4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения бактерий
Enterobacter sakazakii в продуктах
для питания детей раннего возраста

Дополнения и изменения к МУК 4.2.2428-08

Методические указания
МУК 4.2.3144-13

Москва 2014

1. Разработаны Федеральным государственным бюджетным учреждением «Научно-исследовательский институт питания» Российской Академии медицинских наук (В.А. Тутельян, С.А. Шевелева, И.Я. Конь, Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Быкова, С.Ю. Батищева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 октября 2013 г. № 3).

3. Утверждены врио Руководителя Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii
в продуктах для питания детей раннего возраста

Дополнения и изменения к МУК 4.2.2428-08

1. По тексту документа изменить название Enterobacter sakazakii и записать в следующей редакции «Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii)» или «Cronobacter spp.».

2. Раздел 1 «Общие положения и область применения» дополнить п. 1.7 и изложить его в следующей редакции: «1.7. Методические указания носят рекомендательный характер».

3. Раздел 2 «Сущность метода» изложить в следующей редакции:

«2. Сущность метода

2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие неселективные среды для предварительного обогащения проб, пересеве в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры.

Ниже представлена методическая схема определения Cronobacter spp.

Таблица 1

Схема исследования сухих детских смесей на наличие Cronobacter spp.

2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к Е. sakazakii (Cronobacter spp.). Подтверждение принадлежности к Cronobacter spp. производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20Е, Rapid 20E, ID 32Е (ф. «БиоМерье», Франция) и др.

Определение биохимических характеристик, подтверждающих принадлежность выделенных штаммов к роду Cronobacter spp. и дифференцирующих их от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Биохимическая дифференциация Cronobacter spp.

Ведущими дифференцирующими признаками Cronobacter spp. являются:

• способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при температуре 25 °С;

• наличие α-глюкозидазной активности на хромогенных средах, содержащих 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид;

• отсутствие способности к ферментации D-сорбита.

Для дифференциации Cronobacter spp. от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Envinia spp.) используется тест разжижения желатины.».

4. В разделе 3.3 «Реактивы и питательные среды» перечень питательных сред дополнить следующими наименованиями:

• модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон с ванкомицином (мЛСТ с ванкомицином);

• Enterobacter sakazakii хромогенный агар (ESIA™) или селективные хромогенные среды аналогичного назначения, соответствующие требованиями стандарта ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006.

5. Раздел 4.2 «Приготовление питательных сред» дополнить пп. 4.2.6, 4.2.7 и 4.2.8 в следующей редакции:

«4.2.6. Забуференная пептонная вода

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 ± 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

4.2.7. Модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон (мЛСТ) с ванкомицином

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 6,8 ± 0,2 при 25 °С, разливают по 10 мл в пробирки и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Приготовление рабочего раствора ванкомицина: 10 мг ванкомицина растворяют в 10 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и стерилизуют методом мембранной фильтрации. Готовый раствор ванкомицина может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 15 суток.

Для получения готовой среды раствор ванкомицина вносят в каждую пробирку со стерильной основой мЛСТ в количестве 0,1 см³ для получения конечной концентрации ванкомицина в готовой среде 10 мкг/см³. Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.

4.2.8. Enterobacter sakazakii хромогенный агар (ESIA™)

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 ± 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин. Стерилизованную агаровую среду охлаждают до температуры 44 - 47 °С и разливают по 15 см³ в стерильные чашки Петри.

Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.».

5. Раздел 6. «Проведение анализа» изложить в следующей редакции:

«6. Проведение анализа

6.1. Пробы продуктов массой 100 г, 125 г или 137,5 г вносят в забуференную пептонную воду (ЗПВ) по п. 4.2.6 в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.

6.2. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (см³).

Из подготовленной по п. 5 пробы отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (см³) каждая для анализа. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 см³ ЗПВ и перемешивают.

Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (см³) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (см³) и производят посев в 90 см³ ЗПВ и перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (см³) и производят посев в 9 см³ ЗПВ. Для посева (при необходимости - предполагаемом высоком содержании Cronobacter spp. в продукте) меньших количеств продукта - 0,1 и 0,01 г, делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г, и вносят по 1 см³ (х 3) соответствующих разведений в 9 см³ ЗПВ.

Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (22 ± 2) ч.

6.3. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 0,1 см³ суспензии пересевают в 10 см³ модифицированного лаурилсульфат триптозного бульона с ванкомицином (арбитражная среда) или в 10 см³ одной из жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 29184-91 - среду Кесслер с глюкозой, или буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 ± 2) ч.

6.4. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность хромогенного агара по п. 4.2.8 для выявления Cronobacter spp., содержащего 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид (арбитражная среда), или на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-aгap). Чашки с агаризованной средой предварительно подсушивают. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 ± 2) ч.

6.5. При отсутствии роста на поверхности хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. или VRBG-aгapa анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе.

6.6. После этапа селективного обогащения проб для обнаружения Cronobacter spp. (п. 6.3), допускается использовать ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в соответствии с процедурой, изложенной в МУК 4.2.2872-11. При получении отрицательных результатов исследований образцов предварительно обогащенных жидких селективных сред с применением ПЦР анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе.

6.7. При обнаружении на чашках хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. роста подозрительных культур для дальнейшего изучения отбирают 3-5 характерных колоний. При обнаружении на поверхности VRBG-aгapa роста дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты культур, для чего отбирают по 3 - 5 колоний каждого типа.

6.8. Отобранные для исследования 3 - 5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом и термостатируют при температуре 25 °С в течение (48 ± 2) ч. В качестве положительного контроля используют референс-штамм Е. sakazakii (Cronobacter spp.), типичный по фенотипическим свойствам.

6.9. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Cronobacter spp.».

6. Раздел 10. «Нормативные ссылки» изложить в следующей редакции:

10.1. ГОСТ Р 54005-2010 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae».

10.2. ГОСТ ISO 7218-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям».

10.3. ГОСТ Р 54004-2010 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний».

10.4. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

10.5. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

10.6. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

10.7. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу».

10.8. ГОСТ Р ИСО 707-2010 «Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб».

10.9. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

10.10. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

10.11. Стандарт ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006 «Milk and milk products - Detection of Enterobacter sakazakii».

10.12. МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией».

10.13. Технический Регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».