние сроки;

- выявление ДНК Y. pestis методом ПЦР;

- посев на жидкие и плотные питательные среды со стимуляторами роста чумного микроба (кровь, моча, спинномозговая жидкость, пунктат бубона);

- посев на плотные питательные среды со стимулятором роста чумного микроба и ингибиторами посторонней флоры (мокрота, мазок из зева, субстрат из вскрывшегося бубона, отделяемое язвы, моча, фекалии);

- проба с диагностическими бактериофагами (при посеве нативного материала на плотную питательную среду);

- определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом (при посеве крови, мочи, спинномозговой жидкости, пунктатов бубона, плотных частей карбункулов, везикул, пустул на плотную питательную среду);

- заражение лабораторных животных (морские свинки, белые мыши) внутрибрюшинно и подкожно (кровь, пунктат бубона, спинномозговая жидкость), подкожно и накожно (мокрота, мазок из зева, отделяемое вскрывшегося бубона, язвы, моча, фекалии).

II этап (2 - 6 ч от начала исследования):

- учет результатов ИХ, ПЦР, МФА, ИФА, РНГА и РАО;

- выдача предварительного положительного ответа на основании следующих результатов: наличия в мазках, окрашенных по Граму, биополярно окрашенных грамотрицателышх палочек; наличия специфического свечения в мазках, окрашенных иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими; выявления ДНК Y. pestis в ПЦР; выявления специфических антигенов чумного микроба в иммунологических реакциях.

III этап (18 - 48 ч от начала исследования):

- учет результатов пробы с чумными бактериофагами и чувствительности к антибактериальным препаратам в первичных посевах исследуемого материала;

- просмотр первичных посевов исследуемого материала на плотных питательных средах и в бульоне;

- бактериоскопия мазков, приготовленных из подозрительных колоний, выросших на плотных питательных средах, из бульона и окрашенных по Граму и иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими;

- отсев колоний чумного микроба на питательный агар для выделения и накопления чистой культуры и на питательный агар с добавлением дефибринированной крови (3 - 5 %) для определения продукции FI после инкубации при температуре 37 °С;

- постановка ИХ-тестов для экспресс-идентификации чумного микроба и ПЦР с материалом из подозрительных колоний (при достаточном количестве материала);

- подтверждение предварительного положительного ответа на основании следующих результатов: характерный рост на жидких и плотных питательных средах; наличие в мазках из колоний, выросших на средах, грамотрицательных палочек с биполярным окрашиванием; наличие специфического свечения при окраске мазка иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими; положительной пробы с бактериофагами (наличие лизиса чумными бактериофагами Л-413 С, Покровской и псевдотуберкулезным на первичных посевах исследуемого материала); положительного результата ИХ-теста для экспресс-идентификации чумного микроба и ПЦР с материалом из подозрительных колоний;

- предварительный результат чувствительности к антибактериальным препаратам (при посеве нативного материала) выдают после идентификации культуры, выросшей на среде с дисками антибиотиков, методами МФА, ИХА как культуры чумного микроба.

IV этап (48 - 72 ч от начала исследования) идентификация выделенной культуры на основании следующих признаков:

- специфичный характер роста на питательном агаре и в бульоне;

- характерные морфология и отношение к красителям микробных клеток в мазках, окрашенных по Грамму, и наличие специфического свечения клеток в мазке, окрашенном иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими;

- выявление специфических антигенов чумного микроба в ИХА;

- чувствительность выделенной культуры чумного микроба к диагностическим бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному;

- отсутствие подвижности в 0,4 %-м агаре при температуре 20 - 22 °С;

- наличие ферментативной активности по отношению к мочевине, глюкозе, рамнозе, лактозе, арабинозе, сахарозе, мальтозе, манниту, глицерину;

- способность выделенной культуры чумного микроба синтезировать видоспецифический капсульный антиген (FI) при температуре 37 °С;

- выявление ДНК Y. pestis методом ПЦР;

- чувствительность выделенной культуры чумного микроба к антибиотикам.

На IV этапе проводят вскрытие павших биопробных животных, посев органов и крови на плотные и в жидкие питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановку ПЦР с суспензиями органов.

V этап (3 - 5-е сутки от начала исследования):

- учет результатов идентификации культур;

- просмотр посевов материала от павших биопробных животных;

- вскрытие павших или выживших биопробных животных, посев органов и крови на плотные и в жидкие питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановка ПЦР с суспензиями органов;

- выдача окончательного положительного ответа на основании результатов идентификации выделенной культуры чумного микроба по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, чувствительности к чумным диагностическим бактериофагам, наличию специфических маркеров в ПЦР и специфических антигенов в иммунологических реакциях, наличию специфичного роста культуры от павших и умерщвленных биопробных животных.

При отсутствии культуры возбудителя на чашках и в бульоне с первичными посевами окончательный положительный ответ выдают на основании характерных свойств культуры, выделенной от биопробного животного.

В случае невозможности выделения культуры возбудителя на фоне применения антибактериальной терапии до забора материала на исследование, но при наличии у больного характерных для чумы клинических проявлений и эпидемиологического анамнеза, диагноз может быть поставлен на основании положительных результатов ПЦР.

VI этап (на 5 - 8-е сутки от начала исследования):

- вскрытие выживших биопробных животных, исследование суспензий их органов бактериоскопическим, бактериологическим и молекулярно-генетическими методами;

- выдача отрицательного ответа на основании следующих результатов: отсутствие специфического роста культуры в первичных посевах исследуемого материала и материала от биопробных животных на жидких и плотных питательных средах; отсутствие патологоанатомических изменений у последних; отрицательные результаты ПЦР; отрицательные результаты иммунологических реакций при исследовании нативного материала и органов павших или выживших биопробных животных;

- отсутствие в парных сыворотках больного увеличения титра специфических антител к чумному микробу.

Исследование материала от лиц, контактировавших с больным чумой и находившихся в одинаковых по риску заражения условиях, а также при подозрении на возможность воздушно-капельного или воздушно-пылевого пути заражения

Исследуемый материал - мазок из зева (слизистое отделяемое ротовой полости и глотки), кровь (для определения сероконверсии).

I этап (начало исследования):

- приготовление мазков, окраска по Граму, иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими;

- постановка полимеразной цепной реакции;

- посев на плотные селективные среды;

- постановка иммунологических реакций;

- заражение лабораторных животных подкожно.

II этап (2 - 6 ч от начала исследования):

- учет результатов МФА, ПЦР, ИФА, РНГА и РАО;

- выдача предварительного положительного ответа на основании обнаружения специфического свечения клеток при просмотре мазков, окрашенных иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими, положительных результатов ПЦР.

III этап (18 - 48 ч от начала исследования):

- учет первичных посевов исследуемого материала на плотных питательных средах;

- бактериоскопия мазков из подозрительных колоний (окраска по Граму и флуоресцирующими иммуноглобулинами);

- отсев подозрительных колоний на питательный агар для выделения и накопления чистой культуры и агар с содержанием дефибринированной крови (3 - 5 %) для определения продукции FI после инкубации при температуре 37 °С;

- при достаточном количестве колоний постановка ПЦР, ИХ-теста для экспресс-идентификации чумного микроба, пробы на чувствительность с диагностическими бактериофагами, определение чувствительности к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом;

- подтверждение предварительного положительного ответа на основании следующих признаков: наличие характерных по морфологии колоний в посевах на плотной среде; наличие в мазках из этих колоний грамотрицательных палочек с биполярным окрашиванием; специфическое свечение при окраске мазка иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими; выявление ДНК чумного микроба в ПЦР и специфических антигенов чумного микроба в ИХА.

IV этап (3 - 4-е сутки от начала исследования):

- проведение идентификации выделенной культуры;

- вскрытие павших биопробных животных, посев органов и крови на плотные и в жидкие питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановка ПЦР с суспензиями органов.

V этап (5 - 8-е сутки от начала исследования):

- просмотр посевов материала от павших биопробных животных;

- вскрытие выживших биопробных животных, исследование суспензий их органов бактериоскопическим, бактериологическим и молекулярно-генетическими методами;

- выдача окончательного положительного ответа на основании результатов идентификации выделенной культуры чумного микроба по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, чувствительности к чумным диагностическим бактериофагам, наличию специфических маркеров в ПЦР и специфических антигенов в иммунологических реакциях, наличию специфичного роста культур от павших и умерщвленных биопробных животных.

При отсутствии культуры возбудителя на чашках и в бульоне с первичными посевами окончательный положительный ответ выдают на основании характерных свойств культуры, выделенной от биопробного животного;

- выдача отрицательного ответа на основании следующих признаков: отсутствие специфически светящихся клеток в мазках, окрашенных иммуноглобулинами чумными флуоресцирующими; отрицательные результаты ПЦР; отсутствие роста характерных для чумного микроба колоний на плотной среде и типичного роста в бульоне; отсутствие характерных для чумы изменений в органах биопробных животных и отсутствие специфического роста на плотной среде из посевов отпечатков их органов и специфических маркеров в иммунологических реакциях и ПЦР.

Исследование материала от трупа человека, погибшего от чумы

Исследования ведут по схеме, аналогичной схеме исследования материала от больного чумой.

(Измененная редакция. Изм. № 1)

6.1.5. Порядок взаимодействия лабораторий Региональных центров
по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп
патогенности с учреждениями Роспотребнадзора

Информация о выделенных подозрительных или идентифицированных штаммах возбудителя чумы передается в соответствии с действующей нормативной документацией.

По системе ПЧУ информация направляется в курирующий НИПЧИ, Центр индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней (НИПЧИ), Референс-центр по мониторингу за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями (Центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора) и Противочумный центр.

Штаммы возбудителя чумы, выделенные от людей и из объектов окружающей среды, идентифицированные в лабораториях Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, направляют в курирующий противочумный институт (Центр индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней) и по согласованию в Референс-центр по мониторингу за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. Прилагаются паспорт на штамм в одном экземпляре, сопроводительное письмо, акт упаковки и акт передачи.

(Измененная редакция. Изм. № 1)

6.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики
чумы для лабораторий Центров индикации и диагностики
возбудителей опасных инфекционных болезней
(противочумные учреждения)

6.2.1. Требования к лабораториям Центров индикации и
диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов, требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на чуму, требования к обеспечению безопасности работы персонала, порядок организации внутреннего контроля лабораторных исследований, правила ведения документации и требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения диагностических исследований на чуму, аналогичны п. 6.1.1.

6.2.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней проводят:

• исследования материала от больных и умерших с подозрением на чуму, контактировавших лиц;

• исследования проб из объектов окружающей среды;

• идентификацию штаммов возбудителя чумы по полной схеме;

• окончательную оценку вирулентности и эпидемической значимости штаммов;

• определение чувствительности к антибактериальным препаратам;

• проверку качества питательных сред и ингибиторов сопутствующей микрофлоры.

6.2.3. Порядок диагностических исследований на чуму
в лабораториях Центров индикации и диагностики
возбудителей опасных инфекционных болезней

Исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды и идентификацию штаммов возбудителя чумы, выделенных специалистами лаборатории Центра индикации, а также поступивших из лабораторий Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, осуществляют в соответствии с п. 6.1.4.

В схему идентификации дополнительно включают следующие тесты:

• определение ферментативной активности по отношению к различным моно-, ди-, трисахаридам, спиртам;

• определение вирулентности на модели лабораторных животных;

• изучение структурных особенностей генома выделенных штаммов методом ПЦР;

• определение способности к нитрификации и денитрификации;

• определение пестицин-фибринолизин-плазмокоагулазной активности;

• определение чувствительности к пестицину 1;

• способность к пигментсорбции;

• зависимость роста от ионов кальция при температуре 37 °С;

• изучение питательных потребностей выделенной культуры чумного микроба.

6.2.4. Порядок взаимодействия лабораторий Центров индикации
и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней
с учреждениями Роспотребнадзора

Информация о выделенных и/или идентифицированных штаммах возбудителя чумы передается в соответствии с действующей нормативной документацией.

По системе ПЧУ информация направляется в Референс-центр по мониторингу за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями (Национальный центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, осуществляющий функцию Государственной коллекции возбудителей особо опасных бактериальных инфекций I - II групп патогенности), курирующий НИПЧИ и Противочумный центр.

Штаммы возбудителя чумы, выделенные от людей, из объектов окружающей среды и идентифицированные в лабораториях Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, направляют по согласованию в Референс-центр по мониторингу за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями (Национальный центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, осуществляющий функцию Государственной коллекции возбудителей особо опасных бактериальных инфекций I - II групп патогенности).

Заключение о результатах идентификации присланного на исследование штамма направляют в учреждение, из которого штамм получен.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. Прилагаются паспорт на штамм в одном экземпляре, сопроводительное письмо, акт упаковки и акт передачи.

(Измененная редакция. Изм. № 1)

7. Порядок организации и проведения лабораторной
диагностики чумы для лабораторий федерального уровня

7.1. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики
чумы для Референс-центра по мониторингу за чумой и другими особо
опасными бактериальными инфекциями

7.1.1. Требования к лабораториям Референс-центра по мониторингу
за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов, требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на чуму, требования к обеспечению безопасности работы персонала, порядок организации внутреннего контроля лабораторных исследований, правила ведения документации аналогичны п. 6.1.1.

7.1.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории Референс-центра по мониторингу за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями проводят:

• полную идентификацию и изучение молекулярно-генетических и биохимических свойств штаммов возбудителя чумы, в том числе штаммов с атипичными свойствами и вновь выделенных штаммов, явившихся причиной эпидемической вспышки;

• определение чувствительности штаммов возбудителя чумы к антибактериальным препаратам;

• генетическое типирование и секвенирование ДНК штаммов возбудителя чумы;

• исследование клинического (секционного), биологического материала, проб объектов окружающей среды - по эпидемическим показаниям с учетом сложившейся эпизоотолого-эпидемиологической обстановки.

7.1.3. Организация и обеспечение диагностической деятельности при
мониторинге за чумой

Материалом для исследования служат штаммы возбудителя чумы, в том числе штаммы с атипичными свойствами, выделенные в лабораториях территориального и регионального уровней; вновь выделенные штаммы, явившиеся причиной вспышки; материал от больных чумой и других контингентов, по эпидемическим показаниям - объекты окружающей среды.

При исследовании штаммов возбудителя чумы, материала от людей и проб объектов окружающей среды используют весь комплекс методов, включая современные высокотехнологичные методы бактериологического, иммуносерологического и молекулярно-генетического анализов с использованием как зарегистрированных, так и экспериментально-лабораторных серий диагностических препаратов.

Порядок исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды на чуму соответствует п. 6.1.4.

Идентификацию поступивших штаммов возбудителя чумы осуществляют по полной схеме. Для характеристики штаммов по генам, ассоциированным с вирулентностью, жизнеобеспечением, эпидемичностью, происхождением поводят расширенную идентификацию на основе секвенирования, рестрикционного анализа, ген-амплификации, двухмерного электрофореза, VNTR-типирования.

При идентификации штаммов возбудителя чумы с атипичными свойствами используют дополнительно серологические, иммунологические, биохимические и другие методы для подтверждения принадлежности культур к виду Y. pestis:

• ПЦР с использованием дополнительных специфических праймеров и зондов;

• постановка иммуносерологических реакций с использованием моноклональных антител.

7.1.4. Порядок взаимодействия лабораторий Референс-центра
по мониторингу за чумой и другими бактериальными инфекциями
с учреждениями Роспотребнадзора

Информация о выделенных и/или идентифицированных штаммах возбудителя чумы передается в соответствии с действующей нормативной документацией и направляется в Национальный центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, осуществляющий функцию государственной коллекции возбудителей особо опасных бактериальных инфекций I - II групп патогенности.

Штаммы возбудителя чумы, идентифицированные в лабораториях Референс-центра по мониторингу за чумой и другими бактериальными инфекциями, передают в Национальный центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора, осуществляющий функцию государственной коллекции возбудителей особо опасных бактериальных инфекций I - II групп патогенности.

Заключение о результатах идентификации присланного на исследование штамма направляют в учреждение, из которого штамм получен.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. Прилагаются паспорт на штамм в одном экземпляре, сопроводительное письмо, акт упаковки и акт передачи.

7.2. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики
чумы для Национального центра верификации диагностической
деятельности возбудителей особо опасных бактериальных
инфекций I - II групп патогенности Роспотребнадзора

7.2.1. Требования к лабораториям Национального центра верификации
диагностической деятельности

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов, требования к специалистам и персоналу, участвующим в выполнении исследований на чуму, требования к обеспечению безопасности работы персонала, порядок организации внутреннего контроля лабораторных исследований, правила ведения документации аналогичны п. 6.1.1.

7.2.2. Номенклатура и объем исследований

Лаборатории Национального центра верификации диагностической деятельности осуществляют:

• верификацию результатов диагностики чумы и идентификации штаммов возбудителя чумы, полученных из Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней Роспотребнадзора, Референс-центра по мониторингу за чумой и другими особо опасными бактериальными инфекциями;

• хранение коллекционных штаммов, охраноспособное и авторское депонирование.

7.2.3. Организация и обеспечение диагностической деятельности

Идентификацию штаммов осуществляют по полной схеме, дополнительно проводят:

• определение чувствительности штаммов возбудителя чумы к антибактериальным препаратам, в том числе методом серийных разведений;

• выявление видоспецифичных локусов для идентификации вида Y. pestis и дифференциации от возбудителя псевдотуберкулёза;

• проведение генотипирования штаммов возбудителя чумы;

• составление молекулярного портрета на основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, ПЦР-типирования, мультилокусного секвенирования и мультилокусного VNTR-анализа.

7.2.4. Порядок взаимодействия лабораторий Национального центра
верификации диагностической деятельности
с учреждениями Роспотребнадзора

Национальный Центр верификации диагностической деятельности Роспотребнадзора направляет в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I - II групп патогенности, Центры индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней результаты проведенных исследований.

Приложение 1

Направление
на исследование клинического материала

Приложение 2

Требования к профессиональным знаниям и навыкам
специалистов, осуществляющих лабораторную диагностику чумы

1. Врачи-бактериологи и биологи должны знать:

• основные положения эпидемиологического надзора за чумой;

• нормативные документы, используемые при проведении лабораторных исследований на чуму;

• санитарно-гигиенические нормы и режим работы лаборатории;

• вопросы организации лабораторных исследований на чуму;

• требования биологической безопасности при работе с зараженным и подозрительным на заражение микроорганизмами I - II групп патогенности материалом;

• таксономию и классификацию представителей рода Yersinia семейства Enterobacteriaceae;

• морфологические, культуральные, антигенные, биохимические свойства возбудителя чумы;

• биологический, бактериоскопические, бактериологические, иммуносерологические, молекулярно-генетические методы изучения возбудителя чумы;

• методы определения вирулентности и эпидемической значимости возбудителя;

• методы определения чувствительности к антибиотикам и дезинфектантам;

• этапы лабораторного исследования на чуму, сроки выдачи ответов, правила и сроки передачи выделенных штаммов;

• требования к отбору материала;

• требования к доставке материала, его хранению, регистрации, уничтожению, подготовке к передаче и транспортированию;

• этапы подготовительной работы (подготовку питательных сред для выделения и идентификации возбудителя чумы, диагностических препаратов, реактивов);

• критерии оценки качества питательных сред, используемых для диагностики чумы, ингибиторов посторонней микрофлоры.

2. Врачи-бактериологи и биологи должны уметь:

• осуществлять полное исследование по схеме лабораторной диагностики чумы материала от больных и умерших с подозрением на чуму, проб из объектов окружающей среды;

• проводить учет результатов исследования с отметкой в журналах;

• пользоваться приборами, используемыми для проведения анализов на чуму;

• идентифицировать выделенные штаммы возбудителя чумы по сокращенной и полной схеме;

• определять вирулентность культур;

• определять чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам;

• устанавливать таксономическую принадлежность возбудителя чумы;

• осуществлять контроль качества питательных сред и ингибиторов посторонней микрофлоры;

• вести необходимую документацию в соответствии с санитарными правилами.

3. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны знать:

• морфологические, культуральные и основные биохимические свойства возбудителя чумы;

• этапы лабораторного исследования;

• методы полной и сокращенной идентификации штаммов возбудителя чумы;

• правила работы с материалом, зараженным или подозрительным на заражение возбудителем чумы;

• правила по охране труда и пожарной безопасности;

• этапы подготовительной работы (подготовку посуды, красок, питательных сред для выделения и идентификации возбудителя чумы, диагностических препаратов, реактивов);

• методы определения качества питательных сред и ингибиторов посторонней микрофлоры.

4. Лаборанты, медицинские лабораторные техники и медицинские технологи должны уметь:

• приготовить или подготовить к работе питательные среды для выделения и идентификации возбудителя чумы;

• принимать и регистрировать материал, поступивший на исследование;

• приготовить основные ингредиенты для окраски мазков по Граму;

• приготовить реактивы для постановки идентификационных тестов;

• подготовить разведения сывороток для постановки иммуносерологических тестов;

• осуществить вскрытие животных и подготовку проб;

• произвести первичные посевы и пересевы поступившего материала;

• сделать мазки, зафиксировать их, окрасить по Граму и люминесцентной сывороткой;

• провести определение качества питательных сред, ингибиторов посторонней микрофлоры;

• подготовить отработанный материал для автоклавирования или обеззараживания дезсредствами;

• участвовать в проведении идентификации выделенных штаммов по полной и сокращенной схемам, постановке биологической пробы.

Приложение 3

Питательные среды, используемые для лабораторной
диагностики чумы

Приложение 4

Диагностические препараты, тест-системы, используемые для лабораторной
диагностики чумы

Приложение 5

Антибактериальные препараты, используемые для определения
чувствительности чумного микроба к антибиотикам

Приложение 6

Химические реактивы, используемые
при проведении лабораторной диагностики чумы

Приложение 7

Приборы и оборудование, используемые при проведении
лабораторной диагностики чумы

Приложение 8

Расходные материалы, используемые при проведении
лабораторной диагностики чумы