4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
пириметанила в бананах, луке,
орехах и плодовых косточковых
методом капиллярной
газожидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3345-16

Москва 2016

1. Разработаны сотрудниками ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, М.В. Ларькина, С.К. Рогачева, О.Е. Егорченкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 3 марта 2016 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пириметанила
в бананах, луке, орехах и плодовых косточковых
методом капиллярной газожидкостной хроматографии

Свидетельство об аттестации № РОСС RU.0001.310430/0227.06.04.15.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для измерения концентрации пириметанила в бананах, луке, орехах и плодовых косточковых в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Пириметанил N-(4,6-диметилпиримидин-2-ил)анилин (ИЮПАК).

C₁₂H₁₃N₃

Молекулярная масса: 199,11.

Бесцветные кристаллы. Температура плавления 96,3 °С. Плотность 1,15 г/см³ при 20 °С. Давление паров 2,2 МПа (при 25 °С). Растворимость в воде 121,0 г/л (25 °С, pH 7). Хорошо растворим в большинстве органических растворителях. Вещество стабильно при нормальных условиях хранения и не гидролизуется в водном растворе при различных значениях температуры и pH.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс - 4150 - 5971 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс > 5000 мг/кг.

Область применения. Пириметанил - контактный фунгицид с местным системным эффектом, обладающий защитным и лечебным действием.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

2. Метод измерений

Метод основан на определении пириметанила с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии с термоионным или масс-селективным детектором после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетоном, очистке экстрактов, содержащих пириметанил, от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные средства измерений, устройства, материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см²), необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением», ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, прошедших обучение, освоивших методику, владеющих техникой, имеющих опыт работы на газовом хроматографе и подтвердивших соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для экстракции и очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения пириметанила.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка н-гексана. Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка этилацетата.

7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5 %. Навеску (5 ± 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в 40 - 60 см³ дистиллированной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

7.1.2.2. Очистка этилацетата. Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5 %, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

7.1.3. Очистка ацетона. Ацетон перегоняют над небольшим количеством марганцевокислого калия и поташом (на 1 дм³ ацетона 10 г перманганата калия и 2 г карбоната калия) и подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2. Приготовление смесей гексан-ацетон для очистки
экстрактов на колонке с силикагелем

7.2.1. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 90 см³ гексана и 10 см³ этилацетата, перемешивают.

7.2.2. Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 80 см³ гексана и 20 см³ этилацетата, перемешивают.

7.3. Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения

7.3.1. Исходный раствор пириметанила для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,01 г пириметанила, растворяют в 50 - 60 см³ ацетона, доводят им до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С в течение 2 месяцев.

7.3.2. Рабочий раствор № 1 пириметанила для градуировки и внесения (концентрация 20,0 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают 10,0 см³ исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см³ (п. 7.3.1), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор для градуировки и внесения № 1 с концентрацией пириметанила 20,0 мкг/см³.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С в течение месяца.

7.3.3. Рабочие растворы № 2 - 5 пириметанила для градуировки (концентрация 0,2 - 2,0 мкг/см³). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см³ исходного раствора № 1 пириметанила для градуировки и внесения с концентрацией 20,0 мкг/см³ (п. 7.3.2), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 - 5 с концентрациями пириметанила 0,2; 0,4, 1,0 и 2,0 мкг/см³.

Эти растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено» и контроля качества результатов измерений методом «добавок».

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С в течение месяца.

7.4. Установление градуировочой характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации пириметанила в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В испаритель хроматографа вводят по 2 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков пириметанила.

7.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 20 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля в 20 см³ гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 15 см³ ацетона, затем 10 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 9:1, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

7.6. Проверка хроматографического поведения пириметанила
на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора № 5 пириметанила для внесения с концентрацией 2,0 мкг/см³ (п. 7.3.3), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (в объемном соотношении 9:1), выдерживают на УЗ-бане в течение 60 секунд, далее наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей, порциями по 3 см³, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду.

Затем колонку промывают 40 см³ смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Действующее вещество смывают 50 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему). Фракционно (по 10 см³) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), анализируют содержание пириметанила по п. 9.4.

Фракции, содержащие пириметанил, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения пириметанила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ Р 51603-2000 «Бананы свежие. Технические условия», ГОСТ Р 51783-01 «Лук репчатый свежий, реализуемый. Технические условия», ГОСТ 31864-12 «Лук порей свежий, реализуемый в розничной торговле. Технические условия», орехи: ГОСТ 16833-71 «Ядро ореха грецкого. Технические условия», ГОСТ 16830-71 «Орехи миндаля сладкого. Технические условия», ГОСТ 16834-81 «Орехи фундука. Технические условия», ГОСТ 31852-12 «Орехи кедровые очищенные. Технические условия», плодовые косточковые: ГОСТ 21832-76 «Абрикосы свежие. Технические условия», ГОСТ 21833-76 «Персики свежие. Технические условия», ГОСТ 21920-76 «Слива и алыча крупноплодная свежие. Технические условия», ГОСТ 32286-13 «Сливы, реализуемые в розничной торговле. Технические условия», ГОСТ 21921-76 «Вишня свежая. Технические условия», ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб» и «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 7 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °С.

Перед анализом образцы измельчают с помощью гомогенизатора.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Образцы измельченных плодов массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, добавляют 100 см³ ацетона и выдерживают на аппарате для встряхивания 30 минут. Смесь отфильтровывают на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр средней плотности. Операцию повторяют еще 2 раза, используя каждый раз по 50 см³ ацетона. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера. К объединенному экстракту добавляют 30 см³ воды, упаривают смесь дробно до водного остатка при температуре бани не выше 40 °С. Далее проводят очистку по п. 9.2 и 9.3.

9.2. Очистка экстракта в системе
несмешивающихся растворителей

К водному остатку, полученному по п. 9.1, добавляют 10 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают, затем помещают его в делительную воронку вместимостью 250 см³.

Вещество экстрагируют смесью гексан-этилацетат (в объемном соотношении 8:2) трижды в течение 2 минут, используя порции по 30 см³, каждый раз фильтруя его через безводный сульфат натрия. Объединенный экстракт собирают в колбу для упаривания вместимостью 250 см³. Экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха. Далее проводят очистку на колонке с силикагелем по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток, полученный по п. 9.2, находящийся в колбе для упаривания, растворяют в 3 см³ смеси гексан-этилацетат (в объемном соотношении 90:10), выдерживают на УЗ-бане 60 секунд и наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.5. Колбу ополаскивают дважды порциями смеси гексан-этиацетат в объемном соотношении 90:10 по 2,5 см³, которую также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают пробу 40 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 90:10, элюат отбрасывают.

Пириметанил элюируют с колонки 50 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 80:20 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 см³, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 2 см³ смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 80:20, помещают в ультразвуковую баню на 40 - 60 секунд и анализируют содержание пириметанила методом газожидкостной хроматографии по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

9.4.1. Газовый хроматограф, снабженный термоионным детектором.

Хроматографическая, капиллярная, кварцевая колонка длиной 15 м, внутренним диаметром 0,5 мм, содержащая сорбент диметилполисилоксан - 100 % (толщина пленки сорбента 0,5 мкм).

Температура: детектора - 320 °С;

испарителя - 260 °С.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 130 °С, выдержка 1 мин, нагрев колонки со скоростью 5 градусов в минуту до температуры 170 °С, выдержка 2 мин, затем нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 260 °С.

Газ 1 (азот): давление 13 кПа, скорость 34,448 см/с, поток 3,593 см³/мин.

Газ 2: деление потока 1:3; сброс 5,5 см³/мин, с первой минуты - 20,0 см³/мин.

Хроматографируемый объем: 2 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 0,4 - 4,0 нг.

9.4.2. Хроматограф газовый с масс-селективным детектором (метод подтверждения).

Хроматографическая, капиллярная, кварцевая колонка длиной 15 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5 % - фенилполисилоксан, 95 % - диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура детектора: квадруполь - 150 °С, источник - 230 °С, переходная камера - 280 °С.

Температура испарителя: 275 °С.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 100 °С, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 8 градусов в минуту до температуры 150 °С, нагрев колонки со скоростью 25 градусов в минуту до температуры 240 °С, выдержка 4 минут.

Газ 1 (гелий): поток в колонке 1,8 см³/мин.

Давление - 15,667 psi.

Средняя линейная скорость - 45,158 см/с.

Хроматографируемый объем: 1 мм³.

Режим сканирования - SIM, mlz: 198.

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2,0 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор пириметанила с концентрацией 2,0 мкг/см³, разбавляют ацетоном не более чем в 50 раз.

10. Обработка результатов анализа

Содержание пириметанила в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

X - содержание пириметанила в пробе, мг/кг;

А - концентрация пириметанила, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8σ_r.

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание пириметанила в пробе менее 0,02 мг/кг».*

* 0,02 мг/кг - предел обнаружения пириметанила в бананах, луке, орехах и плодовых косточковых.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание пириметанила в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,2 до 2,0 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация пириметанила в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

С - известная концентрация градуировочного раствора пириметанила, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

В - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, % (равен 10 % при Р = 0,95).

Если величина расхождения (А) превышает 10 %, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пириметанила, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.4.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом «добавок».

Величина добавки С_д должна удовлетворять условию:

 - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , С_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Х₁, Х₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.