4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств
аметоктрадина в воде, почве, огурцах,
салате, луке-репке, моркови, томатах,
клубнях и зеленой массе картофеля,
винограде и виноградном соке
методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Методические указания

МУК 4.1.3130-13

Москва 2014

1. Разработаны ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская, А.С. Комарова, В.В. Человечкова); ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России (М.С. Орлов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 октября 2013 г. № 3).

3. Утверждены врио руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 12 ноября 2013 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств аметоктрадина
в воде, почве, огурцах, салате, луке-репке, моркови,
томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде
и виноградном соке методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.129/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации аметоктрадина в воде в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/дм³, в почве, огурцах, луке-репке, моркови, томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде и виноградном соке в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в салате в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: аметоктрадин.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 6-октил-5-этил-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-7-амин.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₅H₂₅N₅.

Молекулярная масса: 275,39.

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок бежевого цвета без запаха.

Температура плавления: 198 °С.

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_ow lgP > 4,4 (20 °С).

Растворимость в воде (мг/дм³, 20 °С): 0,15.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, 20 °С): диметилсульфоксид - 10,7, метанол - 7,2, дихлорметан - 3,0, ацетон - 1,9, этилацетат - 0,8, ацетонитрил - 0,5, толуол - 0,1, н-гептан - 0,01.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность ЛД₅₀ > 2000 мг/кг массы тела. Острая кожная токсичность ЛД₅₀ > 2000 мг/кг массы тела. Острая ингаляционная токсичность ЛК₅₀ (4 ч) > 5,3 мг/л. Раздражающее действие для кроликов: кожа - не раздражает; глаза - не раздражает.

Сенсибилизация - не обладает.

Область применения: системный высокоизбирательный фунгицид, применяется на овощах и винограде против фитофтороза, переноспороза, бремия и др.

В России для аметоктрадина гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Таблица 2

Полнота извлечения аметоктрадина, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0,95

2. Метод измерений

Методика основана на определении аметоктрадина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью, очистки перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и исследующей очистки на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация аметоктрадина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Аметоктрадин с содержанием основного вещества 99,7%
Ацетон, осч	ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил, хч	ТУ 6-09-3534-87
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная)	ГОСТ Р 52501-05
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-3375-78
Кислота ортофосфорная, хч	ГОСТ 6552-80
Магний серно-кислый семиводный, хч	ГОСТ 4523-77
Метилен хлористый, хч	ТУ 2631-019-44493179-98
Натрия гидроксид, хч	ГОСТ 4328-77
Натрий серно-кислый безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, чда	ГОСТ 4233-77
Смесь № 1: гексан-ацетон в соотношении 9:1 по объему
Смесь № 2: гексан-ацетон в соотношении 4:1 по объему
Смесь № 3: ацетон-вода в соотношении 3:1 по объему
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 ± 5) °С и относительной влажности не более 80 %;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 см³/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.3. Кондиционирование патрона для твердофазной экстракции

Патрон для удаления кислотных компонентов пробы (слабоосновный анионообменник с привитыми аминогруппами) промывают 2 см³ смеси № 2, затем 3 см³ смеси № 1.

7.2. Приготовление растворов

7.3.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 ± 0,01) г 98 % ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65 по объёму, используя мерные цилиндры.

7.3.3. 20 %-й раствор натрия хлористого: в мерную колбу объемом 1 дм³ помещают 200 г натрия хлористого, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.3.4. 0,2 М раствор натрия гидроксида: 8,0 г натрия гидроксида помещают в мерную колбу объемом 1 дм³, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.4. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.4.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см³: точную навеску аметоктрадина (50 ± 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

7.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями аметоктрадина 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/см³ готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65).

7.4.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 0,2 см³ основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.4.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 5,0 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 2 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 1 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.4.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 00,5 мкг/см³: в мерную колбу вместимостью 10 см³ помещают 0,5 см³ раствора № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения аметоктрадина в воде, почве, огурцах, салате, луке-репке, моркови, томатах, клубнях и зеленой массе картофеля, винограде и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.5. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация аметоктрадина в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм³ градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

С - аттестованное значение массовой концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе;

С_k - результат контрольного измерения массовой концентрации аметоктрадина в градуировочном растворе;

λ_контр. - норматив контроля градуировочного коэффициента, % (λ_контр. = 10 % при Р = 0,95).

7.6. Проверка хроматографического поведения
аметоктрадина на патроне

В круглодонную колбу емкостью 10 см³ отбирают 1 см³ стандартного раствора аметоктрадина с концентрацией 1 мкг/см³. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 1 см³ смеси № 1 и переносят на подготовленный патрон (п. 7.2). Колбу обмывают 1 см³ смеси № 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 3 см³ смеси № 1, элюат отбрасывают. Затем элюируют аметоктрадин смесью № 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см³, упаривают досуха, растворяют в 1 см³ подвижной фазы (ацетонитрил - 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты, 35:65) и анализируют по п. 9.6.

Фракции, содержащие аметоктрадин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения аметоктрадина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (№ 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб». Отбор проб овощей производится в соответствии с техническими условиями по ГОСТ 1726-85 «Огурцы свежие»; ГОСТ 27166-86 «Лук репчатый свежий, заготовляемый и поставляемый»; ГОСТ 1721-85 «Морковь столовая свежая, заготовляемая и поставляемая»; ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие»; ГОСТ 7194-81 «Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества». Отбор проб винограда проводится в соответствии с техническими условиями по ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый». Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы упаковке в морозильной камере при -18 °С.

9. Проведение определения

9.1. Экстракция аметоктрадина из воды

Пробу йоды 100 см³ помещают в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 30 см³ хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см³ хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции пропускают через воронку, содержащую безводный натрий серно-кислый, и собирают в круглодонную колбу вместимостью 25 см³. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см³ подвижной фазы и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.2. Экстракция аметоктрадина из почвы

Навеску измельченной почвы 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см³, последовательно добавляют 5 см³ воды, 10 см³ ацетонитрила, 8 г семиводного магния сернокислого и 1 г натрия хлористого. Пробирку плотно закрывают и помещают в аппарат для встряхивания на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4000 об./мин. От верхнего ацетонитрильного слоя отбирают аликвоту 5 см³, переносят в круглодонную колбу вместимостью 25 см³. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.5.

9.3. Экстракция аметоктрадина из огурцов, салата, лука-репки,
моркови, томатов, винограда, зеленой массы и клубней картофеля

Навеску измельченной культуры (5 г - зеленая масса картофеля, 10 г - огурцы, салат, лук-репка, морковь, томаты, виноград, клубни картофеля) помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 30 см³ смеси № 3 и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Водноацетоновый экстракт декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, пропуская через бумажный фильтр быстрой фильтрации, к остатку в колбе добавляют 20 см³ смеси № 3 и повторяют экстракцию. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка, добавляют 20 см³ 20 %-го водного раствора натрия хлористого, доводят объем до 100 см³ 0,2 М раствором натрия гидроксида и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 30 см³ хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см³ хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке 20 см³ 0,2 М раствора натрия гидроксида, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, пропуская через воронку, содержащую безводный натрий серно-кислый. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

9.4. Экстракция аметоктрадина из виноградного сока

Навеску 10 г сока помещают в стакан вместимостью 150 см³, добавляют 20 см³ 20 %-го водного раствора натрия хлористого, доводят объем до 100 см³ 0,2 М раствором натрия гидрокида и переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, добавляют 30 см³ хлористого метилена и интенсивно встряхивают 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отбирают, к водному добавляют 30 см³ хлористого метилена и экстракцию повторяют. Объединенные органические фракции промывают в делительной воронке 20 см³ 0,2 М раствора натрия гидроксида, собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 см³, пропуская через воронку, содержащую безводный натрий серно-кислый. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток подвергают очистке на патроне по п. 9.5.

9.5. Очистка на аминофазном ионообменном патроне

Сухой остаток, полученный по пп. 9.2 - 9.4, растворяют в 1 см³ смеси № 1, наносят на предварительно кондиционированный патрон (п. 7.2), колбу ополаскивают 1 см³ смеси № 1 и также наносят на патрон. Патрон промывают 3 см³ смеси № 1, элюат отбрасывают. Аметоктрадин элюируют 5 см³ смеси № 2, элюат собирают, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе, остаток растворяют в подвижной фазе (0,5 см³ - почва; 1 см³ - огурцы, салат, лук-репка, морковь, томаты, клубни и зеленая масса картофеля, виноград и виноградный сок) и 10 мм³ вводят в хроматограф.

9.6. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка для неионогенных среднеполярных соединений (2,1×100) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 ± 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65. Скорость потока элюента: 0,2 см³/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 295 нм. Объем вводимой пробы 10 мм^3.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание аметоктрадина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

S_x - площадь пика аметоктрадина на хроматограмме испытуемого образца, мм² (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см³;

Р - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения аметоктрадина, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств аметоктрадина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор аметоктрадина с концентрацией 1,0 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

Х₁, Х₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (r = 2,8σ_r).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

() мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

 - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,005 мг/кг*, где * - 0,005 мг/кг - предел обнаружения аметоктрадина в салате).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки С_∂ должна удовлетворять условию:

±Δ_{л, Х}, (Δ_{л, Хʹ}) - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

Δ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

δ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры K_k рассчитывают по формуле:

Хʹ X, С_∂ - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K_k) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

X₁, Х₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.