4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
пиметрозина в воде, пиметрозина и
его основного метаболита
5-гидрокси-пиметрозина в почве
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3341-16

Москва 2016

1. Разработаны сотрудниками ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, Л.В. Горячева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 февраля 2016 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пиметрозина в воде,
пиметрозина и его основного метаболита
5-гидрокси-пиметрозина в почве методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство об аттестации № РОСС RU.0001.310430/0225.06.04.15.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тройным квадрупольным масс-детектором для определения массовой концентрации пиметрозина в воде в диапазоне 0,0005 - 0,010 мг/дм³, пиметрозина и его основного метаболита 5-гидрокси-пиметрозина в почве в диапазоне 0,005 - 0,1 мг/кг (каждого вещества).

Методические указания носят рекомендательный характер.

Пиметрозин

(Е)-4,5-дигидро-6-метил-4-(3-пиридилметиленамино)-1,2,4-триазин-3(2Н)-он (IUPAC)

C₁₀H₁₁N₅O

Молекулярная масса: 217,2.

Бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления: 217 °С. Давление паров: < 4⋅10^-3 МПа (25 °С). Плотность: 1,36. Растворимость в органических растворителях при 25 °С (в г/дм³): ацетон - 0,94; дихлорметан - 1,2; этилацетат - 0,26; этанол - 2,4; толуол - 0,034; н-октанол - 0,45; н-гексан - < 0,001. Растворимость в воде при 25 °С (г/дм³): 0,29 (pH 6,5). Коэффициент распределения н-октанол-вода - logK_ow = - 0,18. Стабилен на воздухе.

Гидролиз водных растворов при 25 °С: DT₅₀ 5 - 12 дней (pH 5), 616 - 800 дней (pH 7), 510 - 1212 дней (pH 9).

Основным продуктом метаболитической деградации пиметрозина в почве является 5-гидрокси-пиметрозин.

Краткая токсикологическая характеристика пиметрозина. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс (4 часа) - более 1800 мг/м³.

5-гидрокси-пиметрозин

5-гидрокси-6-метил-4(пиридин-3-илметилен)-амино)-4,5-дигидро-(2Н)-1,2,4-триазин-3-он (IUPAC)

C₁₀H₁₁N₅O₂

Молекулярная масса 233,2.

Область применения препарата. Пиметрозин - инсектицид системного действия класса пиридинов, рекомендуемый для борьбы против сосущих и листогрызущих вредителей на злаковых культурах.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

2. Метод измерений

Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным детектором.

Анализа проб отфильтрованной воды проводится непосредственным вводом отфильтрованного образца в хроматограф.

Уровни пиметрозина и его метаболита 5-гидрокси-пиметрозина в пробах почвы определяют после экстракции буферными растворами 10 мМ аммония ацетата последовательно с pH 5,2 и 9,0 с последующим центрифугированием, фильтрованием и разбавлением водой.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 0,5 пг.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением», ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе, подтвердившего экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов и растворов внесения, смесей для экстракции, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик.

7.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.2. Приготовление 10 мМ аммония ацетатных буферов
(pH 5,2 и pH 9)

7.2.1. Приготовление 10 %-го раствора уксусной кислоты. В мерную колбу вместимостью 100 см³, содержащую 50 - 60 см³ дистиллированной воды, помещают 10 см³ ледяной уксусной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.2.2. Приготовление 10 мМ аммония ацетатного буфера (pH 5,2). Растворяют 0,77 г аммония ацетата в 800 см³ дистиллированной воды. Доводят pH до (5,2 ± 0,1) 10 %-го водным раствором уксусной кислоты (контроль по pH-метру). Переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят водой до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят 7 дней при комнатной температуре.

7.2.3. Приготовление 1 М раствора гидроксида натрия. В мерную колбу вместимостью 100 см³, содержащую 50 - 60 см³ дистиллированной воды, помещают 4 г гидроксида натрия, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.2.4. Приготовление 10 мМ аммония ацетатного буфера (pH 9). Растворяют 0,77 г аммония ацетата в 800 см³ дистиллированной воды. Доводят pH до (9,0 ± 0,1) 1 М раствором гидроксида натрия (контроль по pH-метру). Переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят водой до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят 7 дней при комнатной температуре.

7.3. Подготовка смеси ацетонитрил-вода

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 500 см³ ацетонитрила, добавляют 500 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Смесь хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.4. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Промывают колонку смесью ацетонитрил-вода (1:1, по объему), приготовленной по п. 7.3, при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

Перед началом анализа колонку промывают водой при скорости подачи растворителя 0,4 см³/мин в течение 15 мин.

7.5. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.5.1. Исходный раствор пиметрозина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 г пиметрозина, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С в течение месяца.

7.5.2. Исходный раствор 5-гидрокси-пиметрозина для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 г 5-гидрокси-пиметрозина, добавляют 50 - 70 см³ ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С в течение месяца.

Растворы № 1 - 9 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.5.3. Растворы № 1 пиметрозина или 5-гидрокси-пиметрозина для градуировки и внесения (концентрация каждого вещества 1 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 1 см³ исходного раствора пиметрозина (п. 7.5.1) или 5-гидрокси-пиметрозина (п. 7.5.2) с концентрацией 100 мкг/см³, разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Растворы № 1 хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С в течение 1 месяца.

Растворы с концентрацией 1 мкг/см³ используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом «добавок».

7.5.4. Раствор № 2 пиметрозина или 5-гидрокси-пиметрозина для градуировки и внесения (концентрации каждого вещества 0,01 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают по 1,0 см³ градуировочных растворов № 1 с концентрацией пиметрозина и 5-гидрокси-пиметрозина 1,0 мкг/см³ (п. 7.5.3), доводят до метки смесью ацетонитрил-вода (1:1, по объему), приготовленной по п. 7.3, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор № 2 с концентрацией пиметрозина и 5-гидрокси-пиметрозина 0,1 мкг/см³. Раствор № 2 хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С в течение 1 месяца.

7.5.5. Рабочие растворы № 3 - 9 пиметрозина или 5-гидрокси-пиметрозина для градуировки (концентрация каждого вещества по 0,5 - 10,0 нг/см³). В 7 мерных колб вместимостью 100 см³ помещают по 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 5,0; 8,0 и 10,0 см³ градуировочного раствора № 2 с концентрацией пиметрозина или 5-гидрокси-пиметрозина 0,01 мкг/см³ (п. 7.5.4), доводят до метки смесью ацетонитрил-вода (1:1, по объему), приготовленной по п. 7.3, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 3 - 9 с концентрацией пиметрозина или 5-гидрокси-пиметрозина по 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 5,0; 8,0 и 10,0 нг/см³ соответственно.

Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 ± 2) °С в течение 1 месяца.

7.6. Установление градуировочных характеристик

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика (I) от концентрации пиметрозина и 5-гидрокси-пиметрозина в растворе (нг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 7 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ Р 31861-12 «Вода. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 1743.01-83 «Почва, общие требования к отбору проб», ГОСТ 26950-89 «Почвы. Отбор проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (№ 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр, образцы почвы просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

9. Выполнение определения

9.1. Вода

Подготовка проб к определению

Образец отфильтрованной воды тщательно перемешивают и анализируют на содержание пиметрозина в условиях хроматографирования по п. 9.3.

9.2. Почва

Экстракция и подготовка проб к определению

Образец почвы массой 5 г помещают в центрифужный стакан вместимостью 100 см³, вносят 2 см³ 10 мМ раствора аммония ацетата pH 5,2 (подготовленного по п. 7.2.2) и 8 см³ ацетонитрила, интенсивно перемешивают в течении 30 с, затем помещают на встряхиватель и оставляют на 30 мин. Полученный экстракт центрифугируют в течение 10 мин со скоростью вращения 3500 об./мин.

Надосадочную жидкость переносят в мерный цилиндр вместимостью 25 см³.

К осадку в центрифужном стакане добавляют 2 см³ 10 мМ раствора аммония ацетата с pH 9,0 (подготовленного по п. 7.2.4) и 8 см³ ацетонитрила, интенсивно перемешивают в течение течении 30 с, затем помещают на встряхиватель на 30 мин. Экстракт центрифугируют в течение 10 мин со скоростью вращения 3500 об./мин.

Полученные экстракты объединяют в мерном цилиндре, перемешивают, доводят объем до 20 см³ дистиллированной водой, аликвоту подготовленного экстракта, объемом 4 см³ (соответствует 1 г образца) переносят в пробирку на 10 см³, упаривают (отдувают) при комнатной температуре током воздуха до объема ~1 см³. Доводят дистиллированной водой до объема 10 см³, перемешивают и анализируют на содержание пиметрозина и 5-гидрокси-пиметрозина в условиях хроматографирования по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов.

Источник ионизации: электростатическое распыление.

Режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация «перехода»).

Пиметрозин

Материнский ион (масса/заряд): 218,1.

Дочерние ионы (масса/заряд): 105,1 (количественный расчет), 78,2.

Напряжение на фрагментаторе, В: 106.

Энергия разрушения (соударения), В: 18 (105,1 масса/заряд) и 50 (78,2 масса/заряд).

5-гидрокси-пиметрозин

Материнский ион (масса/заряд): 234,1.

Дочерние ионы (масса/заряд): 105,1 (количественный расчет), 78,2.

Напряжение на фрагментаторе, В: 106.

Энергия разрушения (соударения), В: 22 (105,1 масса/заряд) и 54 (78,2 масса/заряд).

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 20 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм³/мин.

Температура газа 1: 325 °С.

Скорость газа 2 (азот): 12 дм³/мин.

Температура газа 2: 400 °С.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °С.

Хроматографическая колонка стальная длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 30 °С.

Скорость потока элюента: 0,4 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 1 мм³.

Подвижная фаза - градиентная подача растворителей: растворитель А - ацетонитрил, растворитель В - вода:

Линейный диапазон детектирования 0,5 - 10 пг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,5 нг/см3, разбавляют смесью ацетонитрил-вода (1:1 по объему) не более чем в 50 раз.

10. Обработка результатов анализа

Содержание пиметрозина в пробах воды и почвы (для почвы с учетом его основного метаболита 5-гидрокси-пиметрозина в эквиваленте действующего вещества) (X, мг/дм³, мг/кг) рассчитывают по формуле:

А, В - концентрации пиметрозина и 5-гидрокси-пиметрозина соответственно, найденные по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, нг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса (объем) анализируемого образца, г (дм³);

С - коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, С = 1 (вода), С = 4 (почва);

K - коэффициент пересчета содержания метаболита 5-гидрокси-пиметрозина на эквивалент пиметрозина по соотношению молекулярных масс (равен 0,93).

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/дм³ (мг/кг);

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8σ_r.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм³ (мг/кг);

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание пиметрозина в пробах воды - менее 0,0005 мг/дм³, пиметрозина и 5-гидрокси-пиметрозина в пробах почвы - менее 0,005 мг/кг»*.

* 0,0005 мг/дм³ и 0,005 мг/кг - пределы обнаружения в пробах воды и почвы соответственно.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее 2 образцов концентраций для градуировки, содержание пиметрозина и 5-гидрокси-пиметрозина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,5 до 10,0 нг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация пиметрозина или 5-гидрокси-пиметрозина в пробе при контрольном измерении, нг/см³;

С - известная концентрация градуировочного раствора пиметрозина или 5-гидрокси-пиметрозина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см³;

В - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10 %, при Р = 0,95).

Если величина расхождения (А) превышает 10 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пиметрозина и 5-гидрокси-пиметрозина, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.6.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом «добавок».

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/дм³ (мг/кг).

Допустимо характеристику погрешности результата анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать с последующим уточнением по мере накопления информации на основе выражения Δ_л = ±0,84Δ, где Δ - граница абсолютной погрешности, мг/дм³ (мг/кг):

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/дм³ (мг/кг).

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/дм³ (мг/кг);

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.