ГОСТ Р 55979-2014

     

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Методы определения пектат- и пектин-лиазной активностей

Enzyme preparations for food industry. Methods for determination of pectat- and pectin-lyaze activities

     

ОКС 65.120

Дата введения 2015-07-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии" Россельхозакадемии (ГНУ "ВНИИПБТ" Россельхозакадемии)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 176 "Спиртовая, дрожжевая и ликеро-водочная продукция"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 25 марта 2014 г. N 222-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ИЗДАНИЕ (февраль 2020 г.) с Поправкой (ИУС 9-2015)

Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

           

     1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты и ферментсодержащие смеси - источники ферментов, разрушающие пектиновые вещества по трансэлиминазному механизму действия, применяемые в пищевой промышленности, и устанавливает методы определения пектат- и пектин-лиазной активности.

     2 Нормативные ссылки      

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0.004 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.2.007.0 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 12.4.103 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация

ГОСТ 61 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 199 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-х водный. Технические условия

ГОСТ 450 Кальций хлористый технический. Технические условия

ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9412 Марля медицинская. Общие технические условия

ГОСТ 10652 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия

ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13867 Продукты химические. Обозначения чистоты

ГОСТ 18481 Ареометры и цилиндры стеклянные. Общие технические условия

ГОСТ 20264.0 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб

_______________

Действует ГОСТ Р 57248-2016.

ГОСТ 20903 Кюветы прямоугольные кварцевые для спектрофотометров. Основные размеры. Технические требования

ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29186 Пектин. Технические условия

ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р ИСО 5725-2 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р 53228 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ Р 55298-2012 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения пектолитической активности

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

     3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 трансэлиминазы: Ферменты, осуществляющие негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в продуктах расщепления.

3.2 субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.

3.3 пектин: Высокомолекулярный полисахарид, состоящий из водорастворимых полигалактуроновых кислот, карбоксильные группы которых в различной степени этерифицированы метанолом.

3.4 системные названия ферментов: Названия, указывающие на природу химической реакции, катализируемой данным ферментом, в соответствии с современной классификацией (КФ), принятой Международной комиссией по ферментам.

Примечание - По субстратной специфичности действия пектин-трансэлиминазы подразделяют на две основные группы (см. [1]):

1 полигалактуронатлиаза (КФ 4.2.2.2) - пектат-лиаза - катализирует неупорядоченное расщепление пектатов с образованием ненасыщенных продуктов гидролиза;

2 полиметилгалактуронатлиаза (КФ 4.2.2.10) - пектин-лиаза - катализирует расщепление высокоэтерифицированного пектина без предварительной деэтерификации.

3.5 ферментативная активность: Количество фермента, катализирующее гидролиз 1 мкмоля субстрата в определенных условиях.

     4 Требования к условиям измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

     

     5 Метод определения пектат-лиазной активности (пектат-лС)
     

     5.1 Сущность метода

5.1.1 Метод определения пектат-лиазной активности основан на расщеплении низкометоксилированного пектина анализируемым ферментным препаратом до ненасыщенных продуктов гидролиза, увеличивающих оптическую плотность на 0,1.

5.1.2 За единицу пектат-лиазной активности пектат-лС принято такое количество фермента, которое вызывает образование ненасыщенных продуктов гидролиза пектина при температуре 40°C, детектируемых при длине волны 235 нм.

Активность выражается ед. пектат-лС/г (для сухого) или ед. пектат-лС/см (для жидкого) анализируемого ферментного препарата.

Диапазон измерений составляет от 30 до 100 единиц пектат-лиазной (пектат-лС) активности.

     5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы, материалы

5.2.1 Для определения пектат-лиазной активности используют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, посуду, реактивы, материалы:

- весы неавтоматического действия по ГОСТ Р 53228, обеспечивающие точность взвешивания с пределами допускаемой погрешности ±0,01 г;

- спектрофотометр с дейтериевой и галогенной лампами, со спектральным диапазоном измерений от 190 до 1100 нм, пределами допускаемой абсолютной погрешности при измерении оптической плотности ±0,003;

- pH-метр любого типа для измерения в диапазоне от 0 до 14 ед. pH с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации ±0,1 ед. pH;

- холодильник бытовой любой марки;

- мешалку магнитную любой марки, которая обеспечивает скорость вращения до 800 об/мин;

- ультратермостат или водяной термостат с точностью регулирования температуры ±1°C;

- центрифугу лабораторную любого типа, которая обеспечивает скорость вращения не менее 7000 об/мин;

- баню водяную любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100±1)°C;

- секундомер с емкостью шкалы счетчика 1 мин, ценой деления 1 с и погрешностью ±1,5 с;

- пипетки автоматические вместимостью от 0,1 до 1,0 см, 1,0 см и от 0,2 до 5,0 см с наконечниками;

- встряхиватель для перемешивания жидкости со скоростью вращения от 50 до 3400 об/мин.;

- термометры ртутные стеклянные лабораторные от 0°C до 50°C и от 0°C до 100°C с ценой деления 0,1°C или 0,5°C по ГОСТ 28498;

- стаканы и колбы стеклянные лабораторные В-1-150 ТС, В-1-800 ТС, Кн-1-100-14/23 ТС по ГОСТ 25336;

- стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-19/9 по ГОСТ 25336;

- стаканы В-1 вместимостью от 100 до 2000 см по ГОСТ 25336;

- воронки В-75-140 ХС по ГОСТ 25336;

- пробирки П1-14-120 ХС или П1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;

- колбы мерные 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-200-2, 1-250-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770;

- цилиндры 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2 по ГОСТ 1770;

- пипетки стеклянные 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-5, 1-2-2-10 по ГОСТ 29227;

- кюветы кварцевые термостатируемые по ГОСТ 20903;

- бумагу фильтровальную лабораторную по ГОСТ 12026;

- марлю медицинскую по ГОСТ 9412;

- пектин яблочный со степенью метоксилирования не более 35% и массовой долей основного вещества не менее 70% по ГОСТ 29186;

- трис (оксиметиламинометан) с массовой долей основного вещества 99%;

- кислоту соляную по ГОСТ 3118;

- кальций хлористый по ГОСТ 450;

- воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Примечание - Для приготовления растворов (см. 4.3) используют дистиллированную воду температурой 20°C.

5.2.2 Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867.

5.2.3 Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам, а также посуды, реактивов и материалов, по качеству не хуже вышеуказанных.

     5.3 Подготовка к анализу

5.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 20264.0.

5.3.2 Приготовление трис-HCL-буферного раствора молярной концентрации 0,2 моль/дм с 8,4 ед. pH из растворов трис (оксиметиламинометана) и соляной кислоты

5.3.2.1 Приготовление раствора трис (оксиметиламинометана) молярной концентрации 0,2 моль/дм(раствор A)

В мерную колбу вместимостью 1 дм помещают (24,23±0,01) г трис (оксиметиламинометана) и растворяют приблизительно в 300 см дистиллированной воды. Затем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения раствора трис (оксиметиламинометана) в закрытой стеклянной посуде при температуре 4°C - не более 1 мес.

5.3.2.2 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм(раствор B)

8,57 см концентрированной соляной кислоты растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1 дм.

Срок хранения раствора соляной кислоты в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°C - не более 1 мес.

5.3.2.3 Для приготовления трис-HCL-буферного раствора в колбе смешивают 25 см раствора A с 18 см раствора B и добавляют дистиллированной воды до объема 85-90 см до получения кислотности буферного раствора, равной 8,4 ед. pH. При необходимости кислотность раствора доводят до 8,4 ед. pH одним из исходных растворов.

Срок хранения буферного раствора в закрытой стеклянной посуде при температуре 4°C - не более 1 мес.

5.3.3 Приготовление раствора хлористого кальция молярной концентрации 0,01 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 100 см помещают (0,11±0,01) г безводного хлористого кальция и растворяют приблизительно в 25 см дистиллированной воды. Затем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения раствора хлористого кальция в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°C - не более 1 мес.

5.3.4 Приготовление 0,8%-ного раствора пектина

Пектин, взятый с расчетом, чтобы 100 см раствора содержало 0,8 г чистого пектина в соответствии с ГОСТ Р 55298-2012 (приложение A), всыпают тонкой струей при непрерывном перемешивании в мерную колбу вместимостью 100 см, в которую предварительно наливают 25 см дистиллированной воды и 5-6 см трис-HCL-буферного раствора, приготовленного по 5.3.2. Раствор непрерывно перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 ч до полного растворения пектина и корректируют водородный показатель до значения 8,4 ед. pH раствором трис (оксиметиламинометана) - раствор A, приготовленный по 5.3.2.1. По истечении этого времени объем раствора доводят до 100 см дистиллированной водой, тщательно перемешивают и фильтруют через четыре слоя марли.

Срок хранения раствора пектина в холодильнике при температуре 4°C - не более двух суток.

     5.4 Подготовка пробы

Анализируемые пробы ферментных препаратов в сухом или жидком виде используют без предварительной подготовки.

5.4.1 Приготовление основного раствора анализируемой пробы ферментного препарата

В стаканчик для взвешивания шпателем помещают (0,1000±0,0002) г сухого ферментного препарата для получения анализируемой пробы или (1,00±0,02) см жидкого ферментного препарата вносят в другой стаканчик пипеткой. Полученную пробу ферментного препарата суспендируют в стеклянном бюксе с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20°C и тщательно перемешивают. Приготовленный раствор ферментного препарата является основным раствором анализируемой пробы.

Срок хранения основного раствора ферментного препарата при температуре 20°C - не более 1 мес.

5.4.2 Приготовление рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата

Рабочий раствор анализируемого ферментного препарата готовят из основного раствора по 5.4.1 путем дальнейшего разведения его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности таким образом, чтобы при ее определении показания оптической плотности спектрофотометра были в пределах от 0,100 до 0,350 нм.

         

С учетом разведения рассчитывают количество препарата, взятого на анализ.

Каждую пробу анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии в требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-2.

Раствор готовят в день определения. Длительность использования рабочего раствора ферментного препарата не должна превышать 1 ч с момента приготовления во избежание потерь его ферментативной активности.

     5.5 Проведение определений

Перед началом определения активности готовят реакционную смесь путем смешивания в строгой последовательности трех растворов: 0,8%-ный раствор пектина + раствор трис-HCL-буфера молярной концентрации 0,2 моль/дм+ раствор хлористого кальция молярной концентрации 0,01 моль/дмв соотношении 5:2:1 по объему.

Срок хранения реакционной смеси в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°C - не более 12 ч.

В опытную пробирку наливают 9 см реакционной смеси и прогревают на водяной бане в течение 5 мин при температуре 40°C. В прогретую реакционную смесь добавляют 1 см раствора ферментного препарата и инкубируют на водяной бане 15 мин строго по секундомеру при температуре 40°С. Затем отбирают 1 см смеси и переносят в пробирку, содержащую 9 см раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дмдля прекращения реакции.

В контрольную пробирку, содержащую 9 см раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм, приливают 1 см раствора ферментного препарата, содержимое тщательно перемешивают и добавляют 9 см реакционной смеси.

Оптическую плотность анализируемого раствора измеряют против контрольного раствора на спектрофотометре в термостатируемых кварцевых кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 1 см при длине волны 235 нм.

     5.6 Обработка результатов

Пектат-лиазную активность (пектат-лС) в анализируемой пробе ферментного препарата вычисляют по формулам:

- для сухого препарата в ед. пектат-лС/г

,                                                                    (1)

где - оптическая плотность анализируемого раствора;

10 - разведение реакционной смеси;

- время реакции, 0,25 ч;

- масса ферментного препарата, взятая на анализ, г;

0,1 - условное увеличение оптической плотности в течение часа;

- для жидкого препарата в ед. пектат-лС/см

,                                                           (2)

где - плотность для концентрированных жидких ферментных препаратов (см. ГОСТ 18481), г/см.

Оптическая плотность должна быть в пределах от 0,10 до 0,35 нм.

Если полученный результат определений выше верхнего предела диапазона измерений, то результат измерений представляют в виде: пектат-лиазная активность выше 100 ед. пектат-лС/г (100 ед. пектат-лС/см), допускается разведение дистиллированной водой при температуре 20°C до значений, находящихся в пределах допустимых показаний прибора.

5.6.1 Оформление результатов определений

За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости

,                                                 (3)

          

где - значение границ абсолютной погрешности определений (расширенная неопределенность с коэффициентом охвата 2), ед. пектат-лС/г (для сухого препарата) или ед. пектат-лС/см (для жидкого препарата);

- границы относительной погрешности результата определений пектат-лиазной активности в анализируемой пробе при 0,95 составляют ±7%;

- среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, признанных приемлемыми (см. 4.7.1), ед. пектат-лС/г (для сухого препарата) или ед. пектат-лС/см (для жидкого препарата).

Результат определений при доверительной вероятности 0,95 представляют в виде

.

Результаты определений выражают с точностью до первого десятичного знака ед. пектат-лС/г (для сухого препарата) или ед. пектат-лС/см (для жидкого препарата).

     5.7 Сходимость и воспроизводимость результатов

5.7.1 Результаты определений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признают удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

,                                         (4)

где и - результаты двух параллельных определений, полученные в условиях повторяемости при 0,95, ед. пектат-лС/г (для сухого препарата) или ед. пектат-лС/см (для жидкого препарата);

- среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, ед. пектат-лС/г (для сухого препарата) или ед. пектат-лС/см (для жидкого препарата);

- предел повторяемости (сходимости) при 0,95, равный 5%.

5.7.2 Результаты определений, полученные в условиях воспроизводимости по ГОСТ Р ИСО 5725-2, признают удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

,                                       (5)

где и - окончательные результаты определений, полученные в двух лабораториях в условиях воспроизводимости в точном соответствии с методом, ед. пектат-лС/г (для сухого препарата) или ед. пектат-лС/см (для жидкого препарата);

- среднеарифметическое значение двух окончательных результатов определений, полученных в условиях воспроизводимости, ед. пектат-лС/г (для сухого препарата) или ед. пектат-лС/см (для жидкого препарата);

- критическая разность, равная 10% при доверительной вероятности 0,95.

     6 Метод определения пектин-лиазной активности (пектин-лС)

     6.1 Сущность метода

6.1.1 Метод определения пектин-лиазной активности основан на расщеплении высокометоксилированного пектина анализируемым ферментным препаратом до ненасыщенных продуктов гидролиза, увеличивающих оптическую плотность на 0,1.

6.1.2 За единицу пектин-лиазной активности принято такое количество фермента, которое при действии на пектин за 1 мин при температуре 40°C образует 1 мкмоль 4,5-ненасыщенных продуктов реакции.

Активность выражается в ед. пектин-лС/г (для сухого) или ед. пектин-лС/см (для жидкого) анализируемого ферментного препарата.

Диапазон измерений составляет от 30 до 100 ед. пектин-лиазной (пектин-лС) активности.

     6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы, материалы

6.2.1 Для определения пектин-лиазной активности применяют средства измерений, вспомогательное оборудование, лабораторную посуду, материалы, реактивы, указанные в 5.2.1, со следующим дополнением:

- пектин цитрусовый со степенью метоксилирования не менее 60% и массовой долей основного вещества не менее 70% по ГОСТ 29186;

- натрий уксуснокислый по ГОСТ 199;

- соль дигидратдинатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) по ГОСТ 10652;

- кислота уксусная по ГОСТ 61.

6.2.2.Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам, а также посуды, реактивов и материалов, по качеству не хуже вышеуказанных.

     6.3 Подготовка к анализу

6.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 20264.0.

6.3.2 Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,05 моль/дмс 5,0 ед. pH из растворов уксуснокислого натрия и уксусной кислоты (ледяной)

6.3.2.1 Приготовление раствора уксуснокислого натрия (CHCOONa) молярной концентрации 0,05 моль/дм(раствор A)

В мерную колбу вместимостью 1 дм помещают (4,10±0,01) г безводного уксуснокислого натрия или (6,80±0,01) г CHCOONa·3HO и растворяют приблизительно в 300 см дистиллированной воды. Затем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения раствора А в закрытой стеклянной посуде при температуре 4°C - не более 1 мес.

6.3.2.2 Приготовление раствора ледяной уксусной кислоты (CHCOOH) молярной концентрации 0,05 моль/дм(раствор Б)

В мерную колбу вместимостью 1 дм вносят 2,86 см ледяной уксусной кислоты, приливают около 300 см дистиллированной воды, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения раствора Б в закрытой стеклянной посуде при температуре 4°C - не более 1 мес.

6.3.2.3 Для приготовления ацетатного буферного раствора в колбе смешивают растворы уксуснокислого натрия (раствор А) и уксусной кислоты (раствор Б) в соотношении 2:1 для получения кислотности буферного раствора, равной 5,0 ед. pH. При необходимости кислотность раствора доводят до 5,0 ед. pH одним из исходных растворов.

Срок хранения буферного раствора в закрытой стеклянной посуде при температуре 4°C - не более 1 мес.

6.3.3 Приготовление раствора ди-Na-ЭДТА молярной концентрации 0,1 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 1 дм вносят (37,0±0,1) г ди-Na-ЭДТА, приливают 400-500 см дистиллированной воды, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения раствора ди-Na-ЭДТА в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°C - не более 1 мес.

6.3.4 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 1,0 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 1 дм вносят 85,7 см концентрированной соляной кислоты, приливают около 300 см дистиллированной воды, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения раствора соляной кислоты в закрытой стеклянной посуде при температуре 20°C - не более 1 мес.

6.3.5 Приготовление 0,8%-ного раствора пектина

Пектин, взятый с расчетом, чтобы 100 см раствора содержали 0,8 г чистого пектина в соответствии с ГОСТ Р 55298-2012 (приложение A), всыпают тонкой струей при непрерывном перемешивании в мерную колбу вместимостью 100 см, в которую предварительно наливают 25 см раствора ацетатного буфера молярной концентрации 0,05 моль/дм.

Раствор непрерывно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 мин до полного растворения пектина.

По истечении этого времени объем раствора доводят до 100 см раствором ацетатного буфера молярной концентрации 0,05 моль/дм, тщательно перемешивают и фильтруют через четыре слоя марли.

Срок хранения раствора пектина в холодильнике при температуре 4°C - не более двух суток.

     6.4 Подготовка пробы

Анализируемые пробы ферментных препаратов в сухом или жидком виде используют без предварительной подготовки.

6.4.1 Приготовление основного раствора анализируемой пробы ферментного препарата

В стаканчик для взвешивания шпателем помещают (0,1000±0,0002) г сухого ферментного препарата для получения анализируемой пробы. (1,00±0,02) смжидкого ферментного препарата вносят в другой стаканчик пипеткой. Полученную пробу ферментного препарата суспендируют в стеклянном бюксе с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят объем до метки дистиллированной водой при температуре 20°C и тщательно перемешивают. Приготовленный раствор ферментного препарата является основным раствором анализируемой пробы.

Срок хранения основного раствора ферментного препарата при температуре 20°C - не более 1 ч.

6.4.2 Приготовление рабочего раствора анализируемой пробы ферментного препарата

Рабочий раствор анализируемого ферментного препарата готовят из основного раствора по 6.4.1 путем дальнейшего разведения его дистиллированной водой в зависимости от предполагаемой активности таким образом, чтобы при ее определении показания оптической плотности спектрофотометра были в пределах от 0,10 до 0,35 нм.

С учетом разведения рассчитывают количество препарата, взятого на анализ.

Каждую пробу анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии в требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-2.

Раствор готовят в день определения. Срок хранения рабочего раствора ферментного препарата - не более 1 ч с момента приготовления во избежание потерь его ферментативной активности.

     6.5 Проведение определений

Перед началом определения активности готовят реакционную смесь путем смешивания в строгой последовательности трех растворов:

0,8%-ный раствор пектина + раствор ацетатного буфера молярной концентрацией 0,05 моль/дм + раствор ди-Na-ЭДТА молярной концентрацией 0,1 моль/дмв соотношении 5:2:1 по объему.

В опытную пробирку наливают 9 см реакционной смеси и прогревают на водяной бане в течение 5 мин при температуре 40°С. В прогретую реакционную смесь добавляют 1 см раствора ферментного препарата и инкубируют 10 мин на водяной бане строго по секундомеру при температуре 40°С. Через 10 мин останавливают реакцию добавлением 0,1 см раствора соляной кислоты молярной концентрации 1,0 моль/дм.

В контрольную пробирку, содержащую 0,1 см раствора соляной кислоты молярной концентрации 1,0 моль/дм, приливают 1 см раствора ферментного препарата и 9 см реакционной смеси, содержимое тщательно перемешивают.

Оптическую плотность опытного раствора измеряют против контрольного раствора на спектрофотометре в термостатируемых кварцевых кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 1 см при длине волны 232 нм.

     6.6 Обработка результатов

Пектин-лиазную активность (пектин-лС) в анализируемой пробе ферментного препарата вычисляют по формулам:

- для сухого препарата в ед. пектин-лС/г

,                                           (6)

где - оптическая плотность опытного раствора;

10 - разведение реакционной смеси;

- время реакции, 0,25 ч;

- концентрация препарата в реакционной смеси, %;

0,1 - условное увеличение оптической плотности в течение часа;

- для жидкого препарата в ед. пектин-лС/см

,                                                (7)

где - плотность для концентрированных жидких ферментных препаратов по ГОСТ 18481, г/см.

Оптическая плотность должна быть в пределах от 0,10 до 0,35 нм.

Если полученный результат определения выше верхнего предела диапазона измерений, то результат измерений представляют в виде: пектин-лиазная активность выше 100 ед. пектин-лС/г (100 ед. пектин-лС/см), допускается разведение дистиллированной водой при температуре 20°C до значений, находящихся в пределах допустимых показаний прибора.

6.6.1 Оформление результатов определений - по 5.6.1.

6.7 Сходимость и воспроизводимость результатов - по 5.7 (только для пектин-лиазной активности).

     7 Требования безопасности

     7.1 Условия безопасности проведения работ

При выполнении определений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 и ГОСТ 12.4.103.

Помещение, где проводят работы с реактивами, должно быть оснащено приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021.

Электробезопасность при работе с электроустановками - по ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 12.1.019.

Организация обучения работающих безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

     7.2 Требования к квалификации операторов

К проведению определений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже среднего технического образования, владеющие навыками работы в лаборатории, проведения определений и изучившие инструкции по эксплуатации используемой аппаратуры.

Библиография

                        

______________          

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.