1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений и ООО «Инновационный центр защиты растений» (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская, В.В. Человечкова, А.А. Далинова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 9 июня 2015 г.

4. Введены впервые.

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека,

Главный государственный санитарный

врач Российской Федерации

А.Ю. Попова

9 июня 2015 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств пирафлуфен-этила
в воде, почве, зерне и соломе хлебных злаков методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Методические указания
МУК 4.1.3266-15

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.190/01.00043/2015 от 12.02.2015.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств пирафлуфен-этила в диапазоне: в воде - 0,001 - 0,01 мг/дм³, в почве и зерне - 0,01 - 0,1 мг/кг, в соломе - 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Пирафлуфен-этил

Ethyl 2-chloro-5-(4-chloro-5-difluoromethoxy-1-methylpyrazol-3-yl)-4-fluorophenoxyacetate (ИЮПАК).

Структурная формула:

Брутто формула: C₁₃H₉Cl₂F₃N₂O₄.

Молекулярная масса: 413,2.

Химически чистое вещество представляет собой белые кристаллы.

Температура плавления: 126,8 °С.

Давление пара при 25 °С: 4,3×10^-6 МПа.

Растворимость в воде: 0,082 мг/дм³ (при 20 °С).

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при 20 °С): ацетон - 175, метанол - 7,39, этилацетат - 108, ксилол - 43.

Стабильность к гидролизу: стабилен при pH 4, неустойчив при pH 7, DT₅₀ = 13 дней, при pH 9 быстро разрушается.

Период полураспада в почве: DT₅₀ = от 0,5 до 4 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD₅₀ для млекопитающих для крыс > 5000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD₅₀ для млекопитающих превышает 2000 мг/кг. Ингаляционная LC₅₀ для крыс более 5,03 мг/м³. Оказывает раздражающее действие на кожу и слизистую глаз. Умеренно токсичен для пчел и почвенных червей.

Область применения препарата. Контактный гербицид; при попадании на растение легко проникает в ткани растения и в присутствии света вызывает быстрый некроз или высушивание стеблей и листьев.

Механизм действия. Ингибитор протопорфириноген-IX оксидазы.

Гигиенические нормативы для пирафлуфен-этила в России не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

2. Метод измерений

Метод основан на определении пирафлуфен-этила методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов ацетонитрилом и очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация пирафлуфен-этила проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допускаемой погрешности 0,1 мг	ГОСТ Р 53228-08
Весы технические с пределом взвешивания до 150 г и пределом допускаемой погрешности 0,1 г	ГОСТ Р 53228-08
Колбы мерные на 10, 100 см³	ГОСТ 23932-90
Микродозаторы одноканальные переменного объема от 100 до 1000 мм³ и от 1 до 5 см³
Цилиндры мерные на 50 и 100 см³	ГОСТ 23932-90

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Ацетонитрил для ВЭЖХ	ТУ 2634-002-04715285-12
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная)	ГОСТ Р 52501-05
Кислота ортофосфорная, хч	ГОСТ 6552-80
Кислота уксусная, ледяная	ГОСТ 61-69
Натрий серно-кислый безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрий уксусно-кислый, ч	ГОСТ 199-68
Натрий хлористый, чда	ГОСТ 4233-77
н-Гексан, хч	ТУ 2631-003-05807999-98
Пирафлуфен-этил с содержанием основного вещества 99,3 %
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М Н₃РO₄ в соотношении 50:50
Смесь № 1: ацетонитрил-вода в соотношении 1:2 по объему
Смесь № 2: ацетонитрил-вода в соотношении 2:1 по объему
Смесь № 3: гексан-этилацетат в соотношении 4:1 по объему
Смесь № 4: гексан-этилацетат в соотношении 2:1 по объему
Этилацетат, хч	ГОСТ 22300-76

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, полностью закрытыми и связанными этилен гибридными мостиками, (100×2,1) мм, 1,7 мкм
Вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 25 см³	ГОСТ 9737-93
Патроны для твердофазной экстракции: № 1 - заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля и № 2 - гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными группами, по 0,4 г	ТУ 4215-002-0545-931-94
Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см³
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, с пределом вакуума до 10 мбар
Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об./мин
Устройство перемешивающее (50 - 200 колебаний в минуту)	ТУ 4389-007-44330709-11

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Кондиционирование патронов

7.2.1. Кондиционирование патрона № 1 с гидрофобным слабокислотным сорбентом с постоянной активностью

Патрон последовательно промывают 3 см³ смеси № 4, затем 3 см³ гексана.

7.2.2. Кондиционирование патрона № 2 с гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными группами

Патрон промывают 3 см³ ацетонитрила, затем 3 см³ воды.

7.3. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 %-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску пирафлуфен-этила (50 ± 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов.

Градуировочные растворы с концентрациями пирафлуфен-этила 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 43:57).

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения пирафлуфен-этила используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация пирафлуфен-этила в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пирафлуфен-этила в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации пирафлуфен-этила в градуировочном растворе;

С_K - результат контрольного измерения массовой концентрации пирафлуфен-этила в градуировочном растворе;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения пирафлуфен-этила на патроне № 1

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора пирафлуфен-этила с концентрацией 1 мкг/см³. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см³ гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 см³ смеси № 3, элюат отбрасывают. Затем элюируют пирафлуфен-этил смесью № 4 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.5.

Фракции, содержащие пирафлуфен-этил, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

7.7. Проверка хроматографического поведения пирафлуфен-этила на патроне № 2

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора пирафлуфен-этила с концентрацией 1 мкг/см³. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см³ ацетонитрила, добавляют 9 см³ воды и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Промывают патрон 5 см³ смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют пирафлуфен-этил смесью № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы и анализируют по п. 9.5.

Фракции, содержащие пирафлуфен-этил, объединяют и вновь анализируют.

Примечание. Проверку хроматографического поведения пирафлуфен-этила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 31861-12 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают.

Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция пирафлуфен-этила из воды

На предварительно кондиционированный патрон № 2 наносят 50 см³ воды, патрон промывают 5 см³ смеси № 1. Пирафлуфен-этил элюируют 5 см³ ацетонитрила, элюат собирают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.2. Экстракция пирафлуфен-этила из почвы, зерна и соломы

Навеску измельченного зерна (10 г), почвы (10 г) или соломы (2 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, добавляют 10 см³ ацетонитрила, воду (для почвы - 5 см³, для зерна и соломы - 10 см³), 4 г безводного серно-кислого натрия, 1 г безводного уксусно-кислого натрия, 1 г натрия хлористого, 0,1 см³ ледяной уксусной кислоты, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают аликвоту 5 см³, переносят в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патронах по пп. 9.3 - 9.4.

9.3. Очистка на патроне № 2

Сухой остаток, полученный по п. 9.2, растворяют в 1 см³ ацетонитрила, добавляют 9 см³ воды и наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2). Патрон промывают 5 см³ смеси № 1, элюат отбрасывают. Пирафлуфен-этил элюируют 5 см³ смеси № 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °С, остаток подвергают очистке на патроне № 1 по п. 9.4.

9.4. Очистка на патроне № 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.3, растворяют в 1 см³ гексана, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2). Колбу ополаскивают еще 1 см³ гексана, который также наносят на патрон. Патрон промывают 5 см³ смеси № 3, элюат отбрасывают. Пирафлуфен-этил элюируют 4 см³ смеси № 4, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °С, остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.5. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, полностью закрытыми и связанными этиленгибридными мостиками, (100×2,1) мм, 1,7 мкм.

Температура колонки: (30 ± 1) °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 50:50.

Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин.

Рабочая длина волны УФ-детектора: 242 нм.

Объем вводимой пробы: 10 мм³.

Время удерживания пирафлуфен-этила: 11,8 ± 0,1 мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пирафлуфен-этила в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика пирафлуфен-этила на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения пирафлуфен-этила, приведенная в табл. 2, %;

n - коэффициент, учитывающий отбор аликвоты экстракта.

Содержание остаточных количеств пирафлуфен-этила в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пирафлуфен-этила с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

(1)

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения пирафлуфен-этила в зерне).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки C_∂ должна удовлетворять условию:

C_∂ = ∆_л,_X + ∆_л,_X', где

±∆_л,_X (±∆_л,_X_’) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

∆_л = ±0,84∆, где

∆ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

Результат контроля процедуры K_к рассчитывают по формуле:

K_к = X' - Х - C_∂, где

X', X, С_∂ - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

(2)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_к) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

(3)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

(4)

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
Анализируемый объект	предел количественного определения, мг/кг (мг/м³, мг/дм³)	диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/м³, мг/дм³)	полнота извлечения вещества, %	стандартное отклонение, %	доверительный интервал среднего результата, ±, %
Вода	0,001	0,001 - 0,01	88,8	3,65	5,12
Почва	0,01	0,01 - 0,1	87,0	3,39	4,75
Зерно	0,01	0,01 - 0,1	86,2	3,68	5,15
Солома	0,05	0,05 - 0,5	87,4	2,26	3,16

Объект анализа	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/м³, мг/дм³)	Показатель точности*) (границы относительной погрешности (Р = 0,95), ±δ, %	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), σ_r, %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), σ_R, %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % (Р = 0,95)
Вода	0,001 - 0,01	23	7	11	20	31
Почва	0,01 - 0,1	24	9	12	25	34
Зерно	0,01 - 0,1	24	9	12	25	34
Солома	0,05 - 0,5	23	7	11	20	31