4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
дифлубензурона в ягодах и соке черной
смородины методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания

МУК 4.1.3132-13

Москва 2014

1. Разработаны сотрудниками ГНУ «Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии» (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.О. Берестецкий, Е.В. Полуэктова); ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России (М.С. Орлов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 октября 2013 г. № 3).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств дифлубензурона
в ягодах и соке черной смородины методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.134/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации дифлубензурона в ягодах и соке черной смородины в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: дифлубензурон.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 1-(4-хлорфенил)-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина.

N-{[(4-хлорфенил)амино]карбонил}-2,6-дифторбензамид (С.А.).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₉ClF₂N₂O₂.

Молекулярная масса: 310,7.

Бесцветное кристаллическое вещество (технический - кристаллы от белых до желтых).

Температура плавления: 228 °С (техн.: 210 - 230 °С).

Давление паров при 25 °С: 1,2×10^-4 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K_ow log Р = 3,89.

Растворимость (г/л) при 20 °С: н-гексан - 0,063, толуол - 0,29, дихлорметан - 1,8, метанол - 1,1, вода - 0,08 мг/л (при pH 7 и 25 °С).

Вещество стабильно в кислых средах (20 °С, pH 5 - 7, DT₅₀ > 150 дней), разлагается в щелочных растворах (при pH 9 DT₃₀ 42 дня).

Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность (LD₅₀) для мышей и крыс - более 4640 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD₅₀) для кроликов - более 2000 мг/кг, для крыс - более 10000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC₅₀) для крыс -более 2,88 мг/л. Токсичен для пчел. СК₅₀ для рыб 130 - 150 мг/л при экспозиции 96 ч.

Мутагенный и онкогенный эффекты при использовании препарата не наблюдались.

Гигиенические нормативы для дифлубензурона в России в ягодах и соке черной смородины не установлены.

Область применения: Несистемный регулятор роста насекомых с контактным и кишечным действием. Используется для уничтожения широкого диапазона насекомых-вредителей, питающихся листьями лесных и плодовых деревьев, а также плодами. Эффективен против яблонной плодожорки, листоверток и др.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1. для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения дифлубензурона, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении дифлубензурона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после его извлечения из образцов ацетонитрилом и очистке экстрактов на патронах для твердофазной экстракции (ТФЭ).

Идентификация дифлубензурона проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленные ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Для приготовления элюента № 1 смешивают в мерной колбе на 100 см³ 40 см³ ацетонитрила и 60 см³ бидистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

7.2.2. Для приготовления элюента № 2 смешивают в мерной колбе на 100 см³ 80 см³ гексана и 20 см³ диэтилового эфира, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Для приготовления элюента № 3 смешивают в мерной колбе на 100 см³ 55 см³ гексана и 45 см³ диэтилового эфира, используя мерные цилиндры.

7.2.4. Для приготовления элюента № 4 смешивают в мерной колбе на 100 см³ 30 см³ ацетонитрила и 70 см³ бидистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

7.2.5. Для приготовления подвижной фазы в мерную колбу на 1 дм³ вносят 600 см³ ацетонитрила и доводят водой объем раствора до метки, встряхивая в течение 2 мин.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску дифлубензурона (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями дифлубензурона 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-вода в соотношении 60:40).

7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения дифлубензурона в ягодах и соке смородины используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дифлубензурона в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе;

С_k - результат контрольного измерения массовой концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, %. (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

7.5. Проверка хроматографического поведения дифлубензурона
на патроне на основе силикагеля с постоянной активностью

Патрон кондиционируют последовательно промывая элюентом № 3 и гексаном (по 6 см³). В испарительную колбу емкостью 50 см³ отбирают 0,1 см³ раствора дифлубензурона в ацетонитриле концентрации 10 мкг/см³, добавляют 3 см³ элюента № 2 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 2 мин. Раствор вносят в кондиционированный патрон. Колбу обмывают 3 см³ элюента № 2 и также вносят в патрон. Затем патрон промывают 6 см³ элюента № 3. Отбирают фракции по 3 см³ каждая, упаривают, сухой остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ в ультразвуковой ванне (10 с) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 9.3.

Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 9.3. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

7.6. Проверка хроматографического поведения дифлубензурона
на патроне с гидрофобным сорбентом с привитыми
гексадецильными группами

Кондиционирование патрона проводят также, как описано в п. 7.5. В круглодонную колбу емкостью 50 см³ вносят 10 см³ воды, добавляют 0,1 см³ раствора дифлубензурона в ацетонитриле концентрации 10 мкг/см³, перемешивают и полученную смесь вносят в кондиционированный патрон. Патрон промывают 6 см³ элюента № 4 и 6 см³ ацетонитрила. Отбирают фракции по 3 см³ каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ в ультразвуковой ванне (10 с) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 9.3. Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 см³ подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 9.3. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания дифлубензурона с патрона может меняться при использовании новой партии патронов и растворителей.

7.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 6829-89 (СТ СЭВ 6534-88) «Смородина черная свежая. Требования при заготовках, поставках и реализации».

9. Проведение определения

9.1. Определение дифлубензурона в ягодах смородины

9.1.1 Экстракция. Для экстракции дифлубензурона навеску массой (10 ± 0,1) г ягод помещают в пробирку емкостью 50 см³, добавляют 30 см³ ацетонитрила, измельчают, перемешивают 1 - 2 мин вручную либо на встряхивателе, центрифугируют 10 мин при 4000 об./мин, супернатант декантируют в мерный цилиндр на 100 см³. Экстракцию повторяют два раза. Объем объединенных растворов доводят ацетонитрилом до 100 см³. Для последующего анализа отбирают 20 см³ раствора (или аликвоту 20 % экстракта) и переносят в испарительную колбу объемом 50 см³. Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пунктам 9.1.2. и 9.1.3.

9.1.2. Очистка на патроне с привитыми гексадецильными группами. Экстракт растворяют в 2 см³ ацетонитрила и добавляют 8 см³ воды. Кондиционируют патрон, как описано в п. 7.5, и вводят в него экстракт (скорость потока не более 2 мл/мин). Обмывают колбу с остатком экстракта элюентом № 4 (6 см³), промывают патрон этим раствором, элюат отбрасывают. Патрон подсушивают током воздуха 1 мин. Аналит смывают в испарительную колбу объемом 50 см³ ацетонитрилом (объем 3 см³). Растворитель отгоняют из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Далее очистку экстракта проводят по п. 9.1.3.

9.1.3. Очистка на патроне с гидрофильным сорбентом с постоянной активностью. Патрон кондиционируют по п. 7.5. Экстракт, очищенный по п. 9.1.2, растворяют в 2 см³ элюента № 2 и вносят в кондиционированный патрон. Колбу обмывают 5 см³ элюента № 2 и также вносят в патрон. Элюат отбрасывают. Аналит смывают элюентом № 3 (3 см³) в испарительную колбу объемом 50 см³. Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Для проведения анализа растворяют сухой остаток в 1,2 см³ ацетонитрила в ультразвуковой ванне (10 с) и добавляют 0,8 см³ воды. После перемешивания в ультразвуковой ванне (10 с) 10 мм³ раствора вводят в хроматограф и проводят анализ по п. 9.3.

9.2. Определение дифлубензурона в соке смородины

Патрон с привитыми гексадецильными группами кондиционируют как описано в п. 7.6 и вводят в него 2 см³ сока (скорость вытекания раствора с патрона должна быть не более 2 см³/мин). Промыть колбу с остатком сока и картридж 6 см³ элюента № 4. Патрон подсушивают током воздуха 1 мин. Аналит смывают в испарительную колбу объемом 50 см³ ацетонитрилом (объем 3 см³). Растворитель упаривают из полученного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Для проведения анализа растворяют сухой остаток в 1,2 см³ ацетонитрила в ультразвуковой ванне (10 с) и добавляют 0,8 см³ воды. После перемешивания в ультразвуковой ванне (10 с) 10 мм³ раствора вводят в хроматограф и проводят анализ по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (100×2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и воды в соотношении 60:40 (по объему). Скорость потока элюента: 0,25 см³/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 260 нм. Объем вводимой пробы 10 мм³.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание дифлубензурона в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика дифлубензурона на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения дифлубензурона, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств дифлубензурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлубензурона 1 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придел повторяемости:

X₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

( ± Δ) мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе «менее нижней границы определения» (например: менее 0,001 мг/кг*, где * - 0,001 мг/кг - предел обнаружения дифлубензурона в ягодах смородины).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_∂ должна удовлетворять условию:

±Δ_{л, Х,} (±Δ_{л, Хʹ}) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг;

при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_k рассчитывают по формуле:

Xʹ, X, С_∂ - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_k) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Определение остаточных количеств дифлубензурона в ягодах и соке черной смородины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии