Государственное санитарно-эпидемиологическое
нормирование
Российской Федерации
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств
пропизахлора в зернобобовых (соя и соевое
масло) методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
Методические
указания
МУК 4.1.3265-15
Москва 2015
1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ Всероссийский НИИ защиты растений Федерального агентства научных организаций (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 мая 2015 г. № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 9 июня 2015 г.
4. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ Руководитель
Федеральной службы _______________________ А.Ю. Попова 9 июня 2015 г. |
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств пропизахлора
в зернобобовых (соя и соевое масло) методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
Методические указания
МУК 4.1.3265-15
Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.187/01.00043/2014.
Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств пропизахлора в бобах и масле сои в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.
Методические указания носят рекомендательный характер.
Пропизахлор
2-chloro-6’-ethyl-N-isopropoxymethylacet-ortho-toluidide (ИЮПАК)
Структурная формула:
Молекулярная масса: 283,8.
Брутто формула: C15H22ClNO2.
Химически чистое вещество представляет собой маслянистую жидкость от пурпурного до светло-коричневого цвета.
Температура плавления: 21,6 °С.
Давление пара при 20 °С: 4,0 МПа.
Растворимость в воде: 184 мг/дм3 (при 20 °С).
Стабильность к гидролизу: стабилен, при 50 °С: DT50 = 5 дней (pH от 4 до 9).
Период полураспада в почве: DT50 от 4 до 14 дней.
Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD50 для млекопитающих для крыс 2088 - 3433 мг/кг, острая дермальная токсичность LD50 для млекопитающих превышает 2000 мг/кг. Ингаляционная токсичность LC50 для крыс более 5000 мг/м3. Оказывает раздражающее действие на кожу и слизистую глаз, канцероген. Класс опасности по ВОЗ III. Не токсичен для пчел, не опасен для почвенных микроорганизмов.
Область применения препарата. Селективный системный гербицид для борьбы с широколиственными сорняками и однолетними травами, адсорбируется корнями.
Механизм действия. Ингибирование синтеза белка.
Гигиенические нормативы для пропизахлора в России: МДУ кукуруза, рапс (зерно, масло), подсолнечник (семена, масло) 0,1 мг/кг.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические параметры
Объект анализа |
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг |
Показатель точности* (границы относительной погрешности (Р = 0,95), ±δ, % |
Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), σr, % |
Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), σR, % |
Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между результатами параллельных определений), r, % |
Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % |
Бобы сои |
от 0,05 до 0,5 вкл. |
24 |
9 |
12 |
25 |
34 |
Масло сои |
от 0,05 до 0,5 вкл. |
24 |
9 |
12 |
25 |
34 |
* Соответствует расширенной неопределенности Uотн. при коэффициенте охвата k =2 |
Полнота извлечения пропизахлора, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата
Анализируемый объект |
Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 |
||||
Предел количественного определения, мг/кг |
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг |
Полнота извлечения вещества, % |
Стандартное отклонение, % |
Доверительный интервал среднего результата, |
|
Бобы сои |
0,05 |
0,05 - 0,5 |
85,2 |
4,26 |
5,97 |
Масло сои |
0,05 |
0,05 - 0,5 |
85,8 |
4,24 |
5,95 |
Метод основан на определении пропизахлора методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов бобов и масла сои ацетонитрилом, очистки в системе несмешивающихся растворителей и на патронах для твердофазной экстракции.
Идентификация пропизахлора проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки. Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
Хроматографическая система: ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, стандартным автосамплером, термостатом колонки; компьютерное программное обеспечение |
|
Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг |
|
Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г |
|
Колбы мерные на 10, 100 см3 |
|
Микродозаторы одноканальные переменного объема от 100 до 1000 мм3 и от 1 до 5 см3 |
|
Цилиндры мерные на 50 и 100 см3 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Ацетонитрил для ВЭЖХ |
ТУ 2634-002-04715285-12 |
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная) |
|
Пропизахлор с содержанием основного вещества 98,9 % |
|
Кислота ортофосфорная, хч |
|
н-Гексан, хч |
ТУ 2631-003-05807999-98 |
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 43:57 |
|
Смесь № 1: гексан-этилацетат в соотношении 4:1 по объему |
|
Смесь № 2: гексан-этилацетат в соотношении 95:5 по объему |
|
Отилацетат, хч |
Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.
Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой трифункциональной С6фенильной фазой, (100×2,1) мм, 1,7 мкм |
|
Вакуумный манипулятор для работы с патронами для твердофазной экстракции |
|
Воронки делительные вместимостью 250 см3 |
|
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 25, 100 см3 |
|
Патроны для твердофазной экстракции, заполненные слабокислым сорбентом на основе силикагеля с постоянной активностью |
ТУ 4215-002-05451931-94 |
Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см3 |
|
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар |
|
Центрифуга со скоростью вращения 4000 об./мин |
|
Устройство перемешивающее (50 - 200 колебаний в мин) |
ТУ 4389-007-44330709-11 |
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.
Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.
Последовательно соединенные патроны промывают 5 см3 смеси № 1, затем 5 см3 гексана.
7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 % ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 43:57 по объёму, используя мерные цилиндры.
7.3.3. Для приготовления гексана, насыщенного ацетонитрилом, в делительной воронке интенсивно встряхивают гексан и ацетонитрил в соотношении 5:1 по объёму и после разделения отбирают верхний слой.
7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску пропизахлора (50 ± 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.
7.4.2. Приготовление градуировочных растворов.
Градуировочные растворы с концентрациями пропизахлора 0,25, 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 43:57).
7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 5,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 1,0 см3 основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.
7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 2,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,5 см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,25 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.
При изучении полноты определения пропизахлора используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация пропизахлора в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пропизахлора в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:
С = KS, где |
S - площадь пика градуировочного раствора.
Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
|
С - аттестованное значение массовой концентрации пропизахлора в градуировочном растворе,
СK - результат контрольного измерения массовой концентрации пропизахлора в градуировочном растворе,
λконтр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λконтр. = 10 % при Р = 0,95).
В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают 1 см3 стандартного раствора пропизахлора с концентрацией 1 мкг/см3. Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см3 гексана и переносят на подготовленные патроны (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см3 гексана и смыв тоже переносят на патроны. Промывают патроны 5 см3 гексана и 5 см3 смеси № 2, элюат отбрасывают. Затем элюируют пропизахлор смесью № 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы и анализируют по п. 9.3.
Фракции, содержащие пропизахлор, объединяют и вновь анализируют.
Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.
Примечание. Проверку хроматографического поведения пропизахлора следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
Для длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла хранят в холодильнике при 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.
Навеску измельченных бобов (10 г) или масла (5 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3, добавляют 30 см3 ацетонитрила, пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют. Ацетонитрил декантируют в делительную воронку. Экстракцию повторяют 20 см3 ацетонитрила. Объединенные ацетонитрильные фракции дважды, порциями по 20 см3, промывают гексаном, насыщенным ацетонитрилом, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.2.
Сухой остаток, полученный по п. 9.1, растворяют в 1 см3 гексана, наносят на предварительно кондиционированные патроны (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см3 гексана и также наносят на патроны. Патроны промывают 5 см3 гексана и 10 см3 смеси № 2, элюат отбрасывают. Пропизахлор элюируют 6 см3 смеси № 1, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °С, остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.
Примечание: ввиду летучести аналита упаривание следует проводить при температуре бани не выше 30 °С.
Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, стандартными автосамплером и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой трифункциональной С6фенильной фазой, (2,1×100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 43:57. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3. Линейный диапазон детектирования от 0,25 мкг/см3 до 5,0 мкг/см3. Время удерживания пропизахлора (9,9 ± 0,1) мин.
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пропизахлора в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
|
Sx - площадь пика пропизахлора на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);
K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;
V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;
Р - навеска анализируемого образца, г.
Содержание остаточных количеств пропизахлора в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пропизахлора с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r - значение предела повторяемости (табл. 1 раздела «Погрешность измерений»), при этом r = 2,8σr.
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
(X ± Δ) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где |
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
|
δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 раздела «Погрешность измерений»), %.
В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг» *
________
* - 0,05 мг/кг - предел количественного определения пропизахлора в масле.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки Сд должна удовлетворять условию:
Сд = Δл,Х + Δл,Хʹ, где |
±Δл,Х (±Δл,Хʹ) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:
Δл = ±0,84Δ, где |
Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
|
δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 раздела «Погрешность измерений»), %.
Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры Кк с нормативом контроля К.
Результат контрольной процедуры Кк рассчитывают по формуле:
|
, Сд - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11 «Проверка приемлемости результатов параллельных определений») содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
|
(2) |
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
|Кк| ≤ К, |
(3) |
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (К):
|
(4) |
X1, Х2 - результаты измерений в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1 «Погрешность измерений»), %.