4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение химических соединений и
элементов в биологических средах

Сборник методических указаний
МУК 4.1.3056-13, 4.1.3057-13
МУК 4.1.3158 - 4.1.3161-14
МУК 4.1.3230 - 4.1.3233-14

Москва 2015

1. Сборник подготовлен творческим коллективом авторов в составе: д.б.н., проф. А.Г. Малышева (руководитель), к.б.н. А.А. Ермаков, В.А. Шохин (ФГБУ «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Минздрава России).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Методические указания утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Включенные в сборник 10 методических указаний по определению химических соединений в биологических средах предназначены для использования в химико-аналитических исследованиях при проведении биомониторинга состояния здоровья населения, для практического использования в рамках социально-гигиенического мониторинга на территориях с высокой антропогенной нагрузкой, а также могут быть использованы для диагностических целей в рамках осуществления государственного санитарного надзора, контроля, экспертизы, расследований. Методические указания предназначены для специалистов химико-аналитических лабораторий системы Роспотребнадзора, научно-исследовательских институтов, работающих в области экологии человека, гигиены окружающей среды и защиты прав потребителей.

Методические указания, включенные в сборник, разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений», ГОСТ Р 1.5-92 «ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов», МИ 2335-95 «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа», МИ 2336-95 «Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритм оценивания».

Все методики измерения прошли метрологическую аттестацию в соответствии с правилами ПР 50.2.002-94 «ГСИ. Порядок осуществления государственного метрологического надзора за выпуском, состоянием и применением средств измерений, аттестованными методиками выполнения измерений, эталонами и соблюдением метрологических правил и норм».

В методических указаниях, включенных в сборник, приведены методы определения 15 органических соединений и 15 тяжелых металлов и элементов в биологических средах, в том числе 9 веществ и 15 элементов - в крови, 3 вещества и 12 элементов - в моче и 5 веществ - в молоке. Определение токсичных веществ и элементов основано на использовании современных высокочувствительных методов физико-химического анализа - капиллярной газовой хроматографии и газохроматографическом анализе равновесного пара, высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.

Методические указания одобрены и рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение массовой концентрации хлорэтанола
в пробах крови методом капиллярной газовой
хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 224.0516/01.00258/2011 от 15.12.2011.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовой концентрации хлорэтанола в пробах крови в диапазоне 0,05 - 10 мкг/см³.

Методика предназначена для применения в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.

Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Характеристика вещества

Хлорэтанол (2-хлорэтанол)

Хлорэтанол - бесцветная жидкость с эфирным запахом.

Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для крыс 71 мг/кг, мышей - 81 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для мышей 385 мг/м³, для крыс (LC₅₀) - 290 мг/м³; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для крыс 293 мг/кг, для мышей - 18 мг/кг.

3. Требования к показателям точности измерений

3.1. Нормы погрешности измерений

Нормы погрешности измерений массовой концентрации хлорэтанола в пробах крови в нормативной документации не регламентированы.

3.2. Приписанные характеристики погрешности измерений и
ее составляющих

Методика измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведённых в табл. 1.

Таблица 1

Диапазон измерений, значения показателей повторяемости,
воспроизводимости, правильности и точности

Значения показателя точности используют:

- при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- при оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

- при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

4. Метод измерений

Выполнение измерений массовой концентрации хлорэтанола в экстракте пробы крови проводят методом капиллярной газовой хроматографии с электронно-захватным детектированием. Извлечение и концентрирование хлорэтанола из проб крови проводят методом жидкостно-жидкостной микроэкстракции диэтиловым эфиром с применением высаливания хлоридом натрия с последующим центрифугированием.

Определению не мешают диэтиловый эфир, винилхлорид, 1,2-дихлорэтан, хлороформ.

5. Средства измерений, реактивы,
вспомогательные устройства и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

5.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6. Требования безопасности, охраны окружающей среды

6.1. При выполнении работ необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. При работе с газовыми баллонами соблюдают правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением по ПБ 03-576-03.

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88.

6.6. Организуют обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

8. Условия измерений

При выполнении измерений в лаборатории соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление 84,0 - 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);

- относительная влажность воздуха не более 80 %;

- напряжение в сети (220 ± 10) В;

- частота переменного тока (50 ± 10) Гц.

9. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы:

- подготовка хроматографа;

- подготовка посуды;

- приготовление 3 %-го раствора дихромата калия;

- подготовка хроматографической колонки;

- приготовление градуировочных растворов;

- установление градуировочной характеристики.

9.1. Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации хроматографа.

9.2. Подготовка посуды

Используемую посуду необходимо замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3 %-м растворе дихромата калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.

9.3. Приготовление 3 %-го раствора дихромата калия

В термостойкий стакан вместимостью 2 дм³ помещают 50 г дихромата калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дм³ концентрированной серной кислоты. Срок хранения - 1 год.

9.4. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед эксплуатацией устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 4 см³/мин при температуре 240 °С в течение 2 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

9.5. Приготовление градуировочных растворов

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных растворов хлорэтанола в крови. Для приготовления градуировочных растворов используют свежеприготовленный раствор хлорэтанола в воде (с массовой концентрацией 23 мкг/см³) и кровь, не содержащую определяемых компонентов.

9.5.1. Приготовление основного раствора

В мерную колбу вместимостью 500 см³ помещают 100 см³ дистиллированной воды, дозатором вводят 10 мм³ (эквивалентно 11,85 мг) хлорэтанола, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова тщательно перемешивают. Массовую концентрацию хлорэтанола в основном растворе рассчитывают по формуле:

С_осн - концентрация хлорэтанола в основном растворе, мкг/см³;

m_хэ - масса хлорэтанола, мг;

Р - содержание основного вещества в хлорэтаноле;

V_мк - объём мерной колбы, см³.

Концентрация хлорэтанола в основном растворе составляет 23 мкг/см³. Срок хранения основного раствора хлорэтанола - 24 ч.

9.5.2. Приготовление градуировочных растворов

Серию образцов для градуировки, состоящую из 5 аттестованных смесей, готовят в мерных пробирках вместимостью 5 см³. Для этого в каждую мерную пробирку дозатором вводят основной раствор хлорэтанола в соответствии с табл. 2 и доводят до метки 5 см³ кровью, не содержащей определяемый компонент.

Срок хранения градуировочных растворов - 24 ч.

Таблица 2

Приготовление градуировочных растворов

9.6. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц⋅с) от массовой концентрации хлорэтанола (мкг/см³) в крови, устанавливают по 6 сериям измерений по 5 концентрациям вещества в каждой серии для каждого диапазона в соответствии с табл. 3.

В две стеклянные хроматографические виалы вместимостью 1,5 см³ помещают 0,36 г хлористого натрия, 1 см³ градуировочного раствора, 0,5 см³ диэтилового эфира. Виалы закрывают пластмассовой завинчивающей пробкой с тефлонированной мембраной (септой), затем помещают в мульти-вортекс и интенсивно перемешивают в течение 5 мин. После перемешивания виалы центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. После центрифугирования виалы помещают в автоинжектор, который отбирает из виалы 5 мкл верхнего органического эфирного слоя на определённой глубине и вводит в испаритель хроматографа.

Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора, растворы хроматографируют в условиях:

- температурный режим термостата колонки: 90 °С с выдержкой 1 мин, подъём со скоростью 5 °С/мин до 130° с выдержкой 1 мин;

- режим расхода газа-носителя (азота): постоянный поток - 2 см³/мин;

- режим испарителя: температура 160 °С; импульсный ввод 40 p.s.i. 0,75 мин; деление потока 1:5;

- режим детектора: температура 350 °С, поддув азота 60 см³/мин;

- время удерживания хлорэтанола: 8.850 - 8.900 мин.

На полученных хроматограммах проводят идентификацию определяемого компонента по абсолютному времени удерживания и измеряют площади пика определяемого компонента. Каждую виалу хроматографируют 1 раз. По средним результатам параллельных определений (между двумя виалами) серии образцов для градуировки строят градуировочную характеристику.

9.7. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже одного раза в квартал или при смене партии реактивов. Средствами контроля являются вновь приготовленные образцы для градуировки (не менее 2 образцов из приведенных в п. 9.5.2).

Градуировочную характеристику считают стабильной при выполнении для каждого образца для градуировки следующего условия:

 - результат контрольного измерения массовой концентрации определяемого компонента в образце для градуировки, мкг/см³;

С - аттестованное значение массовой концентрации определяемого компонента в образце для градуировки, мкг/см³;

К_гр - норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³:

δ - границы относительной погрешности.

Если условие стабильности градуировочной характеристики не выполняется только для одного образца для градуировки, необходимо выполнить повторное измерение этого образца для исключения результата, содержащего грубую погрешность.

Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины и повторяют контроль с использованием других образцов, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики строят новый градуировочный график.

10. Отбор проб

Отбор проб крови в объёме не менее 5 см³ производится в вакуумные пробирки для забора крови с голубой крышкой. Анализ проб крови проводят непосредственно после отбора проб. Допускается хранение проб в морозильной камере не более 5 дней.

11. Порядок выполнения измерений

В две стеклянные хроматографические виалы вместимостью 1,5 см³ помещают по 0,36 г хлористого натрия, 1 см³ анализируемой пробы крови, 0,5 см³ диэтилового эфира. Виалу закрывают пластмассовой завинчивающей пробкой с тефлонированной мембраной (септой), затем помещают в мульти-вортекс и интенсивно перемешивают в течение 5 мин. После перемешивания виалу помещают в центрифугу и центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. После центрифугирования виалу помещают в автоинжектор, который отбирает из виалы 5 мкл верхнего органического эфирного слоя на определённой глубине и вводит в испаритель хроматографа. Процедуру повторяют аналогично для второго образца (проводят два параллельных определения).

Хроматографирование проводят в условиях в соответствии с п. 9.6. Определяемый компонент идентифицируют по абсолютному времени удерживания. Абсолютное время удерживания определяемого компонента приведено в п. 9.6.

Для количественного расчета хроматограмм применяют метод абсолютной градуировки.

12. Обработка результатов измерений

12.1. На хроматограмме с помощью программы измеряют площадь пика и по градуировочному графику определяют массовую концентрацию хлорэтанола (X, мкг/см³).

12.2. За результат измерений массовой концентрации определяемого компонента в пробе (, мкг/см³) принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений X₁ и Х₂, полученных в условиях повторяемости:

для которых выполняется следующее условие:

r - значение предела повторяемости для двух результатов параллельных определений, % (табл. 3).

При невыполнении условия (4) необходимо дополнительно получить еще два результата параллельных определений. Если при этом расхождение (X_max - X_min) результатов четырех параллельных определений равно или меньше критического диапазона CR_0,95(4), то в качестве окончательного результата принимают среднее арифметическое значение результатов четырех параллельных определений. Значение критического диапазона для четырех результатов параллельных определений в относительных единицах приведено в табл. 3 и рассчитано по формуле:

Q(0,95; 4) - коэффициент, зависящий от числа результатов единичных определений, полученных в условиях повторяемости и доверительной вероятности 0,95:

σ_r - среднеквадратическое отклонение повторяемости, % (табл. 1).

Если расхождение (X_max - X_min) больше CR_0,95(4), в качестве окончательного результата измерений может быть принята медиана четырех результатов параллельных определений. Кроме того, целесообразно выяснить причины появления неприемлемых результатов параллельных определений и устранить их.

Таблица 3

Диапазон измерений, значения пределов повторяемости,
воспроизводимости и критического диапазона
при доверительной вероятности Р = 0,95

12.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости. При выполнении этого условия приемлемы оба результата измерений и в качестве окончательного может быть использовано их общее среднее значение. Значения предела воспроизводимости приведет в табл. 3.

При превышении предела воспроизводимости могут быть использованы методы оценки приемлемости результатов измерений согласно раздела 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и МИ 2881-04.

13. Оформление результатов измерений

Результаты измерений массовой концентрации хлорэтанола , мкг/см³, представляют в виде:

 - результат измерений массовой концентрации хлорэтанола, полученный в соответствии с процедурами раздела 12, мкг/см³,

Δ - абсолютная погрешность измерений массовой концентрации хлорэтанола, мкг/см³, вычисляемая по формуле:

δ - относительная погрешность измерений массовой концентрации хлорэтанола, по табл. 1, %.

U - расширенная неопределенность при k = 2, мкг/см³, вычисляемая по формуле:

U_отн - расширенная неопределенность (в относительных единицах) при k = 2 (табл. 1), %.

Примечание. Числовые значения результата измерений оканчиваются цифрой того же разряда, что и значение показателя точности методики измерений (абсолютной погрешности измерений массовой доли определяемого компонента).

Допустимо результат измерений представлять в виде:

при условии Δ_л < Δ, где Δ, - значение показателя точности измерений (доверительные границы абсолютной погрешности измерений), установленное при реализации настоящего метода в лаборатории и обеспечиваемое контролем стабильности результатов измерений;

при условии U_л < U, где U_л - значение расширенной неопределенности, установленное при реализации настоящего метода в лаборатории и обеспечиваемое контролем стабильности результатов измерений в лаборатории.

Примечание. При необходимости (в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, раздел 5.2) для результата измерений  указывается количество параллельных определений и способ установления результата измерений.

14. Контроль качества результатов измерений

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории предусматривает:

- контроль исполнителем процедуры выполнения измерений;

- контроль стабильности результатов измерений (на основе контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости, среднеквадратического отклонения внутрилабораторной прецизионности, погрешности).

14.2. Контроль исполнителем процедуры выполнения измерений проводят на основе контроля внутрилабораторной прецизионности и погрешности.

14.2.1. Контроль внутрилабораторной прецизионности осуществляют путем сравнения результатов измерений массовой концентрации определяемого компонента в пробе, полученных в условиях внутрилабораторной прецизионности. Расхождение между результатами измерений не должно превышать предела внутрилабораторной прецизионности (R_л), выраженного в единицах измеряемых содержаний:

- результаты измерений массовой концентрации определяемого компонента, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, мкг/см³;

 - среднее арифметическое значение результатов измерений, полученных в условиях внутрилабораторной прецизионности, мкг/см³;

R_л - значение предела внутрилабораторной прецизионности, %.

Значение R_л может быть приведено в протоколе установленных показателей качества результатов анализа при реализации методики измерений в лаборатории.

При невыполнении условия (9) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (9) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

14.2.2. Контроль погрешности с использованием образцов для контроля (ОК).

В качестве ОК используют аттестованные смеси по РМГ 60-2003. Контроль погрешности осуществляют путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К. Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

 - массовая концентрация определяемого компонента в ОК - среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми удовлетворяет условию (4), мкг/см³;

С - аттестованное значение ОК (массовая концентрация определяемого компонента в аттестованной смеси), мкг/см³.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Δ_л - значение характеристики погрешности результатов измерений, соответствующее массовой концентрации определяемого компонента в аттестованной смеси, рассчитанное по формуле:

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении условия:

При невыполнении условия (13) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (13) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

14.3. Периодичность контроля исполнителем процедуры выполнения измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутренних документах лаборатории.

Методические указания разработаны Ангарским филиалом ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН (авторы: О.М. Журба, А.Н. Алексеенко).