4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения бактерий
Enterobacter Sakazakii в продуктах
для питания детей раннего возраста

Методические указания
МУК 4.2.2428-08

Москва 2009

1. Разработаны Государственным учреждением «Научно-исследовательский институт питания» Российской Академии медицинских наук (В.А. Тутельян, С.А. Шевелева, И.Я. Конь, Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Быкова, С.Ю. Батищева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 29 октября 2008 г.

4. Введены в действие с 15 декабря 2008 г.

5. Введены впервые

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения бактерий Enterobacter Sakazakii
в продуктах для питания детей раннего возраста

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий Enterobacter sakazakii - возбудителей пищевых токсикоинфекций у детей раннего возраста, при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.

1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику заболеваний с пищевым путем передачи. Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

1.3. Контролю на наличие бактерий Е. sakazakii подлежат детские молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей первого года жизни, при анализе которых на наличие патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл, не были выявлены облигатные патогены, принадлежащие к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но выявлялся рост сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры.

1.4. Необходимость контроля указанных групп продукции на наличие Е. sakazakii обусловлена регистрацией в последние годы документированных спорадических случаев и вспышек септических инфекций и некротизирующего энтероколита у детей 1 года жизни, в первую очередь недоношенных, новорождённых с низкой массой тела или иммунокомпромиссных. Все случаи заболеваний связаны с употреблением детских молочных смесей, контаминированных Е. sakazakii, в т.ч. при очень низких уровнях возбудителя (1 - 10 КОЕ/г). При этом установлено, что в первую очередь Е. sakazakii может попадать в сухие молочные смеси с контаминированными ингредиентами, добавляемыми после сушки, или из окружающей среды в процессе упаковки готового продукта.

1.5. Предлагаемый метод определения бактерий Е. sakazakii в пищевых продуктах, предназначенных для детей раннего возраста, предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе. Настоящие методические указания также предусматривают определение количества Е. sakazakii в пищевых продуктах для детей раннего возраста методом наиболее вероятного числа (НВЧ).

1.6. Обнаружение Е. sakazakii в 300 г инстантных молочных смесей и продуктов прикорма сухих, предназначенных для детей 1 года жизни, или в 300 г сухих молочных смесей или специализированных продуктов для детей младше 6 месяцев, должно рассматриваться как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, свидетельствующее о высокой степени риска для детей данной возрастной категории, и служить основанием для запрета использования такой продукции с принятием соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов детского питания.

1.7. Методические указания носят рекомендательный характер.

(Введен дополнительно. Изм. от 26.11.2013)

2. Сущность метода

2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие неселективные среды для предварительного обогащения проб, пересеве в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры.

Ниже представлена методическая схема определения Cronobacter spp.

Таблица 1

Схема исследования сухих детских смесей на наличие Cronobacter spp.

2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к Е. sakazakii (Cronobacter spp.). Подтверждение принадлежности к Cronobacter spp. производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20Е, Rapid 20E, ID 32Е (ф. «БиоМерье», Франция) и др.

Определение биохимических характеристик, подтверждающих принадлежность выделенных штаммов к роду Cronobacter spp. и дифференцирующих их от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Биохимическая дифференциация Cronobacter spp.

Ведущими дифференцирующими признаками Cronobacter spp. являются:

• способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при температуре 25 °С;

• наличие α-глюкозидазной активности на хромогенных средах, содержащих 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид;

• отсутствие способности к ферментации D-сорбита.

Для дифференциации Cronobacter spp. от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Envinia spp.) используется тест разжижения желатины.».

(Новая редакция. Изм. от 26.11.2013)

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды

3.1. Аппаратура и инструментарий

3.2. Лабораторная посуда и материалы

3.3. Реактивы и питательные среды

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

(Измененная редакция. Изм. от 26.11.2013)

4. Подготовка к анализу

4.1. Приготовление растворов и реактивов

4.2. Приготовление питательных сред

4.2.1. Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3, готовят согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

4.2.2. Питательный агар с 5 % глюкозы готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

4.2.3. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом.

Состав сред (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) - 15,0.

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 ± 0,2 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С.

4.2.4. Среда для определения подвижности: 20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, устанавливают pH 7,3 ± 0,2, разливают в пробирки по 5 - 7 см³ и стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин.

4.2.5. Среды Гисса с углеводами: 10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают pH 7,1 ± 0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового пурпурного, «ВР» и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 °С в течение 20 мин.

4.2.6. Забуференная пептонная вода

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 ± 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

(Введен дополнительно. Изм. от 26.11.2013)

4.2.7. Модифицированный лаурилсульфат триптозный бульон (мЛСТ) с ванкомицином

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 6,8 ± 0,2 при 25 °С, разливают по 10 мл в пробирки и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Приготовление рабочего раствора ванкомицина: 10 мг ванкомицина растворяют в 10 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают и стерилизуют методом мембранной фильтрации. Готовый раствор ванкомицина может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 15 суток.

Для получения готовой среды раствор ванкомицина вносят в каждую пробирку со стерильной основой мЛСТ в количестве 0,1 см³ для получения конечной концентрации ванкомицина в готовой среде 10 мкг/см³. Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.

(Введен дополнительно. Изм. от 26.11.2013)

4.2.8. Enterobacter sakazakii хромогенный агар (ESIA™)

Компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 ± 0,2 при 25 °С, и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин. Стерилизованную агаровую среду охлаждают до температуры 44 - 47 °С и разливают по 15 см³ в стерильные чашки Петри.

Готовая среда может храниться при температуре от 0 до 5 °С в течение 1 суток.

(Введен дополнительно. Изм. от 26.11.2013)

5. Отбор и подготовка проб к анализу

5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования на патогенные микроорганизмы и минимально вдвое превышать аналитический образец.

5.2. От продукции в потребительской таре пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем чтобы количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров (или неупакованной) пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.

5.3. Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду.

5.4. Первичный посев исследуемых проб продуктов на патогенные микроорганизмы проводят в соответствии с порядком, изложенным в МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

5.5. При отсутствии роста облигатных патогенов, принадлежащих к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но при обнаружении роста сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры в нормируемых навесках исследуемых продуктов, от них отбирают дополнительные пробы (2 навески по 100 г при первичном посеве 100 г продукта, 2 невески по 125 г при первичном посеве 50 г, 2 навески по 137,5 г при первичном посеве 25 г) и анализируют в соответствии с процедурой, изложенной в разделе 6.

6. Проведение анализа

6.1. Пробы продуктов массой 100 г, 125 г или 137,5 г вносят в забуференную пептонную воду (ЗПВ) по п. 4.2.6 в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) ч.

6.2. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (см³).

Из подготовленной по п. 5 пробы отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (см³) каждая для анализа. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 см³ ЗПВ и перемешивают.

Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (см³) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (см³) и производят посев в 90 см³ ЗПВ и перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (см³) и производят посев в 9 см³ ЗПВ. Для посева (при необходимости - предполагаемом высоком содержании Cronobacter spp. в продукте) меньших количеств продукта - 0,1 и 0,01 г, делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г, и вносят по 1 см³ (× 3) соответствующих разведений в 9 см³ ЗПВ.

Посевы термостатируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (22 ± 2) ч.

6.3. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 0,1 см³ суспензии пересевают в 10 см³ модифицированного лаурилсульфат триптозного бульона с ванкомицином (арбитражная среда) или в 10 см³ одной из жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 29184-91 - среду Кесслер с глюкозой, или буферный глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 ± 2) ч.

6.4. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность хромогенного агара по п. 4.2.8 для выявления Cronobacter spp., содержащего 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-α-D-глюкопиранозид (арбитражная среда), или на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG-aгap). Чашки с агаризованной средой предварительно подсушивают. Посевы термостатируют при температуре 44 °С в течение (24 ± 2) ч.

6.5. При отсутствии роста на поверхности хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. или VRBG-aгapa анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе.

6.6. После этапа селективного обогащения проб для обнаружения Cronobacter spp. (п. 6.3), допускается использовать ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в соответствии с процедурой, изложенной в МУК 4.2.2872-11. При получении отрицательных результатов исследований образцов предварительно обогащенных жидких селективных сред с применением ПЦР анализ прекращают и дают заключение об отсутствии Cronobacter spp. в исследованной пробе.

6.7. При обнаружении на чашках хромогенного агара для выявления Cronobacter spp. роста подозрительных культур для дальнейшего изучения отбирают 3 - 5 характерных колоний. При обнаружении на поверхности VRBG-aгapa роста дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты культур, для чего отбирают по 3 - 5 колоний каждого типа.

6.8. Отобранные для исследования 3 - 5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом и термостатируют при температуре 25 °С в течение (48 ± 2) ч. В качестве положительного контроля используют референс-штамм Е. sakazakii (Cronobacter spp.), типичный по фенотипическим свойствам.

6.9. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Cronobacter spp.».

(Новая редакция. Изм. от 26.11.2013)

7. Подтверждение принадлежности выделенных культур к Enterobacter sakazakii

7.1. Подтверждение принадлежности выделенных культур проводят с применением тест-систем для биохимической идентификации API 20Е, Rapid 20Е, ID 32Е.

7.2. К бактериям Enterobacter sakazakii относят культуры, имеющие характерные признаки роста на дифференциально-диагностических средах, при микроскопии по Граму окрашенные отрицательно, подвижные, оксидазоотрицательные, соответствующие комплексу признаков, указанных в табл. 2, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит и не разжижающие желатину. Бактерии Е. sakazakii обладают α-глюкозидазной активностью.

8. Учет результатов

8.1. Результаты оценивают по каждой исследованной пробе отдельно.

8.2. При получении положительного результата подтверждающего анализа дают заключение о выявлении Е. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.

При получении отрицательного результата дают заключение об отсутствии Е. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.

8.3. Учет результатов при количественном определении.

Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий Е. sakazakii при пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по которому, используя таблицу, приведенную в приложении, находят наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий Е. sakazakii, соответствующее их содержанию в 1 г (см³) продукта.

Для окончательного определения НВЧ бактерий Е. sakazakii в анализируемом образце учитывают значение первой выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным наличием Е. sakazakii. Так, в случае если расчет ведется от посева массы (объема) 100 г (см³) (× 3) продукта, количество Е. sakazakii в 1 г (см³) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы соответственно установленному индексу, на 100. В случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (× 3), количество Е. sakazakii в 1 г (см³) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ из таблицы на 10.

Пример: Бактерии Е. sakazakii обнаружены в трех повторностях при посеве 100 г, в трех повторностях при посеве 10 г и в одной - при посеве 1 г.

Результат по числу секторов с подтвержденным ростом бактерий Е. sakazakii из трех выбранных масс записывается как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (см. приложение). Соответственно, наиболее вероятное число бактерий Е. sakazakii составляет 0,46 КОЕ в 1 г продукта.

Если значение НВЧ по таблице составляет величину более чем 110 КОЕ (индекс 3:3:3), исследование целесообразно повторить, используя более высокие разведения образца, в которых исходная концентрация продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально выбранном значении.

9. Требования безопасности

Исследования пищевых продуктов на наличие Enterobacter sakazakii проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».

10. Нормативные ссылки

10.1. ГОСТ 30519-97 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae».

10.2. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

10.3. ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований».

10.4. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

10.5. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

10.6. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

10.7. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

10.8. СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами».

10.9. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

10.10. ГОСТ Р 54005-2010 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae».

10.11. ГОСТ ISO 7218-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям».

10.12. ГОСТ Р 54004-2010 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний».

10.13. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

10.14. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

10.15. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

10.16. ГОСТ 26809-86 «Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу».

10.17. ГОСТ Р ИСО 707-2010 «Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб».

10.18. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

10.19. МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

10.20. Стандарт ISO/TS 22964:2006 IDF/RM 210:2006 «Milk and milk products - Detection of Enterobacter sakazakii».

10. 21. МУК 4.2.2872-11 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией».

10.22. Технический Регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».

(Измененная редакция. Изм. от 26.11.2013)

Приложение

Таблица для расчета наиболее вероятного числа микроорганизмов