4.2. Методы контроля. биологические и микробиологические факторы

Методические указания

МУК 4.2.3143-13

"Определение антибиотической активности ферментных
препаратов микробного (бактериального и грибного) происхождения,
предназначенных для использования в пищевой промышленности"

(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека 26 ноября 2013 г.)

Введены впервые

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода контроля антибиотической активности в ферментных препаратах микробного (бактериального и грибного) происхождения, предназначенных для использования в пищевой промышленности.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также иных организаций и учреждений, занимающихся вопросами оценки качества и безопасности пищевых продуктов, аккредитованных (лицензированных) на проведение соответствующих исследований в установленном порядке.

1.3. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Общие положения

Развитие генно-инженерных технологий и биотехнологии обусловило расширение спектра ферментных препаратов микробного происхождения, предназначенных для применения в пищевой промышленности. Определенная часть микробных продуцентов способна наряду с ферментами синтезировать метаболиты с антимикробным действием.

Наличие не идентифицированной остаточной ингибирующей активности в пищевых продуктах, произведенных с применением ферментов, полученных путем микробного синтеза, представляет опасность как непосредственно для микрофлоры кишечника человека, так и появлением в окружающей среде новых антибиотико-резистентных микроорганизмов.

В целях обеспечения безопасности конечных потребителей и гармонизации с аналогичными требованиями ФАО/ВОЗ в Российской Федерации и странах Таможенного союза введено требование - отсутствие "антибиотической активности", которое нуждается в обеспечении соответствующей методической базой, а также в гармонизации с методами, принятыми в международной практике.

В целях гармонизации методов при оценке безопасности ферментных препаратов разработаны настоящие методические указания.

3. Метод измерений

Методика основана на выявлении ингибиции роста штаммов тест-культур неспорообразующих и спорообразующих, грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов веществами антибиотического характера, присутствующими в ферментных препаратах, при культивировании на агаризованных питательных средах на чашках Петри. Метод является качественным.

4. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

4.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.3. Реактивы и питательные среды

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.

4.4. Тест-штаммы микроорганизмов

Тест-штаммы необходимо сохранять в лиофилизированном виде в невскрытых ампулах при температуре 10 °С, не выше. При регулярном использовании после вскрытия ампул и активизации культуры тест-штаммы допускается сохранять на агаризованной среде ТСАДЭ в пробирках с плотно притертыми пробками при температуре 2 - 8 °С с периодическим пересевом на ту же среду не реже 1 раза в 14 дней.

5. Подготовка к проведению испытаний

5.1. Приготовление питательных сред

5.1.1. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (ТСБДЭ).

Для приготовления используют сухую готовую среду ТСБДЭ следующего состава (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0. Допускается приготовление из компонентов.

Сухие компоненты растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,3 ± 0,2.

Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5 - 10 см³ и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

5.1.2. Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (ТСАДЭ).

Для приготовления используют сухую готовую среду ТСАДЭ или готовят из среды по п. 5.1.1, добавляя перед стерилизацией агар микробиологический из расчета 15 г/дм³.

Среду готовят в колбах вместимостью 100 - 250 см³, разливая по 25 - 50 см³ среды, из расчета одна колба на одну тест-культуру, автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

5.2. Подготовка бумажных дисков

Готовят диски из фильтровальной бумаги диаметром 12,5 - 13,0 мм, помещают их в стеклянные чашки Петри и стерилизуют в сушильном стерилизационном шкафу с выдержкой при температуре 160 °С не менее 1 ч.

5.3. Подготовка тест-культур

Шесть пробирок со стерильной средой ТСБДЭ по п. 5.1.1 засевают шестью штаммами тест-культур, для этого каждую культуру со скошенного агара полной петлей переносят в соответствующую промаркированную пробирку с бульоном ТСБДЭ, далее все шесть пробирок помещают в термостат на (37 ± 1) °С и выдерживают в течение (23 ± 1) ч. Для посева используют культуры, выращенные предварительно на скошенном агаре ТСАДЭ по п. 5.1.2 и хранившиеся при температуре (6 ± 2) °С не более 14 дней.

5.4. Подготовка 1 н растворов кислоты и щелочи

Из концентрированной соляной кислоты готовят 1 н раствор кислоты, разбавляя 8,5 мл концентрированной соляной кислоты дистиллированной водой до конечного объема 100 мл.

Из сухой гидроокиси натрия (или калия) готовят 1 н раствор щелочи, растворяя 4 г сухой гидроокиси натрия (5,6 г гидроокиси калия) в дистиллированной воде до конечного объема 100 см³.

Приготовленные растворы стерилизуют при 0,5 ати (112 °С) 15 мин.

6. Отбор и подготовка проб ферментных препаратов

6.1. Отбор и подготовку проб ферментных препаратов производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", ГОСТ Р 54004-10 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний", ГОСТ ISO 7218-11 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям".

Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышать аналитический образец.

6.2. От продукции в потребительской таре пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем, чтобы количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.

6.3. Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду.

6.4. Из отобранной пробы ферментного препарата готовят 10 %-ю суспензию путем добавления навески 1 г к 9 см³ стерилизованной дистиллированной воды, тщательно перемешивают на Вортексе для получения однородной суспензии.

В суспензии измеряют рН и в зависимости от полученного значения доводят значение рН до уровня 6,5 ± 0,5 стерильным 1 н раствором кислоты или щелочи (п. 5.4).

7. Проведение анализа

7.1. Колбы - 6 штук с агаризованной средой (ТСАДЭ) по п. 5.1.2, маркируют в соответствии с используемыми тест-культурами, среду расплавляют и охлаждают до температуры 38 - 40 °С. Далее в каждую колбу вносят соответствующую суспензию суточной тест-культуры, приготовленную по п. 5.3, в количестве 10 % от объема среды для всех тест-культур (кроме Streptococcus pyogenes), аккуратно перемешивают, не допуская образования пены.

Суточную суспензию тест-культуры Streptococcus pyogenes вносят в колбу с подготовленной средой в количестве 5 % от объема среды и также аккуратно перемешивают, не допуская образования пены.

7.2. В промаркированные стерильные чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, вносят инокулированный агар, приготовленный по п. 5.1 в количестве:

- 25 см³ (г) среды в чашки Петри диаметром 90 мм;

- 38 см³ (г) среды в чашки Петри диаметром 11 мм.

Оставляют для застывания на 30 минут, не менее.

7.3. Подготовленную суспензию фермента перемешивают на Вортексе. Далее для каждого фермента (при тестировании нескольких образцов) подготавливают шесть бумажных дисков (по одному для каждой из шести культур). Для этого берут стерильные бумажные диски диаметром 12 мм и насыщают их раствором фермента путем добавления 100 мкл (примерно 3 капли) 10 %-го раствора фермента по п. 6.4.

Подготовленные диски раскладывают по одному на поверхность агара в каждую из шести инокулированных чашек Петри.

7.4. Чашки Петри помещают на ночь в холодильник для диффузии активных компонентов тестируемых ферментных препаратов в агаризованную среду.

Затем чашки Петри переносят в термостат и инкубируют при 37 °С в течение (23 ± 1) ч. После чего проверяют наличие всех зон ингибирования, которые могут быть вызваны ферментным препаратом.

8. Учет результатов

Результаты оценивают для каждой пробы ферментного препарата в комплексе по всем шести тест-культурам.

Определение величины зоны ингибирования вокруг дисков проводят с помощью измерительных инструментов (штангенциркуль, линейка) с точностью до 1 мм.

Наличие прозрачной зоны вокруг диска диаметром не менее 16 мм, определяемой визуально, указывает на наличие антибактериальных компонентов.

Результат расценивают как положительный - наличие антибиотической (антибактериальной) активности у ферментного препарата в случае, если таковая обнаружена в отношении трех (или более) тест-культур.

9. Требования безопасности

Исследования пищевых продуктов на наличие антибиотической (антибактериальной) активности с использованием тест-культур проводят в соответствии с СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

10. Нормативные ссылки

10.1. ГОСТ Р 54004-10 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний".

10.2. ГОСТ ISO 7218-11 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям".

10.3. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований".

10.4. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".

10.5. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".

10.6. Технический регламент Таможенного союза 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств".

10.7. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

СОДЕРЖАНИЕ