1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова), ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 июля 2015 г.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия

человека, Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

А.Ю. Попова

28 июля 2015 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания
МУК 4.1.3290-15

Свидетельство об аттестации
№ 01.5.04.193/01.00043/2015

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Крезоксим-метил.

(Е)-метил-2-метоксиимино-2-{2-(о-толилокси-метил)фенил}ацетат (IUPAC).

C₁₈H₁₉NO₄.

Молекулярная масса 313,4.

Химически чистое вещество представляет собой белое кристаллическое вещество со слабым запахом.

Температура плавления: 97,2 - 101,7 °С.

Давление пара при 20 °С: 2,3×10^-3 мПа.

Растворимость (в г/дм³ при 20 °С): вода - 0,002; гептан - 1,7; толуол - 111, дихлорметан - 939, метанол - 14,9; ацетон - 217, этилацетат - 123.

Стабильность к гидролизу при 20 °С: DT₅₀ 34 дня (pH 7), 7 часов (pH 9). В биологически активных почвах в аэробных условиях крезоксим-метил быстро разрушается: DT₉₀ менее 3 дней.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность LD₅₀ для крыс более 5000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для крыс превышает 2000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами. Не токсичен для пчел, дождевых червей, полезных насекомых и птиц.

Область применения препарата

Синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и искореняющим действием.

В России для крезоксим-метила в подсолнечнике гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

2. Метод измерений

Метод основан на определении крезоксим-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов ацетонитрилом, очистки в системе несмешивающихся растворителей и очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация крезоксим-метила проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг	ГОСТ Р 53228-08
Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г	ГОСТ Р 53228-08
Колбы мерные на 10, 100 и 250 см³	ГОСТ 23932-90
Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1000 мм³ и от 1 до 5 см³
Цилиндры мерные на 50 и 100 см³	ГОСТ 23932-90
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Ацетонитрил для ВЭЖХ	ТУ 2634-002-04715285-2012
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная)	ГОСТ Р 52501-05
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-3375-78
Кислота ортофосфорная, хч	ГОСТ 6552-80
Крезоксим-метил с содержанием основного вещества 98,3 %
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 45:55
Смесь № 1: гексан-этилацетат в соотношении 4:1 по объему
Этилацетат, хч	ГОСТ 1138-84
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи С18, (100×2,1) мм, 1,7 мкм
Вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 25 см³	ГОСТ 9737-93
Колбы плоскодонные на шлифе вместимостью 100 см³	ГОСТ 9737-93
Патроны, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля	ТУ 4215-002-05451931-94
Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см³
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, с пределом вакуума до 10 мбар
Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об./мин
Устройство перемешивающее (50 - 200 колебаний в мин)	ТУ 4389-007-44330709-2011
Фильтры бумажные быстрой фильтрации	ТУ 6.091678-86
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патронов для твердофазной экстракции

Два патрона соединяют последовательно и промывают 5 см³ смеси № 1, затем 5 см³ гексана.

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 45:55 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.3.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1, встряхивают в течение 2 мин, после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску крезоксим-метила (50 ± 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями крезоксим-метила 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы.

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 2,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,4 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2,0 см³ раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1,0 см³ раствора № 2 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация крезоксим-метила в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = K × S, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе,

С_K - результат контрольного измерения массовой концентрации крезоксим-метила в градуировочном растворе,

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λ_контр = 10 % при Р = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения крезоксим-метила на патронах для твердофазной экстракции

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора крезоксим-метила с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленные патроны. Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже вносят на патроны. Промывают патроны 10 см³ гексана, элюат отбрасывают. Затем элюируют крезоксим-метил смесью № 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.

Фракции, содержащие крезоксим-метил, объединяют и вновь анализируют. Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения крезоксим-метила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также отбор проб семян подсолнечника для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».

Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

Для исследовательских целей допускается получение масла в день анализа в лаборатории из проб измельчённых семян с помощью лабораторного пресса.

9. Проведение определения

9.1. Определение крезоксим-метила в семенах и масле подсолнечника

Навеску масла или измельченных семян (5 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³ и добавляют 40 см³ ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, центрифугируют при скорости 4000 об./мин в течение 10 мин, фильтруют через фильтр быстрой фильтрации в круглодонную колбу. К остатку в пробирке добавляют 30 см³ ацетонитрила и проводят повторную экстракцию. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Остаток переносят в делительную воронку тремя порциями по 10 см³ ацетонитрила, насыщенного гексаном, и дважды промывают гексаном по 10 см³. Ацетонитрильный слой собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.2.

9.2. Очистка на двух последовательных патронах для твердофазной экстракции

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов (п. 9.1.), количественно переносят двумя порциями по 1 см³ гексана на подготовленные патроны (п. 7.2). Промывают патроны 10 см³ гексана. Крезоксим-метил элюируют 5 см³ смеси № 1. Элюат количественно переносят в круглодонную колбу емкостью 25 см³ и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 см³ подвижной фазы и анализируют на содержание крезоксим-метила по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи С18, (2,1×100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 45:55. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 230 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³. Время удерживания крезоксим-метила (5,3 ± 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание крезоксим-метила в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика крезоксим-метила на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств крезоксим-метила в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор крезоксим-метила с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

, мг/кг, при вероятности Р = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг.

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения крезоксим-метила в семенах подсолнечника).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_∂ должна удовлетворять условию:

C_∂ = ∆_л,_X + ∆_л,_X’, где

±∆_л,_X (±∆_л,_X’) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

∆_л = ±0,84 × ∆, где

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

K_к = Х' - Х - С_∂, где

Х', Х, С_∂ - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

(1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

ǀK_кǀ ≤ K,

(2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

(3)

Х₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Анализируемый объект	Диапазон определяемых, концентраций, мг/кг (мг/м³, мг/дм³)	Показатель точности^*), (границы относительной погрешности), ±δ, %, при P = 0,95	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), δ_r, %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), δ_R, %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, %, Р = 0,95
Семена	от 0,01 до 0,1	22	6	10	17	28
Масло	от 0,01 до 0,1	22	6	10	17	28
__________ ^*) соответствует расширенной неопределенности U_отн при коэффициенте охвата k = 2.

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
Анализируемый объект	Предел количественного определения, мг/кг (мг/м³, мг/дм³)	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/м³, мг/дм³)	Полнота извлечения вещества, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал среднего результата, ±, %
Семена	0,01	0,01 - 0,1	93,0	2,25	3,16
Масло	0,01	0,01 - 0,1	93,8	3,05	4,27